Однокоренные слова мышь: Страница не найдена 404

Итальянизация наречий

Любезно , медленно , здесь , часто и очень — все это примеры наречий. Наречия изменяют глаголы, прилагательные или другие наречия. Под изменить мы подразумеваем добавление или изменение значения слова.

В следующих примерах наречие выделено жирным шрифтом , а глагол, который оно изменяет, выделено курсивом .

• Джон говорит громко .(Как говорит Джон?)
• Потом она выкурила сигарету. (Когда она курила?)
• Мэри живет локально . (Где живет Мэри?)

Но наречия также могут изменять прилагательные. Посмотрите на эти примеры:

Изменить прилагательное:

• Он действительно красивый . (Насколько он красив?)
• Это было чрезвычайно любезно с вашей стороны.

Изменить другое наречие:

• Она водит невероятно медленно .(Как медленно она ездит?)
• Он водит чрезвычайно быстро .

Теперь, когда мы знаем, что такое наречие, давайте рассмотрим следующий набор правил.

Правило 17: Наречия в английском языке, оканчивающиеся на

Вот несколько примеров:

• вероятно – вероятно
• возможно – возможно

По мере того, как вы пополняете свой словарный запас и еще не знаете слово для чего-либо, вы можете итальянизировать английское слово, используя эти 17 правил.Конечно, есть некоторые исключения из этих правил, но вы будете удивлены, как часто они применяются! Как и во всем, вы учитесь на собственном опыте. Какое правило/какие правила удивили вас больше всего? Позвольте мне знать в комментариях ниже.

Понравился этот урок? Вы новичок или уже изучаете итальянский? Предстоит поездка или вы хотите пообщаться со своим итальянским партнером или родственниками на итальянском языке? Учи итальянский по моей уникальной методике 80/20

Открыта регистрация для присоединиться к Intrepid Italian, к моей новой серии онлайн-видеокурсов, в которых используется мой уникальный метод 80/20.Вы пройдете путь от застенчивого, сбитого с толку новичка до опытного и уверенного в себе оратора среднего уровня, а я буду вашим верным проводником.

Наконец-то вы сможете связаться со своим итальянским партнером, поговорить с родственниками и насладиться подлинными впечатлениями от путешествий по Италии, о которых вы всегда мечтали, и многое другое.

Как носитель английского языка, выучивший итальянский во взрослом возрасте, я знаю, каково это чувствовать себя безнадежным и неуверенным в себе, чтобы говорить. Я знаю, каково это начинать с нуля и даже вернуться к абсолютным основам и узнать, что такое глагол!

Intrepid Italian был создан с мыслью о ВАС.Я использую свои практические знания английского языка, чтобы помочь вам войти в «итальянское мышление», чтобы вы могли избежать распространенных ловушек и ошибок, которые допускают носители английского языка — потому что я тоже когда-то их делал! Я разбиваю все таким образом, чтобы это «щелкало» и имело смысл.

Независимо от вашего уровня, для вас есть курс итальянского языка Intrepid, включающий:

Вы можете присоединиться к 1, 2 или всем 3 курсам, решать только вам. Самое приятное то, что у вас есть пожизненный доступ, поэтому вы можете учиться в любое время, в любом месте и на любом устройстве.

В качестве вашего проводника я проведу вас через каждый урок, шаг за шагом, используя мой уникальный метод 80/20. Мой подход отличается от традиционных методов, потому что я с самого начала учу вас самым важным 20% языка, чтобы вы сразу могли начать говорить.

Каждый курс включает в себя видеоуроки, аудиоупражнения, загружаемые рабочие листы, бонусные руководства, частное сообщество поддержки и пожизненный доступ — все это предназначено для упрощения обучения и развлечения.

Он даже поставляется с моим знаменитым « Празднуйте с гарантией Spritz» .После 30 дней использования Intrepid Italian, если вы не хотите отмечать свои новообретенные навыки итальянского с помощью Aperol Spritz, вам не нужно платить ни копейки! Ваше здоровье! 🥂
Присоединяйтесь к Intrepid Italian здесь и начните учить уже сегодня!
Ci vediamo lì! (До встречи!)

Учить итальянский? Ознакомьтесь с этими справочниками по итальянскому языку

Нравится? Закрепите это на потом!

Было ли это руководство полезным для вас? Есть вопрос? Дайте мне знать, используя раздел комментариев ниже, или присоединяйтесь ко мне в социальных сетях @intrepidguide или @intrepiditalian , чтобы начать разговор.

Спасибо за прочтение. Надеюсь, вам понравился этот пост.

Нравится то, что вы видите? Подпишитесь, используя форму ниже, чтобы все мои сообщения доставлялись прямо на вашу электронную почту.

Концентрация CD8+ Т-клеток определяет их эффективность в уничтожении родственных антиген-экспрессирующих сингенных клеток млекопитающих in vitro и в тканях мыши | Журнал экспериментальной медицины

Представленные здесь результаты имеют очевидное значение для клеточной иммунотерапии меланомы и, возможно, других опухолей.Клеточная иммунотерапия приводит к объективной регрессии меланомы более чем у 50% пациентов, но излечивает очень небольшой процент из них (Dudley et al., 2002; Dudley and Rosenberg, 2003). В этой статье предлагается по крайней мере одна причина такого разрыва между реакцией и излечением: это неспособность доставлять и поддерживать достаточную внутриопухолевую концентрацию специфичных к опухолевому антигену CD8 ⁺ Т-клеток/мл опухоли в течение периода времени, достаточного для уничтожения 100 % клоногенных опухолевых клеток (рис. 5 и 7). Исследования, о которых сообщается в этой статье, предоставляют количественную информацию об этих параметрах.Они показывают, что концентрация ≥10 ⁷ активированных клеток OT-1/мл необходима для уничтожения 100% клеток SIINFEKL-B16/мл коллагеново-фибринового геля за 7 дней (рис. 5). В этих гелях цитолиз клеток-мишеней зависит только от концентрации Т-клеток CD8 ⁺ (рис. 2, 5 и 7). Соответственно, если предположить, что меланомы содержат 3 × 10 ⁸ клеток меланомы/мл или/г опухоли (Stephens and Peacock, 1978), и что антиген-специфические CD8 ⁺ Т-клетки меланомы убивают клетки меланомы in vivo с той же скоростью, что и клетки ОТ-1, использованные в экспериментах, показанных на рис.5, доставка и поддержание ≥10 ⁷ меланомных антиген-специфических CD8 ⁺ Т-клеток/г меланомы в течение ≥8 дней должно привести к эрадикации меланомы. Однако наш анализ результатов Petersen et al. (2006; рис. 7 и таблица S4) показывает, что клетки OT-1 убивают клетки ova-B16 примерно в девять раз ниже ( k ) и имеют примерно в восемь раз более высокий CTC в опухолях in vivo, чем в коллагеново-фибриновых гелях. В этих условиях для эрадикации опухоли потребуется доставка и поддержание ≥10 ⁸ меланомных антиген-специфических CD8 ⁺ Т-клеток/мл или/г меланомы в течение ≥8 дней.Это очень высокий порог, который не сулит успеха в клеточной иммунотерапии рака. Тем не менее, в небольшом числе случаев было показано, что клеточная иммунотерапия является излечивающей (Dudley et al., 2002), предполагая, что in vivo существуют другие факторы, которые при определенных обстоятельствах способствуют эффективности антиген-специфических CD8 ⁺ Т-клетки. Мы опишем четыре из этих факторов в следующем параграфе.

Во-первых, наши расчеты относительно концентрации специфичных к опухолевому антигену CD8 ⁺ Т-клеток, которые должны накапливаться в ложе опухоли для эрадикации опухоли, предполагают, что эти CD8 ⁺ Т-клетки являются единственными цитолитическими эффекторами.Однако присутствие активированных опухолевых антиген-специфических CD8 ⁺ Т-клеток в ложе опухоли может способствовать накоплению и уничтожению опухолевых клеток другими цитолитическими эффекторными клетками (например, NK-клетками и активированными макрофагами). В этих условиях CD8 ⁺ Т-клетки могут быть только одной из нескольких цитолитически активных эффекторных клеток, работающих в опухоли. Следовательно, наши расчеты могут недооценивать общую цитоцидную активность всех эффекторных лейкоцитов, которые собираются в опухоли в ответ на сигналы, инициированные опухолевыми антиген-специфическими CD8 ⁺ Т-клетками и/или цитолизом опухолевых клеток.Во-вторых, наши расчеты предполагают, что уничтожение опухолевых клеток клонами CD8 ⁺ Т-клеток, TCR которых распознают разные опухолевые антигены, является просто аддитивным. Возможно, он мультипликативен. Если да, то наличие внутри опухоли 3 × 10 ⁶ CD8 ⁺ Т-клеток по сравнению с предполагаемым опухолевым антигеном А, 3 × 10 ⁶ CD8 ⁺ Т-клеток по сравнению с предполагаемым опухолевым антигеном В и 3 × 10 ⁶ CD8 ⁺ Т-клетки по сравнению с предполагаемым опухолевым антигеном С могут привести к 27-кратному увеличению гибели опухолевых клеток. В-третьих, наши расчеты предполагают, что все Т-клетки CD8 ⁺ убивают с той же эффективностью, что и клетки ОТ-1. CD8 ⁺ Т-клетки сильно различаются по своей эффективности уничтожения (Stuge, et al., 2004). Соответственно, возможно получить популяции Т-клеток CD8 ⁺ , которые убивают с более высокой скоростью, чем наблюдаемая для клеток ОТ-1. Действительно, мы определили протоколы активации клеток OT-1, которые более чем удваивают свою эффективность в уничтожении клеток SIINFEKL-B16 в коллагеново-фибриновых гелях (неопубликованные данные).В-четвертых, мы предположили, что опухолевая сосудистая сеть всех меланом одинаково эффективна в доставке CD8 ⁺ Т-клеток в паренхиму опухоли. Буканович и др. (2008) показали, что эффективность этого процесса можно повысить более чем в 10 раз. По всем изложенным здесь причинам важно определить эффективность проникновения ex vivo размноженных CD8 ⁺ Т-клеток в ложе опухоли, время их пребывания в ложе опухоли и их цитолитическую активность как в идеальных условиях (т. g., коллагеново-фибриновые гели) и в условиях in vivo.

Исследования, о которых сообщается в этой статье, определяют три параметра, которые представляются особенно важными для понимания терапевтического потенциала клеточной иммунотерапии. Во-первых, это концентрация всех цитолитических эффекторных клеток, доставленных в опухоль и активных внутри нее. Во-вторых, эффективность уничтожения ( k ) всех эффекторных клеток по отдельности и в комбинации в ложе опухоли.В-третьих, это продолжительность времени, в течение которого каждая из этих эффекторных клеток остается цитолитически активной в ложе опухоли. Информация об этих параметрах позволит исследователям оценить, является ли высокая частота объективной регрессии опухоли, но низкая частота излечения, наблюдаемая у пациентов с меланомой, получавших ex vivo-активированные CD8 ⁺ Т-клетки, следствием доставки недостаточного количества опухолевых антиген-специфических CD8 ⁺ Т-клеток к опухолям для повышения внутриопухолевой концентрации в 30 раз выше ЦОК (рис. 5), или вредного воздействия окружения опухоли на жизнеспособность и/или эффекторные функции CD8 ⁺ Т-клеток. Текущие исследования показывают, что система коллаген-фибриновый гель, описанная в этой статье, также полезна для оценки уничтожения клонированными опухолевыми антиген-специфичными CD8 ⁺ Т-клетками человека клеток меланомы человека, экспрессирующих родственный антиген (неопубликованные данные).

антитело к HSC80 | Родственный белок 80 Monoclonal Antibody-NP_001234439 мыши против вишневого теплового шока.1

Комплекс нового ингибитора протеаз, гомолога овостатина, с родственными ему протеазами в просветной жидкости матки неполовозрелых мышей глутатион (GSH), тритон X-100, желатин, коллаген плаценты человека IV типа, коллаген I типа бычьей кожи, мышиный альбумин, 1-10-фенантролин, йодацетамид, пепстатин, безамидин, химостатин и лейпептин были приобретены у Sigma-Aldrich (St. .Луис, Миссури, США). Sephacryl S-400, DEAE-Sepharose, глутатион-сефароза 4B, CNBr-активированная Sepharose 4B, мембрана из поливинилидендифторида (PVDF) и pGEX-4T-1 были заказаны в GE Healthcare Life Sciences (Piscataway, NJ, USA). Рестриктазы

Заявление об этике

Самки новозеландских белых кроликов были приобретены в Научно-исследовательском институте животноводства Совета по сельскому хозяйству (Тайнань, Тайвань).Процедуры ухода, содержания и экспериментов с кроликами и мышами были рассмотрены и одобрены Комитетом Института по уходу и использованию животных (IACUC) Университета Фуинь. Животных содержали в соответствии с институциональными рекомендациями по уходу и использованию экспериментальных животных.

Подготовка неполовозрелых мышей ULF

Неполовозрелым самкам мышей ICR (возраст 21 день) вводили подкожно суточную дозу DES (1 мкг), растворенного в кукурузном масле, соответственно, в течение четырех дней подряд.Мышей забивали на 25-й день возраста. Затем из просвета матки мышей собирали УНЧ. Раствор УНЧ, содержащий 2 мМ ЭДТА, центрифугировали при 10000× г в течение 2 мин для удаления нерастворимых компонентов, а затем хранили при –70°С до дальнейшего анализа.

Зимография субстрата

Обозначенные образцы смешивали с невосстанавливающим буфером для загрузки образцов, а затем подвергали SDS-PAGE анализу с 12% полиакриламидными гелями, содержащими желатин (2 мг/мл), человеческий плацентарный коллаген IV типа (1 мг/мл ), или коллаген I типа бычьей кожи (1 мг/мл).После электрофореза срезы геля промывали буфером (0,1 М Трис-HCl, рН 7,4, содержащий 2,5% Тритона Х-100) два раза при комнатной температуре по 18 минут, а затем инкубировали в 0,1 М Трис-HCl (рН 7,4). при 37 °С. После инкубации в течение ночи гели окрашивали кумасси бриллиантовым синим в течение 20 минут с последующим обесцвечиванием в 10% растворе уксусной кислоты. Очищенные гели сканировали фотосканером HP Scanjet G3010. Желатинолитическую активность определяли по светлым зонам, указывающим на деградацию субстрата, и количественно определяли путем измерения интенсивности площади указанной полосы за вычетом идентичной фоновой интенсивности той же дорожки с использованием программного обеспечения ImageJ.

Выделение белков

1 мл УЛФ фракционировали методом гель-фильтрационной хроматографии на колонке с сефакрилом S-400 (15 мм × 100 см), проявляли буфером PBS, содержащим 2 мМ ЭДТА, со скоростью потока 0,2 мл/мин на холоду. номер. Каждую фракцию собирали по 3,2 мл. Аликвоты (0,3 мл) указанных фракций диализовали против воды, лиофилизировали и наносили на желатиновую зимографию для определения активности. Объединенные фракции (140 мл), содержащие желатинолитический фермент 26 кДа, собранные при хроматографии на Сефакриле S-400, диализовали, лиофилизировали, затем растворяли в 20 мл уравновешенного буфера А (5 мМ фосфатный буфер, содержащий 2 мМ ЭДТА при рН 7.4) и загружали в колонку с ДЭАЭ-Сефарозой (15 мм × 2 см). После промывки десятью объемами буфера А колонку обрабатывали линейным градиентом от 75 мл буфера А до 75 мл буфера А плюс 0,4 М NaCl. Каждая фракция собирала 3,6 мл. 0,25 мл, взятые из указанных фракций, диализовали, лиофилизировали, а затем подвергали желатиновой зимографии для определения активности. Фракции, содержащие желатинолитический фермент 26 кДа, объединяли, подвергали диализу против воды для удаления избытка реагентов, лиофилизировали и использовали в качестве антигена для получения кроличьих антител против mOH.

Масс-спектрометрия

Очищенный желатинолитический ферментный комплекс анализировали с помощью SDS-PAGE, а затем окрашивали кумасси бриллиантовым синим. Назначенные полосы вырезали из геля, расщепляли трипсином и анализировали жидкостной хроматографией-ионизацией электрораспылением в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (ЖХ-МС/МС) соответственно.

Экспрессия и очистка слитого белка GST-mOH[870–940]

кДНК частичной последовательности mOH (остатки 870–940 аминокислот) амплифицировали из маток неполовозрелых мышей, получавших DES, с помощью ОТ-ПЦР с использованием праймеров ( 5′-CTC GGA TCC ACT GTA GTG GCT ACA TCC-3′ и 5′-CTC GAA TTC TCA ACC TTC TAC TAC ATT GCT -3′).Полученный продукт расщепляли с помощью Bam HI/ Eco RI и субклонировали в pGEX 4T-1 с получением вектора pGEX 4T-1-mOH [870–940]. штаммов E. coli BL21 (DE 3), содержащих вектор pGEX-4T-1-mOH[870–940], выращивали в 1 л бульона Луриа-Бертани (LB), содержащего ампициллин (100 мкг/мл), при 37 °C. Пока поглощение при 600 нм не достигло приблизительно 0,4, для индукции экспрессии белка добавляли изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (конечная концентрация 0,4 мМ). Через четыре часа бактерии собирали центрифугированием при 6000 ×  г в течение 15 минут.Клетки в осадке ресуспендировали в буфере (PBS, содержащем 1 мкг/мл лизоцима, 2 мМ EDTA и 1 мМ PMSF), инкубировали в течение 1 часа при 37  °C, а затем разрывали тремя циклами замораживания и оттаивания. Лизат обрабатывали ДНКазой I (1 мкг/мл) в течение 30 мин при 37°С с последующим центрифугированием при 6000× г при 4°С в течение 30 мин. Супернатант загружали в колонку, заполненную смолой Glutathione Sepharose 4B. Несвязавшиеся белки удаляли промыванием PBS. Слитый белок GST-mOH[870–940] элюировали PBS, содержащим 10 мМ GSH.Элюат подвергали диализу против воды для удаления избытка реагентов, лиофилизировали и хранили для получения антитела mOH[870–940]. Антитело GST-mOH[870–940] распознает только восстановленную форму mOH.

Получение очищенного mOH-антитела (POHA)

ULF очищали гель-фильтрацией с использованием колонки Sephacryl S-400 (15 мм × 100 см), разработанной PBS. Каждая фракция собирала 3,2 мл. Основные белки mCLCA3, mOH и C3 в УНЧ элюировали и собирали во фракциях 26–30, 32–35 и 38–40 соответственно.Фракции, содержащие mCLAC3, mOH и C3, объединяли соответственно, подвергали диализу против дистиллированной воды и лиофилизировали. МОН, очищенный от УНЧ (15 мл) с использованием хроматографов Sephacryl S-400 и DEAE-Sepharose, конъюгировали с 1,0 мл гранул CNBr-активированной сефарозы в соответствии с инструкциями производителя. Этот очищенный mOH также содержит C3, альбумин и mCLCA3. Таким образом, анти-С3, анти-альбумин и анти-mCLAC3 антитела в антителах, выращенных с помощью mOH, удаляли путем абсорбции гранулами сефарозы, конъюгированными с С3, альбумином и mCLCA3.По одному миллиграмму С3, mCLCA3 и мышиного альбумина конъюгировали с 1,5 мл гранул сефарозы, активированной CNBr, в соответствии с инструкциями производителя. Кроличье антитело против mOH (0,5 мл) применяли для аффинной хроматографии на колонке, заполненной шариками, конъюгированными с mOH. После нескольких промывок антитело элюировали 0,1 М раствором глицина (рН 3) и немедленно нейтрализовали добавлением 1 М трис-HCl (рН 8). Элюированные пулы (6,0 мл) затем инкубировали с абсорбированными гранулами в течение 1 часа.6,0 мл очищенного антитела mOH (POHA) собирали из несвязанного раствора для элюирования и затем хранили при -70 °C. POHA может распознавать нативную форму mOH в нашем анализе.

Вестерн-блоттинг

Обозначенные образцы разделяли с помощью SDS-PAGE с полиакриламидным гелем с линейным градиентом (4–15%), с последующим электроблоттингом на мембране PVDF, зондировали POHA (250  мкл), мОН [870–940 ] антисыворотка (разведение 1:2000) или антитело mCLCA 3 (разведение 1:2000).

Анализ совместного фракционирования

1 мл ULF фракционировали с помощью хроматографии на сефакриле S-400, как описано выше.Аликвоты (0,30 мл) указанных фракций (21–47) из гель-фильтрационной хроматографии разделяли с помощью SDS-PAGE, а затем применяли для вестерн-блоттинга, определяли невосстановленный mOH с использованием POHA или восстановленный mCLCA3 с использованием кроличьих антител mCLCA 3. Кроме того, идентичные образцы подвергали желатиновой зимографии для обнаружения желатинолитических ферментов.

Ко-иммунопреципитационный анализ

Аликвоту (60 мкл) гранул протеина А-Сефарозы инкубировали либо с 5 мкг преиммунного антитела (PIA), либо с 5 мкл POHA, вращали при комнатной температуре в течение одного часа, а затем промывали 0.1 мл PBS три раза. Ко всем компонентам добавляли 30 мкл УНЧ и затем вращали при комнатной температуре в течение одного часа. Гранулы трижды промывали 0,1 мл PBS с последующим центрифугированием. Осажденные белки повторно суспендировали с двумя объемами буфера для загрузки геля SDS (30 мкл). Затем аликвоты (6 мкл) иммунопреципитированных белков подвергали желатиновой зимографии.

Анализ ингибирования

Аликвоту (0,3 мл) комплекса желатинолитических ферментов, выделенного из хроматографии Sephacryl S-400, анализировали методом зимографии желатина в присутствии различных белковых ингибиторов, включая 1–10-фенантролин (1 мМ), йодацетамид (0 .1 мМ), пепстатин (20 мкМ), безамидин (2 мМ), химостатин (100 мкМ) или лейпептин (100 мкМ).

Определение оптимального рН для активности желатинолитических ферментов

Частично очищенный комплекс желатинолитических ферментов, полученный хроматографией на Сефакриле S-400, подвергали желатинзимографии. Каждую дорожку геля вырезали и промывали буфером (0,1 М Трис-HCl, рН 7,4, содержащий 2,5% Тритон Х-100) два раза при комнатной температуре в течение 18 минут, а затем инкубировали в буферах с различными значениями рН соответственно.Буферы включали 0,1 М цитрата (рН 5,0 и 6,0), 0,1 М Трис (7,4 и 8,0) или 0,1 М глицина (рН 9,0, 10,0 и 10,5). После инкубации при 37°С в течение ночи нарезанные гели окрашивали кумасси бриллиантовым синим, а затем обесцвечивали 10% уксусной кислотой.

Анализ деградации коллагена типа I

6  мкг комплекса mOH-протеазы после очистки разделяли в 12% полиакриламидном геле с SDS в невосстанавливающих условиях. После электрофореза гель промывали буфером (0.1M Tris-HCl, pH 7,4, содержащий 2,5% Triton X-100) при комнатной температуре в течение 15 минут три раза для удаления SDS. Белковые полосы с кажущейся молекулярной массой 26 и 23/22 кДа соответственно вырезали, измельчали ​​и вращательно инкубировали со 100 мкл коллагена I типа (1 мг/мл). После инкубации в течение ночи при 37 °C аликвоты (8 мкл) супернатанта подвергали анализу с помощью SDS-PAGE с использованием полиакриламидного геля с линейным градиентом (4–15%).

Обратная транскрипция – полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР)

ОТ-ПЦР использовали для определения распределения в тканях транскриптов мРНК mOH у мышей.Панель мультитканевой мРНК мыши была получена от Clontech Laboratories, Inc. (Маунтин-Вью, Калифорния, США). Реакцию обратной транскрипции проводили по инструкции производителя (Invitrogen, Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США). Полученный продукт служил матрицей для ПЦР-амплификации транскрипта mOH с помощью праймеров (5′-GCT ACA CTG GAG CTC GTG AAA GC-3′ и 5′-GGT GCT TGA TCA GGC TCT TGG TAG-3′). GAPDH амплифицировали параллельно с праймерами (5′-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3′ и 5′-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3′) и служили внутренним контролем.

MP06-01 ИДЕНТИФИКАЦИЯ РОДСТВЕННЫХ ПРОКСИМАЛЬНЫХ ТИПОВ КЛЕТОК ПРОСТАТЫ МЫШИ И ЧЕЛОВЕКА И ИХ ОБОГАЩЕНИЕ ПРИ ДОБРОКАЧЕСТВЕННОЙ ГИПЕРПЛАЗИИ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЧЕЛОВЕКА

ВВЕДЕНИЕ И ЦЕЛЬ:

Доброкачественная гиперплазия предстательной железы (ДГПЖ) широко распространена у стареющих мужчин и представляет значительную бремя здравоохранения, связанное с лечением симптомов нижних мочевыводящих путей (СНМП). ДГПЖ/СНМП по-прежнему трудно поддаются лечению из-за фенотипической гетерогенности, в результате чего при необходимости хирургического вмешательства.Типы клеток, вызывающие рост ДГПЖ: Неизвестный. Анатомические исследования показали, что переходная зона, расположенная вблизи уретра является местом роста ДГПЖ. Ранее мы идентифицировали два новых типа клеток, булавой и бугорком, которые обогащаются в предстательной уретре и проксимальных протоках. Здесь, мы идентифицируем новый проксимальный фибробласт у человека, а также родственный бугорковый эпителий и проксимальные фибробласты у мышей. Мы оцениваем вклад каждого проксимального тип клеток при ДГПЖ человека, установив новую парадигму эпителия уретры и проксимальных фибробласты в дискретных фенотипах ДГПЖ.

МЕТОДЫ:

Мы использовали беспристрастный подход с помощью секвенирования РНК отдельных клеток (scRNA-seq) для идентификации родственные типы клеток предстательной железы мыши и человека и разработать новую проточную цитометрию и IHC панели антител для очистки и локализации каждого типа клеток. Частота проксимальных фибробласты и уретральный эпителий при ДГПЖ по сравнению с нормальной простатой человека оценивали с помощью scRNA-seq, проточная цитометрия и иммунофлуоресценция.

РЕЗУЛЬТАТОВ:

Бугорчатые и булавовидные клетки устанавливаются рано, и эти клетки распространяются в проксимальные протоки переходной зоны предстательной железы взрослого человека.Проксимальные фибробласты окружают мочеиспускательный канал и проксимальные протоки. У пациентов с ДГПЖ увеличены булавовидные и бугорчатые клетки. внутри железистых узелков по сравнению с нормальной тканью предстательной железы и проксимальными фибробластами увеличиваются в зонах периуретрального фиброза. Данные scRNA-seq и IHC мыши подтверждены наличие родственных проксимальных фибробластов и бугоркового эпителия, но булавовидных клеток не были найдены.

ВЫВОДЫ:

Наши результаты показывают, что булавовидный эпителий уретры и проксимальных протоков образуются до зачатия предстательной железы и обогащены железистыми узелками ДГПЖ, предполагая потенциальное клеточное происхождение нового роста простаты.Мы также выявляем проксимальный фибробласт человека как клеточный источник отложения коллагена в фиброз предстательной железы, создающий новый фенотип для пациентов с СНМП. Мы создали клеточный атлас уретры и проксимального отдела предстательной железы мышей, который позволит для создания специализированных моделей мышей для отслеживания уретральных и проксимальных фибробластов родословная. Типы клеток проксимальных протоков могут стать новыми мишенями для лечение ДГПЖ/СНМП.

Источник финансирования:

R01 ДК115477

Нейропептид S способствует обонятельной функции мышей за счет активации экспрессирующих родственные рецепторы нейронов в обонятельной коре

Abstract

Нейропептид S (НПС) представляет собой недавно обнаруженный нейромодулятор, расположенный в стволе головного мозга и регулирующий различные биологические функции путем избирательной активации рецепторов НПВ (НПСР). Высокий уровень экспрессии мРНК NPSR в обонятельной коре предполагает, что система NPS-NPSR может участвовать в регуляции обонятельной функции.Настоящее исследование было предпринято для изучения влияния интрацеребровентрикулярной (i.c.v.) инъекции НПВ или совместной инъекции антагониста NPSR на обонятельное поведение, потребление пищи и экспрессию c-Fos в обонятельной коре у мышей. Кроме того, двойная иммунофлуоресценция использовалась для идентификации NPS-индуцированных Fos-иммунореактивных (-ir) нейронов, которые также несут NPSR. НПВ (0,1–1 нмоль) в.ц.в. инъекция значительно уменьшила латентный период для поиска закопанной пищи и увеличила обонятельную дифференциацию различных запахов и общее время, затрачиваемое на обнюхивание в задачах обонятельного привыкания / избавления от привычки.НПС больше всего улучшал обонятельную способность в дозе 0,5 нмоль, которую можно было заблокировать совместным введением 40 нмоль антагониста НПСР [D-Val ⁵ ]НПС. Введение НПВ дозозависимо ингибировало потребление пищи голодающими мышами. Иммуногистохимия ex-vivo c-Fos и NPSR в обонятельной коре показала, что по сравнению с мышами, получавшими носитель, NPS заметно усиливал экспрессию c-Fos в переднем обонятельном ядре (AON), грушевидной коре (Pir), вентральной тени. tecta (VTT), переднее корковое миндалевидное ядро ​​(ACo) и латеральная энторинальная кора (LEnt).Процент нейронов Fos-ir, которые также экспрессируют NPSR, составил 88,5% и 98,1% в AON и Pir соответственно. Настоящие результаты показали, что NPS посредством избирательной активации нейронов, несущих NPSR в обонятельной коре, облегчает обонятельную функцию у мышей.

Образец цитирования: Shao Y-F, Zhao P, Dong C-Y, Li J, Kong X-P, Wang H-L, et al. (2013) Нейропептид S облегчает обонятельную функцию мышей за счет активации нейронов, экспрессирующих родственные рецепторы, в обонятельной коре.ПЛОС ОДИН 8(4): е62089. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0062089

Редактор: Пранела Рамешвар, Университет медицины и стоматологии Нью-Джерси, США

Получено: 30 января 2013 г.; Принято: 16 марта 2013 г.; Опубликовано: 16 апреля 2013 г.

Авторское право: © 2013 Shao, et al. Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Работа выполнена при поддержке грантов Национального фонда естественных наук Китая (№ 81171254, 81071076 и 30670677), а также гранта Ключевой национальной научно-технической программы «Крупная разработка новых лекарств» Министерства науки и Технология Китая (2009ZX09503-017). Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Нейропептид S (НПС) — недавно обнаруженный нейромодулятор, расположенный в стволе головного мозга. NPS избирательно связывается с высоким сродством к рецепторам, связанным с белками Gs и Gq, ранее идентифицированными как GPR 154 и теперь обозначаемыми как NPSR, вызывая мобилизацию внутриклеточного Ca ²⁺ и повышая уровни цАМФ [1]. мРНК предшественника NPS у крыс экспрессируется в группе нейронов, расположенных между голубым пятном (LC) и ядром Баррингтона, главным сенсорным ядром тройничного нерва и латеральным парабрахиальным ядром [1].У мышей мРНК предшественника NPS экспрессируется только в ядре Kölliker-Fuse и перикоэррулярной области ствола мозга [2]. Напротив, мРНК NPSR широко распространена в мозге крыс и мышей, в основном в обонятельной коре, коре головного мозга, таламусе, гипоталамусе, миндалевидном теле и субкулуме [1]–[4].

Этот профиль экспрессии мРНК NPSR предполагает участие системы NPS-NPSR в регуляции множества центральных функций. Действительно, активация НПСР при центральном введении НПВ усиливает двигательную и исследовательскую активность, вызывает анксиолитические эффекты у мышей [1], [5], [6] и способствует бодрствованию у крыс [1], [7].NPS также участвует в антиноцицепции [8], [9], выражении и угасании страха [10] и процессах памяти у мышей [11], [12], а также способствует рецидиву поиска кокаина у крыс [13].

NPS-NPSR предлагается как недавно идентифицированная система регуляции обоняния, участвующая в регуляции обонятельного восприятия и/или интеграции обонятельной или феромонной информации [3], поскольку высокие уровни экспрессии мРНК NPSR были обнаружены во многих областях обонятельной коры. включая переднее обонятельное ядро ​​(AON), грушевидную кору (Pir), tenia tecta (TT), а также переднее корковое миндалевидное ядро ​​(ACo) и латеральную энторинальную кору (LEnt) у мышей [2].Эти области обонятельной коры непосредственно получают синаптический вход от обонятельной луковицы [14], [15] и, по-видимому, играют решающую роль в переводе характеристик вдыхаемых молекул в насыщенные, вызывающие эмоции и память окрашенные восприятия, называемые запахами [15]. ]. Однако неизвестно, как система NPS-NPSR регулирует обонятельное поведение.

Настоящее исследование было разработано для наблюдения за влиянием системы NPS-NPSR на обонятельную функцию у мышей после интрацеребровентрикулярной инъекции (т.в.) инъекции. Обонятельные способности у мышей оценивали с помощью теста зарытой пищи (для оценки способности обнаруживать летучие запахи) и теста обонятельного привыкания/отторжения (для оценки способности обнаруживать и различать одинаковые и разные запахи). Тест на потребление пищи использовали для выяснения взаимосвязи между обонянием и приемом пищи у мышей после i.c.v. администрация НПС. Для дальнейшей идентификации потенциальных нейронных мишеней NPS в обонятельной коре NPS-индуцированные Fos-иммунореактивные (-ir) нейроны были проанализированы с использованием иммуногистохимии ex vivo , а наличие NPSR в этих нейронах было исследовано с помощью двойной иммунофлуоресцентной микроскопии.

Материалы и методы

Животные и хирургическая имплантация

взрослых самца мышей C57BL/6J (возраст 6 недель) были приобретены в Центре экспериментальных животных Университета Ланьчжоу (Ланьчжоу, КНР). Их содержали при температуре окружающей среды (22±1°C) и относительной влажности 50% при автоматически регулируемом цикле свет/темнота 12:12 (свет включен с 8:00 до 20:00, интенсивность освещения ≈ 100 лк). Еда и вода были доступны вволю за исключением периода голодания.Каждое животное использовали только один раз для межгрупповых сравнений в тесте на зарытую пищу, в тесте на привыкание и отвыкание от обоняния и в тесте на потребление пищи. За всеми животными ухаживали, и эксперименты проводились в соответствии с рекомендациями Европейского сообщества по использованию экспериментальных животных (86/609/EEC). Экспериментальный протокол был одобрен Комитетом по этике Университета Ланьчжоу (номер разрешения: SCXK Gan 2009–0004).

Под наркозом хлоралгидратом (350 мг/кг, т.е.р.), мышей помещали в стереотаксический аппарат. Направляющую канюлю из нержавеющей стали (калибр 25) стереотаксически имплантировали над правым боковым желудочком (AP -0,2 мм, ML +1,0 мм, DV -1,4 мм, согласно атласам Paxinos and Franklin, 2001 [16]) для и.к.в. инъекция. Канюля хронически фиксировалась к черепу стоматологическим цементом. В направляющую канюлю вставляли постоянный стилет из нержавеющей стали (размер 32) для предотвращения окклюзии.

Администрации лекарственных средств

NPS (мышь, Ser-Phe-Arg-Asn-Gly-Val-Gly-Ser-Gly-Ala-Lys-Lys-Thr-Ser-Phe-Arg-Arg-Ala-Lys-Gln) и [D-Val ⁵ ]НПВ (человек, Ser-Phe-Arg-Asn-D-Val-Val-Gly-Thr-Gly-Met-Lys-Lys-Thr-Ser-Phe-Gln-Arg-Ala-Lys-Ser) , подарки от проф.Rui Wang, были синтезированы на кафедре биохимии и молекулярной биологии Школы наук о жизни Ланьчжоуского университета [7], [9], [17]. Свежий НПС (0,1-1 нмоль) и НПС (0,5 нмоль) + [D-Val ⁵ ]НПС (20 или 40 нмоль) растворяли в 1 мкл физиологического раствора. Препараты и носитель (физиологический раствор) вводили через насаженную направляющую канюлю со скоростью потока 1 мкл/мин в 17:00 дня исследования.

По окончании эксперимента мышам вводили и.ц.в. через направляющую канюлю вводили по 1 мкл красителя метиленового синего и через 5 мин декапитировали под глубокой анестезией хлоралгидратом натрия.Мозги были удалены и заморожены. Макродиссекцию головного мозга использовали для проверки места введения лекарств или носителя. Использовались только данные по животным с дисперсией красителя через желудочек.

Тесты обонятельного поведения

Тест зарытой пищи.

Тест зарытой пищи проводили, как ранее описано Янгом и Кроули [18]. Вкратце, после 7 дней восстановления после операции мышей не кормили в течение 32 часов, начиная с 9:00, с доступной водой.В день тестирования каждая мышь получала i.c.v. инъекции носителя, НПВ или НПВ + [D-Val ⁵ ]НПВ, а затем помещали в испытательную камеру из плексигласа (46 см Д × 23,5 см Ш × 20 см В), содержащую чистые подстилки глубиной 3 см из свежестерилизованной и дезодорированной древесной щепы. После адаптации к окружающей среде в течение 15 минут мышь удаляли из камеры и гранулы корма для мышей (1,5 г, Beijing keaoxieli feedstuff Co. Ltd.) случайным образом закапывали на 1 см ниже поверхности подстилки. Затем мышь помещали обратно в камеру и измеряли время ожидания закопанной пищи.Латентный период определяли как время от момента помещения мыши в тестовую камеру до момента, когда она открывала и хватала пищу передними лапами и/или зубами [19]. После каждого опыта испытательные камеры промывали дистиллированной водой и высушивали на воздухе. Постельное белье меняли перед каждым испытанием. Животных записывали на видео, оценивали и анализировали исследователи, которые не знали о вводимых препаратах.

Тест на привыкание и отвыкание от обоняния.

Тест на привыкание и отвыкание от обоняния проводили в соответствии с предыдущим описанием Янга и Кроули [18].В день тестирования каждую мышь помещали в тестовую камеру (26 см Д × 12 см Ш × 12 см В), содержащую подстилку из чистой свежей древесной стружки толщиной 1 см, и адаптировали к условиям тестирования, в которых была чистая, Сухой аппликатор с ватным наконечником вводили на глубину 4 см через отверстие в крышке на 15 мин после внутривенного введения. инъекции наркотиков или транспортного средства. Обнюхивание определяли, когда мышь ориентировалась на кончик замененного аппликатора, впитанного дистиллированной водой, экстрактом миндаля (разведение 1:100, Supercook, Лидс, Великобритания) или экстрактом ванили (разведение 1:100, Supercook, Лидс, Великобритания). ) носом в пределах 2 см или ближе к кончику.Обнюхивание регистрировали в течение 2 минут в каждом испытании. Последовательность замены аппликатора: вода, вода, вода, миндаль, миндаль, миндаль, ваниль, ваниль и ваниль с интервалом в 1 мин. Привыкание определяется как прогрессивное уменьшение времени обонятельного обнюхивания в сторону повторного предъявления одного и того же запахового стимула и используется для оценки того, может ли животное различать один и тот же запах. Отказ от привычек определяется восстановлением обнюхивания при появлении нового запаха и используется для оценки того, может ли животное обнаружить другой запах [20]–[22].Испытательные камеры промывали дистиллированной водой и меняли подстилку перед каждым испытанием. Животных записывали на видео, и экспериментатор, не имевший отношения к лечению, анализировал поведение животных.

Тест приема пищи

Хорошо известно, что обоняние тесно связано с приемом пищи у млекопитающих, особенно у грызунов [23], [24]. Чтобы определить, влияет ли изменение обоняния после введения НПВ на прием пищи, количество потребляемой пищи было соответственно измерено как 0.5, 1, 2, 4 и 24 часа после центрального введения носителя (n = 10) или NPS (0,5 или 1 нмоль, n = 9 в каждой группе) у мышей, голодавших в течение 32 часов.

Иммуногистохимия

Подготовка ткани.

Через полтора часа после введения НПВ (0,5 нмоль, n = 4) или носителя 1 мкл (n = 5) в.ц.в. введения животных анестезировали избыточной дозой хлоралгидрата (400 мг/кг) и перфузировали через восходящую аорту 30 мл физиологического раствора, содержащего гепарин (1 ЕД/мл), а затем 4% параформальдегида в 0.1 М фосфатный буфер (ФБ). Мозг извлекали, затем фиксировали в том же фиксаторе в течение ночи и погружали в 30% раствор сахарозы в 0,1 М ФБ при 4°C на 36 ч и делали корональные срезы (30 мкм) на криостате (CM1900, Leica Micro-systems, Heidelberg). , Германия) при -20°C и срезы собирали в 0,01 М натрий-фосфатный буфер (PBS).

Фос иммуногистохимия.

Плавающие срезы промывали 0,01 М раствором PBS (pH 7,4), обрабатывали в течение 30 минут 0,3% H ₂ O ₂ в PBS и инкубировали в блокирующем растворе (10% бычьей сыворотки в PBS) в течение 1 часа.Затем срезы инкубировали с кроличьим поликлональным антителом против c-Fos (1∶5000, sc-253, Santa Cruz Biotechnology, Санта-Крус, Калифорния, США), разведенным в PBS, содержащем 1% бычьей сыворотки, в течение 48 ч при 4°C на агитатор. После промывания в PBS срезы инкубировали с биотинилированным козьим антикроличьим IgG (1∶1000, AP132B, Millipore, Темекула, Калифорния, США), а затем со стрептавидином, конъюгированным с пероксидазой хрена (1∶2000, SA202, Millipore, Темекула, Калифорния, США). США). Обе инкубации проводили на мешалке при 4°С в течение ночи.После промывания срезы погружали в 0,05 М трис-HCl-буфер, рН 7,6, содержащий 0,05% 3,3′-диаминобензидина (ДАБ), 0,01% H ₂ O ₂ и 0,6% сульфата аммония никеля для 2– 5 мин при комнатной температуре. Наконец, срезы помещали на покрытые желатином предметные стекла, обрабатывали контрастным окрашиванием нейтральным красным, сушили, обезвоживали и накрывали покровным стеклом с использованием DPX для световой микроскопии.

Двойная иммунофлуоресценция для Fos и NPSR.

Эти срезы инкубировали со смешанным раствором, содержащим кроличьи поликлональные антитела против c-Fos и козьи анти-NPSR (1∶1,000, sc-162893, Santa Cruz Biotechnology, Санта-Крус, Калифорния, США), разведенные в PBS, содержащем 1% бычьего сыворотки в течение 48 ч при 4°С на мешалке после инкубации в 10% бычьей сыворотке в PBS.Специфичность антитела против NPSR была продемонстрирована в предыдущих исследованиях [25], [26]. После нескольких промываний в PBS срезы инкубировали с Alexa Fluor® 488-конъюгированным affinipure ослиным IgG против IgG кролика (1∶200, 711-545-152, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., Пенсильвания, США) и CyTM 3-конъюгированным affinipure. ослиный антикозий IgG (1∶200, 705-165-147, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., PA, USA) в течение 2 ч при 37°C. Наконец, срезы помещали на предметные стекла, накрывали покровным стеклом, используя 90% глицерин в PBS, и исследовали под флуоресцентным микроскопом.

Анализ данных

Подсчет клеток.

Fos-ir нейроны в AON (Брегма 1,98 мм, рис. 1), Pir (Брегма 0,62 мм, рис. 1), VTT (Брегма 2,34 мм), ACo (Брегма -0,94 мм) и LEnt (Брегма — 3,40 мм) подсчитывали двусторонне для каждого животного, получавшего НПВ или носитель. Рассчитывали среднее значение для двух сторон.

Рис. 1. Схематические рисунки показывают локализацию секций, используемых для подсчета нейронов Fos-ir.

Серые зоны представляют AON (Брегма 1.98 мм) и Пир (Брегма 0,62 мм). Сокращения: АОН — переднее обонятельное ядро; Пир, грушевидная кора.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0062089.g001

Статистический анализ.

Значения были выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Данные теста зарытой пищи, теста потребления пищи и общего времени обнюхивания, затраченного на задачи обонятельного привыкания и отказа от привычки, были проанализированы с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) и теста наименьшей значимой разницы Фишера (LSD).Данные теста привыкания и отказа от обоняния были проанализированы с использованием внутригруппового дисперсионного анализа с повторными измерениями, а затем с помощью тестов Ньюмана-Кеулса. Количество нейронов Fos-ir между мышами, получавшими NPS и носитель, анализировали с использованием независимого t-критерия Стьюдента. Во всех статистических сравнениях уровень значимости был установлен на уровне p <0,05.

Результаты

Влияние НПВ на обонятельные функции

Тест зарытой пищи.

По сравнению с мышами, получавшими носитель, т.е.резюме. введение 0,1, 0,5 и 1 нмоль НПВ достоверно снижало латентность поиска закопанной пищи с 73,43±11,77 с до 35,74±5,37 ( p <0,001), 12,72±1,34 ( p <0,001) и 24,61±5,04 с. с ( p <0,001) соответственно (рис. 2). Среди трех доз 0,5 нмоль NPS больше всего снижала латентный период ( p <0,001 и p <0,05 по сравнению с носителем и 0,1 нмоль NPS соответственно; рис. 2). Действительно, высокая доза (1 нмоль) НПС незначительно снижала латентность по сравнению с 0.1 нмоль НПС (35,74±5,37 с против 24,61±5,04 с, p  = 0,24; рис. 2).

Рисунок 2. Задержка поиска закопанной пищи после i.c.v. инъекции носителя или НПВ мышам.

Значения средние ± SEM (n = 10 мышей в каждой группе). * р <0,05, ** р <0,001. Данные анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим применением критерия LSD Фишера.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0062089.g002

Тест на привыкание и отвыкание от обоняния.

На рис. 3A-D обобщены результаты тестов привычного и ненормального обонятельного поведения у мышей, которым интрацеребровентрикулярно вводили носитель или НПВ (0,1, 0,5 или 1 нмоль) на один и тот же и разные запахи соответственно. Центральное введение носителя вызывало привыкание к воде ( p <0,05) и ванили ( p <0,001) и отвыкание от ванили ( p <0,001, рис. 3A). Мыши, которым вводили NPS в дозе 0,1 нмоль, были способны различать миндаль и ваниль как новые запахи, но не привыкали к запаху миндаля (рис.3Б). По сравнению с контролем с носителем, мыши привыкали и выходили из привычки ко всем тестовым запахам после введения 0,5 или 1 нмоль NPS (рис. 3C и D), что указывает на то, что NPS в этих дозах может облегчить мышам различение всех одинаковых и разных тестируемых запахов. Как показано на рис. 3E, NPS в зависимости от дозы увеличивал общее время обнюхивания, затрачиваемое на обонятельные поведенческие задачи привыкания и отказа от привычки.

Рис. 3. Тест на привыкание и отвыкание от обоняния после i.c.v. инъекции носителя или НПВ мышам.

A. Мыши, получавшие носитель, демонстрировали значительное привыкание к воде, отказ от миндаля к ванили и привыкание к ванили. B. NPS при 0,1 нмоль проявлял значительное привыкание к воде, отвыкание от воды к миндалю, отвыкание от миндаля к ванили и привыкание к ванили. C. NPS при 0,5 нмоль проявляли значительное привыкание к воде, отказ от воды к миндалю, привыкание к миндалю, отказ от миндаля к ванили и привыкание к ванили. D. NPS при 1 нмоль демонстрировал значительное привыкание к воде, отказ от воды к миндалю, привыкание к миндалю, отказ от миндаля к ванили и привыкание к ванили. E. НПВ в зависимости от дозы увеличивает общее время вдыхания, затрачиваемое на обонятельные задачи привыкания и избавления от привычки. Значения представляют собой средние значения ± стандартная ошибка среднего (n = 10 мышей в каждой группе). * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001 для привыкания; ^# р <0.05, ^## p <0,01, ^### p <0,001 для отказа от привычки; данные были проанализированы с использованием внутригруппового дисперсионного анализа с повторными измерениями, а затем с помощью тестов Ньюмана-Кеулса. ^и р <0,01, ^&& р <0,001; данные были проанализированы с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим применением критерия LSD Фишера.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0062089.g003

Влияние НПВ на обонятельное поведение блокировалось [D-Val

Чтобы определить, блокирует ли антагонист NPSR действие NPS на обонятельные способности, [D-Val ⁵ ]NPS, селективный антагонист NPSR [27], вводили мышам с 0,5 нмоль NPS (в/в) или без него.

Наши результаты показали, что 40 нмоль [D-Val ⁵ ]НПС значительно противодействуют эффекту 0,5 нмоль НПВ на латентный период для поиска спрятанной пищи (рис. 4). Однако при введении отдельно 40 нмоль [D-Val ⁵ ]НПС не влияли на латентный период по сравнению с носителем (рис.4).

Рисунок 4. Задержка поиска закопанной пищи после i.c.v. инъекции носителя, НПВ или [D-Val ⁵ ]НПВ и НПВ + [D-Val ⁵ ]НПВ мышам.

Значения средние ± SEM (n = 10 мышей в каждой группе). * р <0,05, ** р <0,001. Данные анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим применением критерия LSD Фишера.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0062089.g004

Введение 20 нмоль [D-Val ⁵ ] НПВ значительно блокировало эффекты 0.5 нмоль NPS на обонятельную дифференцирующую способность (рис. 3C) в сторону воды и миндаля, но не ванили (рис. 5A). Кроме того, 40 нмоль [D-Val ⁵ ]НПВ полностью ингибировали влияние НПВ на обонятельное дифференцирующее поведение (рис. 5В) и заметно обращали вспять вызванное НПВ увеличение общего времени обнюхивания, затрачиваемого на задачи обонятельного привыкания и отвыкания (рис. 5С). ).

Рис. 5. Тест привыкания и отказа от обоняния у мышей после внутривенного введения. совместная инъекция НПВ и [D-Val ⁵ ]НПВ.

A. Введение 0,5 нмоль NPS + 20 нмоль [D-Val ⁵ ] NPS показало значительное привыкание к воде и отказ от привычки почти к ванили. B. Введение 0,5 нмоль NPS + 40 нмоль [D-Val ⁵ ]NPS вызывало значительное привыкание только к воде. C. Введение 0,5 нмоль NPS + 40 нмоль [D-Val ⁵ ]NPS значительно блокировало эффект NPS в отношении увеличения общего времени вдыхания в задачах привыкания к обонянию и отказа от привыкания.Значения представляют собой средние значения ± стандартная ошибка среднего (n = 10 мышей в каждой группе). * p <0,001 для привыкания; ^# p <0,05 для отказа от привычки; данные были проанализированы с использованием внутригруппового дисперсионного анализа с повторными измерениями, а затем с помощью тестов Ньюмана-Кеулса. ^и p <0,001, данные анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим применением критерия LSD Фишера.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0062089.g005

Ингибирующее действие НПВ на потребление пищи

Рис.6A и B суммированы эффекты NPS (i.c.v.) на кумулятивное и рассчитанное по времени потребление пищи через 0,5, 1, 2, 4 и 24 часа после лечения у голодных мышей. В течение первых получаса 0,5 и 1 нмоль НПВ дозозависимо ингибировали потребление пищи по сравнению с внутривенным введением. мышей, получавших носитель ( p <0,01 и p <0,001 соответственно; фиг. 6A и B). По сравнению с носителем, у мышей, получавших NPS, наблюдалось значительное снижение потребления пищи в период 0-0,5 ч в течение 24-часового периода (фиг. 6). Однако в течение второго часа после лечения мыши, которым вводили НПВ, ели значительно больше, чем контрольная группа ( p <0.01; Рис. 6Б).

Рисунок 6. Влияние НПВ на кумулятивное потребление пищи (А) и потребление в определенные периоды времени (В) у голодающих мышей.

Носитель, 0,5 или 1 нмоль НПВ вводили внутривенно. вводили мышам, голодавшим в течение 32 часов. Значения представляют собой средние значения ± стандартная ошибка среднего (n = 10 мышей в группе с носителем, n = 9 мышей в каждой группе NPS). * р <0,05, ** р <0,01, *** р <0,001. Данные анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим применением критерия LSD Фишера.

https://дои.org/10.1371/journal.pone.0062089.g006

NPS-индуцированное мечение c-Fos в обонятельной коре

В обонятельной коре центральное введение NPS (0,5 нмоль) индуцировало большое количество Fos-ir нейронов в AON (рис. 7A) и Pir (рис. 7C) и умеренное количество Fos-ir нейронов в VTT , ACo и LEnt (Таблица 1), и цифры были значительно больше, чем при впрыске носителя. В настоящем исследовании мы сосредоточились на областях AON и Pir, поскольку хорошо известно, что они играют ключевую роль в обонятельной функции и регуляции [28].По сравнению с мышами, получавшими носитель, NPS значительно увеличивал количество нейронов Fos-ir в 13,2 раза (2236 ± 199 против 169 ± 15) в AON (рис. 7E) и в 8,6 раз (1113 ± 49 против 169 ± 15). 128±16) в Пире (рис. 7F). Кроме того, NPS также индуцировал увеличение количества Fos-ir нейронов в моторной и соматосенсорной коре, миндалевидном теле, околоводопроводном сером, туберомаммилярном ядре, аркуатном гипоталамическом ядре, перифорникальном ядре и латеральной гипоталамической области (данные не показаны).

Рис. 7.Эффекты i.c.v. инъекция NPS на иммунореактивность Fos в AON и Pir у мыши. На микрофотографиях

AD показаны нейроны Fos-ir (черные) в AON и Pir у мышей, получавших NPS и носитель, соответственно. E, F. Гистограммы показывают количественный анализ количества Fos-ir нейронов в AON и Pir после NPS (n = 4 мыши) и носителя (n = 5 мышей) i.c.v. инъекция. Значения являются средними значениями ± SEM. * р <0,001. Данные анализировали с помощью независимого t-критерия Стьюдента.Бар = 100 мкм. Сокращения: aci, передняя спайка, внутрибульбарная часть; AON, переднее обонятельное ядро; вот, латеральный обонятельный тракт; Пир, грушевидная кора; OV, обонятельный желудочек.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0062089.g007

NPS-индуцированные Fos-ir нейроны в обонятельной коре экспрессируют NPSR

Определить, экспрессируют ли NPS-индуцированные Fos-ir нейроны в AON и Pir NPSR. Было проведено окрашивание Fos-ir в сочетании с окрашиванием NPSR-ir.Как показано на рис. 8, процент нейронов Fos-ir, которые также демонстрируют окрашивание для NPSR, составлял 88,5 ± 1,1% в AON (рис. 8A-C) и 98,1 ± 0,4% в Pir (рис. 8D-F). , соответственно.

Рис. 8. NPS-индуцированные нейроны Fos-ir, несущие NPSR в AON и Pir.

На микрофотографиях показаны нейроны Fos-ir в AON (A) и Pir (D) после NPS i.c.v. введения, NPSR-ir нейронов в AON (B) и Pir (E), и коэкспрессии Fos-ir и NPSR-ir нейронов в AON (C) и Pir (F) соответственно.Стрелки (C и F) показывают коэкспрессию нейронов Fos-ir и NPSR-ir. Бар = 50 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0062089.g008

Обсуждение

Настоящее исследование впервые продемонстрировало, что i.c.v. введение мышам NPS улучшало обонятельные способности, уменьшая латентный период для поиска закопанной пищи и усиливая обонятельную дифференциацию различных запахов (рис. 2–3). Среди трех доз 0,5 нмоль NPS, вероятно, уже максимально активирует его мозговые мишени, потому что в этой дозе NPS больше всего сокращает латентный период для поиска закопанной пищи и значительно способствует отвыканию и привыканию ко всем тестируемым запахам.Эти результаты показывают, что НПВ могут улучшать способность ощущать летучие запахи, а также обнаруживать и различать различные запахи. Было показано, что несколько классических нейротрансмиттеров, происходящих из области ствола мозга, например, норадренергическое ядро ​​голубого пятна [29]–[32] и серотонинергическое ядро ​​шва [33], модулируют обонятельное поведение. Кроме того, некоторые нейропептиды, такие как пептиды, родственные тахикинину, короткий нейропептид F и FMRFамид, также участвуют в модуляции обонятельной функции [34].Кларк и др. сообщили, что NPS происходит из ядра Kölliker-Fuse и перикоэрулярной области ствола мозга мыши и что мРНК NPSR сильно экспрессируется в обонятельной коре [2]. Взятые вместе, проекции NPS из ядра Kölliker-Fuse и перикоэрулярной области ствола мозга мышей в обонятельную кору могут обеспечивать механистическую основу для регуляции ею обонятельной функции.

Обоняние имеет большое значение для выживания млекопитающих и влияет на различные виды социальной деятельности, включая распознавание, выбор партнера, реакцию страха на запах хищника и потребление пищи, особенно у грызунов [23], [24].В настоящем исследовании, когда 0,5 или 1 нмоль NPS вводили соответственно i.c.v. при введении мышам натощак потребление пищи дозозависимо снижалось в течение первых получаса по сравнению с мышами, получавшими носитель (рис. 6). Эти результаты согласуются с более ранними наблюдениями, согласно которым NPS ингибирует потребление пищи у мышей и крыс [9], [35]–[37]. Механизмы, с помощью которых НПВ регулируют потребление пищи, до сих пор неизвестны. Однако в некоторых отчетах, описанных Fedeli et al. и Пэн и др. предполагают, что паравентрикулярные ядра гипоталамуса, а также НПСР участвуют в аноректическом действии НПВ [9], [36].Эти результаты показывают, что НПВ усиливает обонятельную функцию, но препятствует проглатыванию.

Как показано на рис. 3, NPS в зависимости от дозы увеличивает общее время вдыхания запаха во время задач привыкания и отказа от обоняния. Обычно считается, что фырканье является частью поведения, вызывающего возбуждение [38]. Во время быстроволнового состояния неокортикальной ЭЭГ обонятельные нейроны коры демонстрировали сильные спайковые ответы на адекватные одоранты, тогда как они демонстрировали только слабые ответы в медленноволновом состоянии [39]–[41]. Наша более ранняя работа продемонстрировала, что NPS значительно увеличивает бодрствование, сопровождаемое увеличением высокочастотной активности ЭЭГ (14.5–60 Гц) и значительно уменьшает медленноволновой сон и парадоксальный сон у крыс [7]. Следовательно, обнюхивание и увеличение времени обнюхивания, вероятно, связаны с увеличением возбуждения, передвижения и исследования, вызванных NPS.

Что еще более важно, наше исследование также направлено на выявление потенциальных мишеней, посредством которых NPS облегчает обонятельную функцию, путем изучения нейронов, экспрессирующих Fos, продукт непосредственно раннего гена, который экспрессируется в связи с активацией нейронов [42], [43].Наши результаты показывают, что центральное введение НПС вызывало увеличение количества Fos-ir нейронов в нескольких областях обонятельной коры, включая AON, Pir (рис. 7), VTT, ACo и LEnt (табл. 1). Считается, что это происходит в AON для большей части начальной конвергенции признаков запаха, связанной с ранними стадиями создания объектов запаха [28]. В то время как Пир, самая большая область обонятельной коры, будет выполнять ассоциации более высокого порядка между объектами запаха и гедоникой, контекстом и другими запахами [15].Наше настоящее исследование также было разработано для изучения того, были ли эффекты NPS на регуляцию обонятельной функции избирательно противодействовать антагонисту NPSR, и, кроме того, экспрессировали ли нейроны, активированные NPS, свой родственный рецептор в обонятельной коре. Результаты показывают, что эффекты NPS на регуляцию обонятельной функции блокируются антагонистом NPSR [D-Val ⁵ ]NPS (рис. 4 и 5), и что подавляющее большинство Fos-ir нейронов активируется АНП в АОН и Пире также содержали НПСР (рис.8С и F). В большом количестве литературы показано, что NPS избирательно связывает NPSR с высокой аффинностью, вызывая биологические действия [1], [9], [10], [12], [44], [45]. Наши результаты убедительно свидетельствуют о том, что NPS способствует обонятельной способности за счет активации нейронов, несущих NPSR, в обонятельной коре.

Таким образом, центральное введение НПВ у мышей усиливает обонятельные функции, уменьшая латентный период для поиска закопанной пищи и усиливая обонятельную дифференциацию одинаковых и разных запахов.Эти эффекты являются рецептор-специфичными, поскольку они могут быть заблокированы его селективным антагонистом NPSR [D-Val ⁵ ]NPS. Кроме того, центральное введение NPS заметно активирует экспрессию c-Fos в нейронах обонятельной коры, большинство из которых также экспрессируют NPSR, что указывает на то, что NPS облегчает обонятельные функции посредством активации NPSR в нейронах обонятельной коры.

Благодарности

Мы благодарим профессора Руи Ванга за подарки NPS и [D-Val ⁵ ]NPS и Dr.Shuye Pu за исправление рукописи.

Авторские взносы

Инициатива и разработка экспериментов: YH YS. Выполнены опыты: YS PZ CD JL HW. Проанализированы данные: YH YS CD PZ. Предоставленные реагенты/материалы/инструменты для анализа: YH LD. Написал статью: YH YS XK.

Каталожные номера

1. 1. Xu YL, Reinscheid RK, Huitron-Resendiz S, Clark SD, Wang Z, et al. (2004) Нейропептид S: нейропептид, способствующий возбуждению и анксиолитическим эффектам.Нейрон 43: 487–497.
2. 2. Кларк С.Д., Дуангдао Д.М., Шульц С., Чжан Л., Лю С. и др. (2011) Анатомическая характеристика системы нейропептида S в мозге мыши с помощью гибридизации in situ и иммуногистохимии. J Comp Neurol 519: 1867–1893.
3. 3. Xu YL, Gall CM, Jackson VR, Civelli O, Reinscheid RK (2007)Распределение мРНК рецептора нейропептида S и нейрохимические характеристики нейронов, экспрессирующих нейропептид S, в мозге крысы. J Comp Neurol 500: 84–102.
4. 4. Леонард С.К., Ринг Р.Х. (2011)Иммуногистохимическая локализация рецептора нейропептида S в центральной нервной системе крыс. Неврология 172: 153–163.
5. 5. Duangdao DM, Clark SD, Okamura N, Reinscheid RK (2009)Поведенческое фенотипирование мышей с нокаутом рецептора нейропептида S. Behav Brain Res 205: 1–9.
6. 6. Энквист Дж., Ферверда М., Мадхаван А., Хок Д., Уистлер Дж.Л. (2012) Хронический этанол усиливает действие нейропептидов в базолатеральной миндалевидном теле и проявляет повышенный анксиолитический и антидепрессивный эффект.Нейропсихофармакология 37: 2436–2445.
7. 7. Чжао П., Шао Ю.Ф., Чжан М., Фань К., Конг Х.П. и др. (2012) Нейропептид S способствует бодрствованию за счет активации гистаминергических и орексинергических нейронов заднего гипоталамуса. Неврология 207: 218–226.
8. 8. Li W, Chang M, Peng YL, Gao YH, Zhang JN и др. (2009) Нейропептид S оказывает антиноцицептивное действие на супраспинальном уровне у мышей. Регул Пепт 156: 90–95.
9. 9. Пэн Ю.Л., Чжан Д.Н., Чанг М., Ли В., Хань Р.В. и др.(2010)Влияние центрального нейропептида S на формалиновый тест на мышах. Пептиды 31: 1878–1883.
10. 10. Джунглинг К., Зайденбехер Т., Сосулина Л., Лестинг Дж., Сангха С. и др. (2008) Нейропептид S-опосредованный контроль выражения и угасания страха: роль интеркалированных ГАМКергических нейронов в миндалевидном теле. Нейрон 59: 298–310.
11. 11. Han RW, Yin XQ, Chang M, Peng YL, Li W и др. (2009) Нейропептид S облегчает пространственную память и смягчает ухудшение пространственной памяти, вызванное антагонистом рецептора N-метил-D-аспартата у мышей.Neurosci Lett 455: 74–77.
12. 12. Окамура Н., Гарау С., Дуангдао Д.М., Кларк С.Д., Джунглинг К. и др. (2011) Нейропептид S улучшает память во время фазы консолидации и взаимодействует с норадренергическими системами в головном мозге. Нейропсихофармакология 36: 744–752.
13. 13. Каллупи М., Каннелла Н., Экономиду Д., Убальди М., Руджери Б. и др. (2010) Нейропептид S способствует индуцированному сигналом рецидиву поиска кокаина за счет активации гипоталамической гипокретиновой системы.Proc Natl Acad Sci USA 107: 19567–19572.
14. 14. Невилл К.Р., Хаберли Л.Б. (2004)Обонятельная кора. В Синаптической организации мозга, 415–454.
15. 15. Уилсон Д.А., Салливан Р.М. (2011)Корковая обработка объектов запаха. Нейрон 72: 506–519.
16. 16. Paxinos G, Franklin KBJ (2001) Мозг мыши в стереотаксических координатах, 2-е изд. Сан-Диего: Академическая пресса.
17. 17. Чанг М., Пэн Ю.Л., Донг С.Л., Хань Р.В., Ли В. и др.(2005)Исследования структуры-активности различных модификаций ноцицептина/орфанина FQ: идентификация сильнодействующих агонистов и антагонистов его рецептора. Регул Пепт 130: 116–122.
18. 18. Ян М., Кроули Дж. Н. (2009) Простая поведенческая оценка обоняния мыши. Curr Protoc Neurosci Глава 8: Блок 8.24.
19. 19. Nathan BP, Yost J, Litherland MT, Struble RG, Switzer PV (2004)Обонятельная функция у мышей с нокаутом ароЕ. Behav Brain Res 150: 1–7.
20. 20.Вудли С.К., Баум М.Дж. (2003)Влияние половых гормонов и пола на пороги влечения к летучим запахам анальных желез у хорьков. Хорм Бехав 44: 110–118.
21. 21. Wrenn CC, Kinney JW, Marriott LK, Holmes A, Harris AP, et al. (2004)Обучение и память у мышей, у которых отсутствует подтип GAL-R1 рецептора галанина. Eur J Neurosci 19: 1384–1396.
22. 22. Версингер С.Р., Колдуэлл Х.К., Мартинес Л., Голд П., Ху С.Б. и др. (2007) Мыши с нокаутом рецептора вазопрессина 1а имеют тонкий обонятельный дефицит, но нормальную агрессию.Genes Brain Behav 6: 540–551.
23. 23. Mandairon N, Poncelet J, Bensafi M, Didier A (2009) Люди и мыши выражают схожие обонятельные предпочтения. PLoS One 4: e4209.
24. 24. Санчес-Андраде Г., Кендрик К.М. (2009)Основная обонятельная система и социальное обучение у млекопитающих. Behav Brain Res 200: 323–335.
25. 25. Лайтинен Т., Полви А., Ридман П., Венделин Дж., Пулккинен В. и др. (2004) Характеристика общего локуса восприимчивости к признакам, связанным с астмой.Наука 304: 300–304.
26. 26. Венделин Дж., Пулккинен В., Рен М., Пирсканен А., Райсанен-Соколовски А. и соавт. (2005) Характеристика GPRA, нового рецептора, связанного с G-белком, связанного с астмой. Am J Respir Cell Mol Biol 33: 262–270.
27. 27. Геррини Р., Камарда В., Трапелла С., Кало Дж., Рицци А. и др. (2009)Синтез и биологическая активность аналогов нейропептида S человека, модифицированных в положении 5: идентификация сильнодействующих и чистых антагонистов рецептора нейропептида S.J Med Chem 52: 524–529.
28. 28. Haberly LB (2001)Параллельно-распределенная обработка в обонятельной коре: новое понимание морфологического и физиологического анализа нейронных цепей. Химические чувства 26: 551–576.
29. 29. Bouret S, Sara SJ (2002)Активация голубоватого пятна модулирует скорость стрельбы и временную организацию вызванных запахом одноклеточных ответов в грушевидной коре крысы. Eur J Neurosci 16: 2371–2382.
30. 30. Jiang M, Griff ER, Ennis M, Zimmer LA, Shipley MT (1996)Активация голубого пятна усиливает реакцию митральных клеток обонятельной луковицы на слабый вход обонятельного нерва.J Neurosci 16: 6319–6329.
31. 31. Hasselmo ME, Linster C, Patil M, Ma D, Cekic M (1997)Норадренергическое подавление синаптической передачи может влиять на кортикальное отношение сигнал/шум. Дж. Нейрофизиол 77: 3326–3339.
32. 32. Smith JJ, Shionoya K, Sullivan RM, Wilson DA (2009)Слуховая стимуляция выводит из строя обонятельные реакции посредством норадренергической корковой модуляции. Нейрал Пласт 2009: 754014.
33. 33. Шипли М.Т., Эннис М. (1996)Функциональная организация обонятельной системы.Дж. Нейробиол 30: 123–176.
34. 34. Leinwand SG, Chalasani SH (2011)Обонятельные сети: от ощущения к восприятию. Curr Opin Genet Dev 21: 806–811.
35. 35. Beck B, Fernette B, Stricker-Krongrad A (2005) Пептид S является новым мощным ингибитором произвольного и быстрого приема пищи у крыс. Biochem Biophys Res Commun 332: 859–865.
36. 36. Федели А., Бракони С., Экономиду Д., Каннелла Н., Каллупи М. и др. (2009) Паравентрикулярное ядро ​​гипоталамуса является нейроанатомическим субстратом для ингибирования приема вкусной пищи нейропептидом S.Евр Джей Нейроски. 30: 1594–1602.
37. 37. Смит К.Л., Паттерсон М., Дхилло В.С., Патель С.Р., Семджонус Н.М. и др. (2006) Нейропептид S стимулирует гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковую ось и подавляет прием пищи. Эндокринология 147: 3510–3518.
38. 38. Seelke AM, Blumberg MS (2004)Обнюхивание крысят во время сна и бодрствования. Behav Neurosci 118: 267–273.
39. 39. Мураками М., Кашивадани Х., Кирино Ю., Мори К. (2005)Зависящие от состояния сенсорные ворота в обонятельной коре.Нейрон 46: 285–296.
40. 40. Барнс Д.К., Чапюи Дж., Чаудхури Д., Уилсон Д.А. (2011)Кондиционирование страха перед запахом изменяет локальные полевые потенциалы грушевидной коры как во время кондиционирования, так и во время сна после кондиционирования. PLoS One 6: e18130.
41. 41. Уилсон Д.А. (2010) Единичная активность грушевидной коры во время медленноволнового состояния определяется недавним ощущением запаха. J Neurosci 30: 1760–1765.
42. 42. Morgan JI, Curran T (1986) Роль потока ионов в контроле экспрессии c-fos.Природа 322: 552–555.
43. 43. Драгунов М., Фаулл Р. (1989)Использование c-fos в качестве метаболического маркера при отслеживании путей нейронов. J Neurosci Methods 29: 261–265.
44. 44. Филаферро М., Нови С., Руджери В., Дженедани С., Альбони С. и др. (2012) Нейропептид S стимулирует хемотаксис моноцитов человека посредством активации рецептора NPS. Пептиды 39С: 16–20.
45. 45. Руцца С., Рицци А., Камарда В., Пульга А., Марзола Г. и др. (2012) [tBu-D-Gly5] NPS, чистый и мощный антагонист рецептора нейропептида S: исследования in vitro и in vivo.Пептиды 34: 404–411.