Содержание

Строение ядра клетки

Ядро клетки по своему строению относится к группе двухмембранных органоидов. Однако ядро настолько важно для жизнедеятельности эукариотической клетки, что обычно его рассматривают отдельно. Ядро клетки содержит хроматин (деспирализованные хромосомы), который отвечает за хранение и передачу наследственной информации.

В строении ядра клетки выделяют следующие ключевые структуры:

  • ядерная оболочка, состоящая из внешней и внутренней мембраны,
  • ядерный матрикс — всё, что заключено внутри клеточного ядра,
  • кариоплазма (ядерный сок) — жидкое содержимое, подобное по составу гиалоплазме,
  • ядрышко,
  • хроматин.

Кроме перечисленного в ядре содержатся различные вещества, субъединицы рибосом, РНК.

Строение наружной мембраны ядра клетки сходно с эндоплазматической сетью. Часто внешняя мембрана просто переходит в ЭПС (последняя от нее как бы ответвляется, является ее выростом). С внешней стороны на ядре располагаются рибосомы.

Внутренняя мембрана более прочная за счет выстилающей ее ламины. Кроме опорной функции к этой ядерной выстилке прикрепляется хроматин.

Пространство между двумя ядерными мембранами называется перинуклеарным.

Мембрана ядра клетки пронизана множеством пор, соединяющих цитоплазму с кариоплазмой. Однако по своему строению поры ядра клетки не просто отверстия в мембране. В них содержатся белковые структуры (поровый комплекс белков), отвечающий за избирательную транспортировку веществ и структур. Пассивно через пору могут проходить только малые молекулы (сахара, ионы).

Хроматин следует считать главным компонентом ядра. В нем заключена наследственная информация, которая передается при каждом делении клетки, а также реализуется в процессе жизнедеятельности самой клетки.

Хроматин ядра клетки состоит их хроматиновых нитей

. Каждая хроматиновая нить соответствует одной хромосоме, которая образуется из нее путем спирализации.

Чем сильнее раскручена хромосома (превращена в хроматиновую нить), тем больше она задействована в процессах синтеза на ней. Одна и та же хромосома может быть в одних участках спирализована, а в других деспирализована.

Каждая хроматиновая нить ядра клетки по строению является комплексом ДНК и различных белков, которые в том числе выполняют функцию скручивания и раскручивания хроматина.

Ядра клеток могут содержать одно и более ядрышек. Ядрышки состоят из рибонуклеопротеидов, из которых в дальнейшем образуются субъединицы рибосом. Здесь происходит синтез рРНК (рибосомальной РНК).

Органоид — это… Что такое Органоид?

Органоиды (от орган и греч. éidos — вид), или органеллы  — в цитологии постоянные структуры клеток. Каждый органоид осуществляет определённые функции, жизненно необходимые для клетки. Таким образом, любое проявление жизнедеятельности клетки — следствие согласованной работы её взаимосвязанных компонентов, особенно органоидов. К органоидам относят митохондрии, аппарат Гольджи, клеточный центр, эндоплазматическую сеть, рибосомы, цитоплазматические микротрубочки и др., а в растительных клетках, кроме того, — пластиды, сферосомы и др. Вопрос о лизосомах как органоидах дискуссионен. Термин «Органоиды» объясняется сопоставлением этих компонентов клетки с органами многоклеточного организма. Органоиды противопоставляют временным включениям клетки, которые появляются и исчезают в процессе обмена веществ.

Иногда органоидами считают только постоянные структуры клетки, расположенные в ее цитоплазме. В то же время нередко к органоидам причисляют и внутриядерные структуры — например, ядрышко.

Рецепторы и прочие мелкие, молекулярного уровня, структуры, органоидами не называют. Граница между молекулами и органоидами очень нечеткая. Так, рибосомы, которые обычно однозначно относят к органоидам, можно считать и сложным молекулярным комплексом. Все чаще к органоидам причисляют и другие подобные комплексы сравнимых размеров и уровня сложности — протеасомы, сплайсосомы и др. В то же время сравнимые по размерам элементы цитоскелета (микробрубочки, толстые филаменты поперчнополосатых мышц и т.п.) обычно к органоидам не относят. Степень постоянства клеточной структуры — тоже ненадежный критерий ее отнесения к органоидам. Так, митотичесмкое веретено, которое хотя и не постоянно, но закономерно присутствует во всех эукариотических клетках, обычно к органоидам не относят, а ядро, которое во многих клетках эукариот в течение части клеточного цикла отсутствует — относят. Во многом набор органоидов, перечисляемый в учебных руководствах, определяется традицией.

Органоиды эукариотов
Органелла Основная функция Структура Организмы Заметки
Хлоропласт (Пластиды) фотосинтез двухмембранная растения, Протисты имеют собственную ДНК; предполагают что хлоропласты возникли из цианобактерий в результате симбиогенеза
Эндоплазматический ретикулум трансляция и свёртывание новых белков (гранулярный эндоплазматический ретикулум), синтез липидов (агранулярный эндоплазматический ретикулум) одномембранная все эукариоты на поверхности гранулярного эндоплазматического ретикулума находится большое количество рибосом, свёрнут как мешок; агранулярный эндоплазматический ретикулум свёрнут в трубочки
Аппарат Гольджи сортировка и преобразование белков одномембранная все эукариоты асимметричен — цистерны, располагающиеся ближе к ядру клетки (цис-Гольджи) содержат наименее зрелые белки и транс-Гольджи где отпочковываются пузырьки, содержащие полностью зрелые белки
Митохондрия производство энергии
двухмембранная
большинство эукариотов имеют свою собственную митохондриальную ДНК; предполагают что митохондрии возникли в результате симбиогенеза
Вакуоль хранилище, гомеостаз, питание клетки из внешней среды путем пиноцитоза или фагоцитоза одномембранная эукариоты
Ядро Хранение ДНК, транскрипция РНК двухмембранная все эукариоты содержит основную часть генома
Рибосомы синтез белка на основе матричных РНК при помощи транспортных РНК РНК/белок эукариоты, прокариоты
Везикулы запасают или транспортируют питательные вещества одномембранная все эукариоты
Лизосомы мелкие лабильные образования, содержащие ферменты, в частности гидролазы, принимающие участие в процессах автолиза (саморастворение органелл) одномембранная большинство эукариот
Центросомы органоиды клетки, имеющие непосредственное отношение к процессу клеточного деления немембранная эукариоты
Меланосома хранение пигмента одномембранная животные
Миофибриллы сокращение мышечных волокон пучок нитей животные

Ядро — основной органоид клетки

 «Введение в общую биологию и экологию. 9 класс». А.А. Каменский (гдз)

 

 

 

Вопрос 1. Каковы функции ядра клетки?
Ядро в клетке выполняет основные функции:
1. хранение и воспроизведение наследственной информации, которая хранится в ядре в виде молекул ДНК, входящих в состав хромосом;
2. регуляция обмена веществ в клетке осуществляется благодаря тому, что в ядре содержится наследственная информация о строении клеточных белков в составе ядерных хромосом.

Вопрос 2. Какие организмы относятся к прокариотам?
Прокариоты — это организмы, клетки которых не имеют оформленного ядра. К ним относят бактерии, сине-зеленые водоросли (цианобактерии) и археи.

Вопрос 3. Как устроена ядерная оболочка?
Ядерная оболочка – отделяет содержимое ядра от цитоплазмы. Ядерная оболочка состоит из двух мембран: наружной и внутренней, которые соединяются вместе в области пор. При повышении скорости обменных процессов между ядром и цитоплазмой количество пор увеличивается, т.е. можно судить об активности ядра по количеству пор. Из ядра через ядерные поры выходят: иРНК, тРНК, субъединицы рибосом. В ядро из цитоплазмы поступают ядерные и рибосомальные белки, нуклеотиды, жиры, углеводы, АТФ, вода и ионы. Наружная ядерная оболочка соединяется с гранулярной эндоплазматической сетью. Внутренняя ядерная оболочка контактирует с кариоплазмой (ядерным соком), лишена рибосом и в некоторых местах соединяется с хроматином.

Вопрос 4. Что собой представляет хроматин?
Хроматин – это комплекс ДНК и белков, в основном гистоновых. Молекулы гистонов с ДНК образуют группы – нуклеосомы. Молекула ДНК, соединенная с нуклеосомой, образует ДНП (дезоксирибонуклеопротеид)– это наименьшая единица хромосомы. В состав хроматина входят РНК, ионы Ca2+ и Mg2+, а также фермент ДНК-полимераза, необходимый для репликации ДНК. Во время деления ядра хроматин спирализуется и становится видимым в световой микроскоп, т.е. начинают формироваться хромосомы (греч.chromo — цвет, soma — тело.).

Вопрос 5. Каковы функции ядрышек?
Ядрышки – это округлые, сильно уплотненные, не ограниченные мембраной участки ядра. Форма их, размеры и количество зависит от функционального состояния ядра. В клетке, выполняющей функцию синтеза большого количества белка, в ядре будет несколько ядрышек или они будут крупные и рыхлые, т.е. функция ядрышка – это синтез рРНК и сборка малой и большой субъединиц рибосом. В составе ядрышка находится: 80% белка, 10-15% РНК, небольшое количество ДНК и другие химические компоненты. В профазу деления клетки субъединицы рибосом через ядерные поры выходят в цитоплазму, ДНК ядрышка упаковывается на хромосомы, имеющие вторичную перетяжку или ядрышковый организатор, и соответственно, ядрышко как структура распадается и становится не видимой структурой, поэтому иногда говорят, что оно «растворяется».

Вопрос 6. Из чего состоит хромосома?
Хромосома представляет собой молекулу ДНК, соединенную с особым белком, придающим ей компактность.

Вопрос 7. Где располагаются хромосомы у бактерий?
В клетках бактерий нет оформленного ядра. Генетический аппарат бактерий представлен одной кольцевой молекулой ДНК (бактериальной хромосомой), которая присоединена в определенном месте к клеточной мембране и занимает в цитоплазме пространство, называемое нуклеоидом.

Вопрос 8. Что такое кариотип?
Кариотипом — это определенный набор хромосом, характерный для данного вида организмов. Кариотип характеризуется не только числом хромосом, но и их размерами, формой, расположением центромера.

Вопрос 9. Как называется набор хромосом в соматических клетках?
Как правило, соматические клетки содержат двойной набор хромосом, который называется диплоидным.

Вопрос 10. Какой набор хромосом в гаметах?
Гаметы содержат только по одной хромосоме каждого вида, т. е. имеют одинарный набор хромосом, который называется гаплоидным.

Вопрос 11. Какой гаплоидный набор хромосом в клетках рака, если диплоидный равен 118?
Если диплоидный набор хромосом в клетках равен 118, то гаплоидный будет в два раза меньше — 59 (118/2=59).

Вопрос 12. Может ли диплоидный набор содержать нечетное число хромосом?
Диплоидный набор хромосом может содержать нечетное количество хромосом. Существуют организмы, у которых в соматических клетках имеется только одна половая хромосома. Например, у некоторых насекомых (клопы, кузнечики) самки гомогаметны (XX), а самцы имеют только одну половую хромосому (ХО).

🚀 Реферат на тему «Ядро – главный органоид клетки»

Содержание

Введение
Глава 1. Строение ядра
1.1. Ядерная оболочка
1.2. Ядерный матрикс
1.3. Кариоплазма
1.4. Ядрышко
1.5. Хроматин
Глава 2. Функции ядра
Заключение
Список использованных источников

Введение

Каждый многоклеточный организм состоит из органов, органы состоят из тканей, ткани из клеток, а клетки состоят из множества органоидов. Они разнообразны по своему происхождению, строению, местоположению, свойствам, а главное – функциям. Например, на рибосомах, немембранных органоидах, осуществляется синтез белка, митохондрии выступают энергетическими станциями клеток, лизосомы выполняют функцию фагоцитоза и т.д. Все эти органоиды находятся в тесной взаимосвязи межу собой, все вместе они осуществляют работу клетки и способствуют её нормальной жизнедеятельности. Но работа эта не производится без контроля самого важного органоида – ядра. Ядро является важнейшая составная часть клетки, оно регулирует и контролирует все процессы, происходящие в клетке.  Также ядро клетки содержит в своём составе ДНК, что обусловливает 2 главные функции:

1) Хранение и передача наследственной информации

2) Регуляция процессов обмена веществ в клетке

Существует множество безъядерных организмов, однако они относятся к примитивным и их клетки долго существовать не могут. Клетка не может долго функционировать без ядра, а ядро не может существовать вне клетки, потому образуется взаимосвязанная система ядра и цитоплазмы. Наряду с безъядерными и одноядерными существуют клетки, в которых можно наблюдать 2-3 ядра в одной, например, в клетках печени. Известны и многоядерные клетки, причем число ядер может достигать нескольких десятков. Форма ядра зависит большей частью от формы клетки, она может быть и совершенно неправильной. Различают ядра шаровидные, многолопастные. Впячивания и выросты ядерной оболочки значительно увеличивают поверхность ядра и тем самым усиливают связь ядерных и цитоплазматических структур и веществ [2].

Нужна помощь в написании реферата?

Мы — биржа профессиональных авторов (преподавателей и доцентов вузов). Наша система гарантирует сдачу работы к сроку без плагиата. Правки вносим бесплатно.

Цена реферата

Глава 1. Строение ядра

Ядро – двумембранный органоид. В его строении ядра можно выделить следующие ключевые структуры:

  1. Ядерная оболочка, состоящая из внешней и внутренней мембраны,
  2. Ядерный матрикс — всё, что заключено внутри клеточного ядра,
  3. Кариоплазма (ядерный сок)
  4. Ядрышко,
  5. Хроматин [1]

1.1. Ядерная оболочка

Ядерная оболочка характерна для всех эукариотических клеток. Ядерная         оболочка состоит из внешней и внутренней мембран. В состав ядерной оболочки входят ядерные поры.

Мембраны ядерной оболочки в морфологическом отношении не отличаются от остальных внутриклеточных мембран: они имеют толщину около 7 нм и состоят из двух осмиофильных слоев.

В общем виде ядерная оболочка может быть представлена, как полый двухслойный мешок, отделяющий содержимое ядра от цитоплазмы. Из всех внутриклеточных мембранных компонентов таким типом расположения мембран обладают только ядро, митохондрии и пластиды. Однако ядерная оболочка имеет характерную особенность, отличающую ее от других мембранных структур клетки. Это наличие особых пор в оболочке ядра, которые образуются за счет многочисленных зон слияний двух ядерных мембран и представляет собой как бы округлые перфорации всей ядерной оболочки.

Строение ядерной оболочки:

Внешняя мембрана ядерной оболочки, непосредственно контактирующая с цитоплазмой клетки, имеет ряд структурных особенностей, позволяющих отнести ее к собственно мембранной системе эндоплазматического ретикулума. Так, на внешней ядерной мембране обычно располагается большое количество рибосом. Внутренняя мембрана контактирует с хромосомным материалом ядра.

Нужна помощь в написании реферата?

Мы — биржа профессиональных авторов (преподавателей и доцентов вузов). Наша система гарантирует сдачу работы к сроку без плагиата. Правки вносим бесплатно.

Цена реферата

Наиболее характерной и бросающейся в глаза структурой в ядерной оболочке является ядерная пора. Поры в оболочке образуются за счет слияния двух ядерных мембран в виде округлых сквозных отверстий или перфораций с диаметром 80-90 нм. Округлое сквозное отверстие в ядерной оболочке заполнено сложноорганизованными глобулярными и фибриллярными структурами. Совокупность мембранных перфораций и этих структур называют комплексом пор ядра.

Число ядерных пор зависит от метаболической активности клеток: чем выше синтетические процессы в клетках, тем больше пор на единицу поверхности клеточного [5].

1.2. Ядерный матрикс

Ядерный матрикс не представляет собой четкой морфологической структуры: он выявляется как отдельный морфологический гетерогенный компонент при экстракции из ядер практически всех участков хроматина, основной массы РНК и липопротеидов ядерной оболочки. От ядра, которое не теряет при этом своей общей морфологии, оставаясь сферической структурой, остается как бы каркас, остов, который иногда называют еще «ядерным скелетом».

По своей морфологической композиции ядерный матрикс состоит, по крайней мере, из трех компонентов: периферический белковый сетчатый (фиброзный) слой – ламина, внутренняя или интерхроматиновая сеть (остов) и «остаточное» ядрышко.

Ламина представляет собой тонкий фиброзный слой, подстилающий внутреннюю мембрану ядерной оболочки. В ее состав входят так же комплексы ядерных пор, которые как бы вмурованы в фиброзный слой. Часто эту часть ядерного матрикса называют фракцией «поровый комплекс – ламина» (PCL – “pore complex – lamina”). В интактных клетках и ядрах ламина большей частью морфологически не выявляется, т.к. к ней тесно прилегает слой периферического хроматина. Лишь иногда ее удается наблюдать в виде относительного тонкого (10-20 нм) фиброзного слоя, располагающегося между внутренней мембраной ядерной оболочки и периферическим слоем хроматина.

Внутриядерный остов или сеть морфологически выявляется только после экстракции хроматина. Он представлен рыхлой фиброзной сетью, располагающейся между участками хроматина, часто в состав этой губчатой сети входят различные гранулы РНП-природы.

Нужна помощь в написании реферата?

Мы — биржа профессиональных авторов (преподавателей и доцентов вузов). Наша система гарантирует сдачу работы к сроку без плагиата. Правки вносим бесплатно.

Подробнее

Наконец, третий компонент ядерного матрикса – остаточное ядрышко – плотная структура, повторяющая по своей форме ядрышко, также состоит из плотно уложенных фибрилл.

Компоненты ядерного матрикса представляют собой не застывшие жесткие структуры, а компоненты, обладающие динамической подвижностью, которые могут меняться [5].

1.3. Кариоплазма

Кариоплазма или нуклеоплазма. Это микроскопически бесструктурное вещество ядра. Содержит различные белки, нуклеопротеины, гликопротеины, ферменты и соединения, участвующие в процессах синтеза нуклеиновых кислот, белков и всех других веществ, входящих в состав кариоплазмы. Кариоплазма заполняет все внутреннее пространство ядра между хромосомами и ядрышком. Благодаря ей ядро обладает тургором.

Кариоплазма (ядерный сок, нуклеоплазма) в виде неструктурированной массы окружает хромосомы и ядрышки. Вязкость ядерного сока примерно такая же, как вязкость основного вещества цитоплазмы. Кислотность ядерного сока, определенная путем микроинъекции индикаторов в ядро, оказалась несколько выше, чем у цитоплазмы. Кроме того, в ядерном соке содержатся ферменты, участвующие в синтезе нуклеиновых кислот в ядре, и рибосомы. Ядерный сок не окрашивается основными красителями, поэтому его называют ахроматиновым веществом, или кариолимфой, в отличие от участков, способных окрашиваться, — хроматина. Кариоплазма- основная внутренняя среда ядра, она занимает все пространство между ядрышком, хроматином, мембранами, всевозможными включениями и другими структурами. Кариоплазма под электронным микроскопом имеет вид гомогенной или мелкозернистой массы с низкой электронной плотностью. В ней во взвешенном состоянии находятся рибосомы, микротельца, глобулины и различные продукты метаболизма. Кариоплазма характеризуется особыми структурными и функциональными свойствами. Функции кариоплазмы чрезвычайно многообразны, поскольку с ней связаны коллоидные свойства ядра, а также явления роста, синтеза ДНК, различных РНК и белка, передачи раздражения и т. п. Физико-химические свойства кариоплазмы обусловлены ее коллоидным характером. Они определяются наличием в ней множества частиц, в совокупности образующих огромную поверхность взаимодействия со средой, что обеспечивает прохождение разнообразных физико-химических процессов.

Химический состав ее крайне сложен и представлен органическими и неорганическими веществами. Основные органические вещества — это белки, углеводы, дезоксирибонуклеиновые и рибонуклеиновые кислоты, жироподобные вещества (липиды). Из простых белков (протеинов) в кариоплазме содержатся гистоны, протамины, альбумины и глобулины, а из протеидов — липопротеиды, глюкопротеиды и нуклеопротеиды. Большая часть белков относится к глобулярным, меньшая — к фибриллярным структурам. Белки глобулярной формы, способные превращаться в фибриллярные, называются структурными.

Из неорганических веществ в кариоплазме обычно содержится большое количество воды (80-85 %), играющей важную роль в жизнедеятельности как ядра, так и клетки. Вода кариоплазмы может находиться в свободном состоянии (в виде растворителя) и быть связанной водородными связями с полярными группами белковых молекул. Другие неорганические вещества кариоплазмы содержатся в виде солей, ионов или в соединении с белками, аминокислотами, углеводами и липидами. Наибольшее значение в построении кариоплазмы имеют элементы — кальций, фосфор, калий и сера. На кариоплазму приходится примерно 20 % массы ядра [5].

Нужна помощь в написании реферата?

Мы — биржа профессиональных авторов (преподавателей и доцентов вузов). Наша система гарантирует сдачу работы к сроку без плагиата. Правки вносим бесплатно.

Цена реферата

1.4. Ядрышко

Ядрышко — это своеобразный центр ядра, его «штаб», где собираются рибосомы и, таким образом, контролируется степень последующих процессов трансляции белков в клетке.

В ядре может быть от одного до нескольких ядрышек, но если ядрышек одно или два, то они более крупные. Они могут иметь различные размеры, форму, плотность и область распределения в зависимости от функциональной активности клетки. Более крупные ядрышки характерны для дифференцированных клеток с высокой активностью синтеза белков. Малодифференцированные клетки обычно имеют несколько мелких ядрышек. Клетки, в которых активность белкового синтеза невелика, имеют мелкие ядрышки с высокой электронной плотностью и интенсивно окрашивающиеся основными красителями.

Основная функция ядрышка — синтез рРНК и субъединиц рибосом. При исследовании ультратонких срезов в электронном микроскопе видно, что ядрышки не гомогенные структуры, а имеют вид элекронно-плотного вещества, формирующего петли. Промежутки между петлями заполнены более светлым веществом. С помощью электронной микроскопии в ядрышке можно выявить несколько компонентов.

Фибриллярный компонент — это тонкофибриллярная структура, состоящая из тончайших нитей различной электронной плотности. Она образована участками слабо конденсированной ДНК, считывающимися с нее молекулами РНК и белками, осуществляющими транскрипцию. Фибриллярный компонент занимает центральные, небольшие по размерам участки вокруг ядрышковых организаторов. В фибриллярном компоненте ядрышка происходит транскрипция рРНК.

Гранулярный (зернистый) компонент — это образующиеся субъединицы рибосом. При большом увеличении электронного микроскопа в гранулярном компоненте видно множество гранул высокой электронной плотности. Располагается между фибриллярными структурами и по периферии ядрышка.

Зону ядрышкового организатора иногда выявляют в центре фибриллярного компонента в виде светлого участка. Вокруг ядрышкового организатора в интерфазу образуется ядрышко. В период митоза зона ядрышкового организатора соответствует области вторичной перетяжки хромосомы.

Нужна помощь в написании реферата?

Мы — биржа профессиональных авторов (преподавателей и доцентов вузов). Наша система гарантирует сдачу работы к сроку без плагиата. Правки вносим бесплатно.

Цена реферата

Зона неактивной ДНК вокруг ядрышка отличается высокой степенью конденсации в виде околоядрышкового гетерохроматина. Предположительно эти зоны являются частями хромосом, которые образуют ядрышко.

Ядрышки значительно изменяются в различные стадии митоза. В конце профазы митоза они исчезают, а находящийся в ядрышках хроматин начинает конденсироваться. С конца профазы до середины телофазы митоза ядрышко содержит в себе только хроматин ядрышкового организатора, что указывает на его низкую активность. Затем этот хроматин деконденсируется и вокруг него формируется плотный фибриллярный материал, содержащий скопление рРНК. Рост ядрышка продолжается до конца телофазы за счет увеличения содержания фибриллярных структур, а затем вокруг них формируется гранулярный компонент. К концу телофазы строение ядрышка близко к таковому в интерфазном ядре, и проявляются признаки нарастающей синтетической активности с образованием новых рибосом [6].

1.5. Хроматин

Хроматином называется содержащий наследственную информацию материал клеточного ядра, представляющий собой сложный функциональный комплекс ДНК со структурными белками и другими элементами, обеспечивающими упаковку, хранение и реализацию кариотического генома. В упрощенной трактовке это вещество, из которого состоят хромосомы. Термин происходит от греческого «хрома» – цвет, краска. Понятие было введено Флемингом еще в 1880 году, но до сих пор идут споры о том, что такое хроматин, с точки зрения биохимического состава. Неопределенность касается небольшой части компонентов, не участвующих в структурировании генетических молекул (некоторые ферменты и рибонуклеиновые кислоты).

С целью определить, что такое хроматин на биохимическом уровне, ученые экстрагировали это вещество из клеток, переводили в раствор и в таком виде изучали компонентный состав и структуру. При этом использовались как химические, так и физические методы, включая технологии электронной микроскопии. Выяснилось, что химический состав хроматина на 40% представлен длинными молекулами ДНК и почти на 60% – различными белками. Последние подразделяются на две группы: гистоны и негистоновые [6].

Глава 2. Функции ядра

Функции ядра связаны с процессами редупликации. В результате формируются абсолютно одинаковые (и в количественном, и в качественном смысле) объемы наследственных данных. В ядрах осуществляется изменение и рекомбинация наследственного материала. Это наблюдается в процессе мейоза. Кроме того, ядра принимают непосредственное участие в распределении ДНК-молекул во время деления клеток.

Во вторую группу входят процессы, связанные непосредственно с формированием аппарата синтеза белка. В эукариотических ядрах происходит образование рибосомных «субъединиц». Это осуществляется за счет комплексирования рибосомных РНК, синтезированных в ядрышке, и рибосомных белков, синтезированных в цитоплазме. Таким образом, ядра являются не только вместилищем наследственных данных, но и местом, где осуществляется воспроизведение этой информации и ее функционирование. В связи с этим нарушение или выпадение любой из перечисленных выше функций является для клетки губительным. Так, например, нарушения в репарационном процессе может спровоцировать изменение первичной структуры ДНК, что автоматически приводит к изменению белковых структур. Это, в свою очередь, безусловно, скажется на специфической активности белков, которая может измениться настолько, что будет не способна обеспечивать основные функции клетки. Это приводит к ее (клетки) гибели. Нарушения в процессе редупликации ДНК останавливают размножение клетки или вызывают появление клеток, обладающих неполноценным набором наследственной информации, что также весьма губительно для структуры в целом. К гибели клетки приводят также нарушения в процессах распределения наследственного материала во время деления. Выпадения вследствие поражений в ядре или в результате расстройства в каких-либо регуляторных процессов синтеза РНК (любой формы) приведет автоматически остановке белкового синтеза либо к возникновению серьезных погрешностей в нем [4].

Нужна помощь в написании реферата?

Мы — биржа профессиональных авторов (преподавателей и доцентов вузов). Наша система гарантирует сдачу работы к сроку без плагиата. Правки вносим бесплатно.

Подробнее

Заключение

Ядро осуществляет две группы общих функций: одну, связанную собственно с хранением генетической информации, другую — с ее реализацией, с обеспечением синтеза белка [3].

В первую группу входят процессы, связанные с поддержанием наследственной информации в виде неизменной структуры ДНК. Эти процессы связаны с наличием так называемых репарационных ферментов, ликвидирующих спонтанные повреждения молекулы ДНК (разрыв одной из цепей ДНК, часть радиационных повреждений), что сохраняет строение молекул ДНК практически неизменным в ряду поколений клеток или организмов. Далее, в ядре происходит воспроизведение или редупликация молекул ДНК, что дает возможность двум клеткам получить совершенно одинаковые и в качественном и в количественном смысле объемы генетической информации. В ядрах происходят процессы изменения и рекомбинации генетического материала, что наблюдается во время мейоза (кроссинговер). Наконец, ядра непосредственно участвуют в процессах распределения молекул ДНК при делении клеток.

Другой группой клеточных процессов, обеспечивающихся активностью ядра, является создание собственно аппарата белкового синтеза. Это не только синтез, транскрипция на молекулах ДНК разных информационных РНК и рибосомных РНК. В ядре эукариотов происходит также образование субъедениц рибосом путем комплексирования синтезированных в ядрышке рибосомных РНК с рибосомными белками, которые синтезируются в цитоплазме и переносятся в ядро.

Таким образом, ядро представляет собой не только вместилище генетического материала, но и место, где этот материал функционирует и воспроизводится. Нарушения редупликации ДНК приведут к остановке размножения клеток или к появлению клеток с неполноценным набором генетической информации, что также губительно для клеток. К такому же результату приведет нарушение процессов распределения генетического материала (молекул ДНК) при делении клеток. Выпадение в результате поражения ядра или в случае нарушений каких-либо регуляторных процессов синтеза любой формы РНК автоматически приведет к остановке синтеза белка в клетке или к грубым его нарушениям.

Список использованных источников

1. Хржановский В.Г. Курс общей ботаники / В.Г. Хржановский – М.: Высшее образование, 1982, — 383 с.
2. Каменский А.А. Введение в общую биологию и экологию / А.А. Каменский – М.: Дрофа, 2002, — 304 с.
3. Ченцов Ю.С. Введение в клеточную биологию / Ю.С. Ченцов – М.: Академкнига, 2004, — 495 с.
4. Сенюкович С. Что такое ядро в биологии [Электронный ресурс]. URL: http://fb.ru/article/230391/cyto-takoe-yadro-v-biologii-stroenie-i-funktsii-yadra (дата обращения: 12.05.2018)
5. Филатов И. Основные функции ядра [Электронный ресурс]. URL: http://fb.ru/article/44044/osnovnyie-funktsii-yadra (дата обращения: 13.05.2018)
6. Окольнова Л. Ядро клетки [Электронный ресурс]. URL: https://distant-lessons.ru/yadro-kletki.html (дата обращения: 20.05.2018)

Органоиды, обнаруженные с помощью электронного микроскопа


Полезная информация

Главная » Статьи и полезные материалы » Микроскопы » Статьи о микроскопах, микропрепаратах и исследованиях микромира » Органоиды, обнаруженные с помощью электронного микроскопа

Органоиды, или органеллы, – это специальные структуры клетки, которые выполняют жизненно важные для нее функции. Эти структуры подобны органам в человеческом организме, отсюда и взялось их название. Органоидов достаточно много, поэтому перечислим лишь некоторые из них: цитоплазма, митохондрии, аппарат Гольджи, лизосомы, вакуоли.

В данной статье мы рассмотрим органоиды, обнаруженные с помощью электронного микроскопа. У самого мощного светового микроскопа разрешающая способность объектива составляет примерно 200 нм. При этом сила разрешения определяется минимальным размером частицы, которую можно разглядеть в микроскоп. Именно поэтому до изобретения электронного микроскопа ряд клеточных органоидов оставался скрытым от глаз исследователей.

Какие органоиды можно увидеть в световой микроскоп? Только самые крупные, если можно так охарактеризовать мельчайшие частицы. Можно разглядеть пластиды и ядро клетки. С появлением электронного микроскопа представления ученых о клетке и ее органоидах существенно изменились, ведь его разрешающая способность достигает значения в 0,1 нм.

Какие органоиды обнаружены с помощью электронного микроскопа

Как выяснилось, у клетки есть и другие немаловажные элементы. В частности, это такие органеллы (постоянные компоненты клетки), как митохондрии и рибосомы, а также части структуры цитоплазмы (аппарат Гольджи, эндоплазматическая сеть). Самыми маленькими из обнаруженных электронным микроскопом органелл клетки считаются рибосомы.

Исследования клеточной структуры, проведенные с использованием электронного микроскопа, наглядно продемонстрировали, что клетку можно считать сложной системой, состоящей из отдельных органоидов, которые невидимы в световой микроскоп.

4glaza.ru
Февраль 2018

Использование материала полностью для общедоступной публикации на носителях информации и любых форматов запрещено. Разрешено упоминание статьи с активной ссылкой на сайт www.4glaza.ru.

Производитель оставляет за собой право вносить любые изменения в стоимость, модельный ряд и технические характеристики или прекращать производство изделия без предварительного уведомления.


Рекомендуемые товары


Смотрите также

Другие обзоры и статьи о микроскопах, микропрепаратах и микромире:

  • Видео! Микроскоп Levenhuk 870T: видеосравнение фильтрованной и нефильтрованной воды (канал MAD SCIENCE, Youtube.com)
  • Видео! Микроскоп Levenhuk 870T: жизнь в капле воды с болота (канал MAD SCIENCE, Youtube.com)
  • Видео! Микроскоп Levenhuk 870T: видео радиоактивной воды (канал MAD SCIENCE, Youtube.com)
  • Видео! Микроскоп Levenhuk 870T: видеообзор (канал MAD SCIENCE, Youtube.com)
  • Видео! Микроскоп Levenhuk 870T: видео соленой воды (канал MAD SCIENCE, Youtube.com)
  • Медицинские микроскопы Levenhuk MED: обзорная статья на сайте levenhuk.ru
  • Видео! Портативный микроскоп Bresser National Geographic 20–40x и другие детские приборы линейки: видеообзор (канал «Татьяна Михеева», Youtube.com)
  • Книги знаний издательства Levenhuk Press: подробный обзор на сайте levenhuk.ru
  • Видео! Книга знаний в 2 томах. «Космос. Микромир»: видеопрезентация (канал LevenhukOnline, Youtube.ru)
  • Видео! Видео бактерий под микроскопом Levenhuk Rainbow 2L PLUS (канал «Микромир под микроскопом», Youtube.ru)
  • Обзор микроскопа Levenhuk Rainbow 50L PLUS на сайте levenhuk.ru
  • Видео! Подробный обзор серии детских микроскопов Levenhuk LabZZ M101 (канал Kent Channel TV, Youtube.ru)
  • Обзор набора оптической техники Levenhuk LabZZ MTВ3 (микроскоп, телескоп и бинокль) на сайте levenhuk.ru
  • Видео! Микроскоп Levenhuk DTX 90: распаковка и видеообзор цифрового микроскопа (канал Kent Channel TV, Youtube.ru)
  • Видео! Видеопрезентация увлекательной и красочной книги для детей «Невидимый мир» (канал LevenhukOnline, Youtube.ru)
  • Видео! Большой обзор биологического микроскопа Levenhuk 3S NG (канал Kent Channel TV, Youtube.ru)
  • Микроскопы Levenhuk Rainbow 2L PLUS
  • Видео! Микроскопы Levenhuk Rainbow и LabZZ (канал LevenhukOnline, Youtube.ru)
  • Микроскоп Levenhuk Rainbow 2L PLUS Lime\Лайм. Изучаем микромир
  • Выбираем лучший детский микроскоп
  • Видео! Микроскопы Levenhuk Rainbow 2L: видеообзор серии микроскопов (канал LevenhukOnline, Youtube.ru)
  • Видео! Микроскопы Levenhuk Rainbow 2L PLUS: видеообзор серии микроскопов (канал LevenhukOnline, Youtube.ru)
  • Видео! Микроскопы Levenhuk Rainbow 50L: видеообзор серии микроскопов (канал LevenhukOnline, Youtube.ru)
  • Видео! Микроскопы Levenhuk Rainbow 50L PLUS: видеообзор серии микроскопов (канал LevenhukOnline, Youtube.ru)
  • Видео! Микроскоп Levenhuk Rainbow D2L: видеообзор цифрового микроскопа (канал LevenhukOnline, Youtube.ru)
  • Видео! Микроскоп Levenhuk Rainbow D50L PLUS: видеообзор цифрового микроскопа (канал LevenhukOnline, Youtube.ru)
  • Обзор биологического микроскопа Levenhuk Rainbow 50L
  • Видео! Видеообзор школьных микроскопов Levenhuk Rainbow 2L и 2L PLUS: лучший подарок ребенку (канал KentChannelTV, Youtube.ru)
  • Видео! Как выбрать микроскоп: видеообзор для любителей микромира (канал LevenhukOnline, Youtube.ru)
  • Галерея фотографий! Наборы готовых микропрепаратов Levenhuk
  • Микроскопия: метод темного поля
  • Видео! «Один день инфузории-туфельки»: видео снято при помощи микроскопа Levenhuk 2L NG и цифровой камеры Levenhuk (канал LevenhukOnline, Youtube.ru)
  • Видео! Обзор микроскопа Levenhuk Rainbow 2L NG Azure на телеканале «Карусель» (канал LevenhukOnline, Youtube.ru)
  • Обзор микроскопа Levenhuk Фиксики Файер
  • Совместимость микроскопов Levenhuk с цифровыми камерами Levenhuk
  • Как работает микроскоп
  • Как настроить микроскоп
  • Как ухаживать за микроскопом
  • Типы микроскопов
  • Техника приготовления микропрепаратов
  • Галерея фотографий! Что можно увидеть в микроскопы Levenhuk Rainbow 50L, 50L PLUS, D50L PLUS
  • Сетка или шкала. Микроскоп и возможность проведения точных измерений
  • Обычные предметы под объективом микроскопа
  • Насекомые под микроскопом: фото с названиями
  • Инфузории под микроскопом
  • Изобретение микроскопа
  • Как выбрать микроскоп
  • Как выглядят лейкоциты под микроскопом
  • Что такое лазерный сканирующий микроскоп?
  • Микроскоп люминесцентный: цена высока, но оправданна
  • Микроскоп для пайки микросхем
  • Иммерсионная система микроскопа
  • Измерительный микроскоп
  • Микроскопы от самых больших профессиональных моделей до простых детских
  • Микроскоп профессиональный цифровой
  • Силовой микроскоп: для серьезных исследований и развлечений
  • Лечение зубов под микроскопом
  • Кровь человека под микроскопом
  • Галогенные лампы для микроскопов
  • Французские опыты – микроскопы и развивающие наборы от Bondibon
  • Наборы препаратов для микроскопа
  • Юстировка микроскопа
  • Микроскоп для ремонта электроники
  • Операционный микроскоп: цена, возможности, сферы применения
  • «Шкаловой микроскоп» – какой оптический прибор так называют?
  • Бородавка под микроскопом
  • Вирусы под микроскопом
  • Принцип работы темнопольного микроскопа
  • Покровные стекла для микроскопа – купить или нет?
  • Увеличение оптического микроскопа
  • Оптическая схема микроскопа
  • Схема просвечивающего электронного микроскопа
  • Устройство оптического микроскопа у теодолита
  • Грибок под микроскопом: фото и особенности исследования
  • Зачем нужна цифровая камера для микроскопа?
  • Предметный столик микроскопа – что это и зачем он нужен?
  • Микроскопы проходящего света
  • Органоиды, обнаруженные с помощью электронного микроскопа
  • Паук под микроскопом: фото и особенности изучения
  • Из чего состоит микроскоп?
  • Как выглядят волосы под микроскопом?
  • Глаз под микроскопом: фото насекомых
  • Микроскоп из веб-камеры своими руками
  • Микроскопы светлого поля
  • Механическая система микроскопа
  • Объектив и окуляр микроскопа
  • USB-микроскоп для компьютера
  • Универсальный микроскоп – существует ли такой?
  • Песок под микроскопом
  • Муравей через микроскоп: изучаем и фотографируем
  • Растительная клетка под световым микроскопом
  • Цифровой промышленный микроскоп
  • ДНК человека под микроскопом
  • Как сделать микроскоп в домашних условиях
  • Первые микроскопы
  • Микроскоп стерео: купить или нет?
  • Как выглядит раковая клетка под микроскопом?
  • Металлографический микроскоп: купить или не стоит?
  • Флуоресцентный микроскоп: цена и особенности
  • Что такое «ионный микроскоп»?
  • Грязь под микроскопом
  • Как выглядит клещ под микроскопом
  • Как выглядит червяк под микроскопом
  • Как выглядят дрожжи под микроскопом
  • Что можно увидеть в микроскоп?
  • Зачем нужны исследовательские микроскопы?
  • Бактерии под микроскопом: фото и особенности наблюдения
  • На что влияет апертура объектива микроскопа?
  • Аскариды под микроскопом: фото и особенности изучения
  • Как использовать микропрепараты для микроскопа
  • Изучаем ГОСТ: микроскопы, соответствующие стандартам
  • Микроскоп инструментальный – купить или нет?
  • Где купить отсчетный микроскоп и зачем он нужен?
  • Атом под электронным микроскопом
  • Как кусает комар под микроскопом
  • Как выглядит муха под микроскопом
  • Амеба: фото под микроскопом
  • Подкованная блоха под микроскопом
  • Вша под микроскопом
  • Плесень хлеба под микроскопом
  • Зубы под микроскопом: фото и особенности наблюдения
  • Снежинка под микроскопом
  • Бабочка под микроскопом: фото и особенности наблюдений
  • Самый мощный микроскоп – как выбрать правильно?
  • Рот пиявки под микроскопом
  • Мошка под микроскопом: челюсти и строение тела
  • Микробы на руках под микроскопом – как увидеть?
  • Вода под микроскопом
  • Как выглядит глист под микроскопом
  • Клетка под световым микроскопом
  • Клетка лука под микроскопом
  • Мозги под микроскопом
  • Кожа человека под микроскопом
  • Кристаллы под микроскопом
  • Основное преимущество световой микроскопии перед электронной
  • Конфокальная флуоресцентная микроскопия
  • Зондовый микроскоп
  • Принцип работы сканирующего зондового микроскопа
  • Почему трудно изготовить рентгеновский микроскоп?
  • Макровинт и микровинт микроскопа – что это такое?
  • Что такое тубус в микроскопе?
  • Главная плоскость поляризатора
  • На что влияет угол между главными плоскостями поляризатора и анализатора?
  • Назначение поляризатора и анализатора
  • Метод изучения – микроскопия на практике
  • Микроскопия осадка мочи: расшифровка
  • Анализ «Микроскопия мазка»
  • Сканирующая электронная микроскопия
  • Методы световой микроскопии
  • Оптическая микроскопия (световая)
  • Световая, люминесцентная, электронная микроскопия – разные методы исследований
  • Темнопольная микроскопия
  • Фазово-контрастная микроскопия
  • Поляризаторы естественного света
  • Шотландский физик, придумавший поляризатор
  • Механизм фокусировки в микроскопе
  • Что такое полевая диафрагма?
  • Микроскоп Микромед: инструкция по эксплуатации
  • Микроскоп Микмед: инструкция по эксплуатации
  • Где найти инструкцию микроскопа «ЛОМО»?
  • Микроскопы Micros: руководство пользователя
  • Какую функцию выполняют зажимы на микроскопе
  • Рабочее расстояние объектива микроскопа
  • Микропрепарат для микроскопа своими руками
  • Метод висячей капли
  • Метод раздавленной капли
  • Тихоходка под микроскопом
  • Аппарат Гольджи под микроскопом
  • Чем занять детей дома?
  • Чем заняться на карантине дома?
  • Чем заняться школьникам на карантине?
  • Выбираем микроскоп: отзывы имеют значение?
  • Микроскоп для школьника: какой выбрать?
  • Немного об оптовой закупке микроскопов и иной оптической техники
  • Во сколько увеличивает лупа?
  • Где купить лампу-лупу – косметологическую модель с подсветкой?
  • Какую купить лампу-лупу для маникюра?
  • Можно ли купить лампу-лупу для наращивания ресниц в интернет-магазине?
  • Лампа-лупа косметологическая на штативе: купить домой или нет?
  • Лупа бинокулярная с принадлежностями
  • Как выглядит лупа для нумизмата?
  • Лупа-лампа – лупа для рукоделия с подсветкой
  • «Лупа на стойке» – что это за оптический прибор?
  • Лупа – проектор для увеличенного изображения
  • Делаем лупу своими руками
  • Основные функции лупы
  • Где найти лупу?
  • Лупа бинокулярная – цена возможностей
  • Лупа канцелярская: выбираем оптическую технику для офиса
  • Как выглядит коронавирус под микроскопом?
  • Как называется главная часть микроскопа?
  • Где купить блоки питания для микроскопа?
  • Строение объектива микроскопа
  • Как выглядят продукты под микроскопом
  • Что покажет музей микроминиатюр
  • Особенности и применение методов окрашивания клеток

Биология клетки — Департамент физической культуры и спорта

В. Н. Селуянов, В. А. Рыбаков, М. П. Шестаков

Глава 1. Модели систем организма

1.1.1. Биология клетки

Клетка — основная структурная единица всех живых организмов, элементарная живая целостная система, которая обладает рядом свойств: воспроизведение, синтез (анаболизм), катаболизм, производство энергии, поглощение, выделение, специфические функции.

Она представляет собой протоплазму, окруженную мембраной. В протоплазме расположено ядро, в котором содержится гены (наследственная информация) в виде молекул ДНК. В протоплазме имеются следующие структурные образования, их еще называют органеллами или органоидами:

    — рибосомы (полирибосомы) — с помощью РНК производится строительство белка, иными словами, разворачиваются анаболические процессы;

    — митохондрии — энергетические станции клетки, в них с помощью кислорода идет превращение жиров или глюкозы в углекислый газ (СО2), воду и энергию, заключенную в молекулах АТФ;

    — эндоплазматическая сеть — или саркоплазматический ретикулум является органеллой, состоящей из мембран и ферментативных систем, прикрепленных к ней;

    — комплекс Гольджи — система мембран, образующих совокупность мешочков и пузырьков, служит для синтеза и выделения веществ из клетки;

    — лизосомы — органеллы в форме пузырьков, содержат ферменты, разрушающие белки до простейших составляющих аминокислот, эти органеллы еще называют пищеварительным аппаратом клетки;

    — глобулы гликогена — источник углеводов в клетке;

    — капельки жира — источник жиров в клетке;

    — специализированные органеллы — структурные компоненты клетки, присущие определенным видам клеток, например, миофибриллы мышечным волокнам.

В клетке разрешается главное противоречие — основа жизнедеятельности, динамическое равновесие между процессами анаболизма и катаболизма. Анаболизм связан с функционированием наследственного аппарата клетки, который управляет синтезем новых органелл, а лизосомы отвечают за катаболизм — разрушение органелл клетки, который существенно усиливается при повышении концентрации ионов водорода в цитоплазме.

Важно заметить, что все процессы анаболизма предопределяются стероидными гормонами. Они соединяются с рецепторами на мембранах клетки, образуют ансамбль «гормон-рецептор», который проникает в ядро и вызывает транскрипцию (расшифровку и считывание) наследственной информации. Так происходит управление анаболизмом. Катаболизм в клетке связан с активностью лизосом, лизосомы усиливают активность с ростом концентрации ионов водорода. В ходе физических упражнений образуется молочная кислота, именно она является ускорителем катаболизма в клетках.



Информио

×

Неверный логин или пароль

×

Все поля являются обязательными для заполнения

×

Сервис «Комментарии» — это возможность для всех наших читателей дополнить опубликованный на сайте материал фактами или выразить свое мнение по затрагиваемой материалом теме.

Редакция Информио.ру оставляет за собой право удалить комментарий пользователя без предупреждения и объяснения причин. Однако этого, скорее всего, не произойдет, если Вы будете придерживаться следующих правил:

  1. Не стоит размещать бессодержательные сообщения, не несущие смысловой нагрузки.
  2. Не разрешается публикация комментариев, написанных полностью или частично в режиме Caps Lock (Заглавными буквами). Запрещается использование нецензурных выражений и ругательств, способных оскорбить честь и достоинство, а также национальные и религиозные чувства людей (на любом языке, в любой кодировке, в любой части сообщения — заголовке, тексте, подписи и пр.)
  3. Запрещается пропаганда употребления наркотиков и спиртных напитков. Например, обсуждать преимущества употребления того или иного вида наркотиков; утверждать, что они якобы безвредны для здоровья.
  4. Запрещается обсуждать способы изготовления, а также места и способы распространения наркотиков, оружия и взрывчатых веществ.
  5. Запрещается размещение сообщений, направленных на разжигание социальной, национальной, половой и религиозной ненависти и нетерпимости в любых формах.
  6. Запрещается размещение сообщений, прямо либо косвенно призывающих к нарушению законодательства РФ. Например: не платить налоги, не служить в армии, саботировать работу городских служб и т.д.
  7. Запрещается использование в качестве аватара фотографии эротического характера, изображения с зарегистрированным товарным знаком и фотоснимки с узнаваемым изображением известных людей. Редакция оставляет за собой право удалять аватары без предупреждения и объяснения причин.
  8. Запрещается публикация комментариев, содержащих личные оскорбления собеседника по форуму, комментатора, чье мнение приводится в статье, а также журналиста.

Претензии к качеству материалов, заголовкам, работе журналистов и СМИ в целом присылайте на адрес

×

Информация доступна только для зарегистрированных пользователей.

×

Уважаемые коллеги. Убедительная просьба быть внимательнее при оформлении заявки. На основании заполненной формы оформляется электронное свидетельство. В случае неверно указанных данных организация ответственности не несёт.

Атлас органоидных клеток | Nature Biotechnology

Проект HCA | Organoid Европейского Союза Horizon 2020 (EU h3020) позволяет нам создать первую версию Атласа клеток органоидов в ближайшие годы, который может выступить в качестве ядра для более широкой совместной глобальной инициативы. В этом пилотном проекте мы генерируем профили транскриптомов отдельных клеток, карты эпигеномов и подробные данные визуализации в отборе органоидов человека. Для двух органов, толстой кишки и мозга, мы получим и охарактеризуем органоиды от 100 индивидуумов с полногеномным секвенированием каждого, чтобы зафиксировать нормальную изменчивость популяции и установить эталон для исследований, ориентированных на заболевание (рис.2а, б). Удобный доступ к одноклеточным данным для органоидов и сравнения профилей органоидов и одноклеточных данных для первичных тканей человека будет доступен на портале Organoid Cell Atlas Portal, который разрабатывается параллельно с генерацией данных.

Рис. 2: Соединение отдельных клеток в органоидах человека и в образцах первичной ткани с помощью Атласа органоидных клеток.

a , Одноклеточное профилирование органоидов человека (слева) и образцов первичной ткани человека (справа) дает дополнительную информацию.Интеграция данных между одноклеточными профилями органоидов и первичных тканей позволяет исследовать один и тот же тип клеток в обоих контекстах, позволяя каждому подходу использовать свои сильные стороны. b , Портал атласа клеток органоидов будет реализовывать ключевые функции для анализа и интерпретации данных об отдельных клетках органоидов человека в биологическом контексте, предоставляемом профилями HCA их аналогов in vivo.

Мы выбрали органоиды толстой кишки и мозга в качестве двух основных областей проекта HCA | Organoid по трем причинам: во-первых, толстая кишка и мозг были одними из первых органов, для которых были продемонстрированы органоиды, поэтому теперь доступны относительно зрелые протоколы; во-вторых, органоиды толстой кишки происходят из взрослых стволовых клеток в первичных образцах ex vivo, тогда как органоиды головного мозга происходят из плюрипотентных клеток, таким образом охватывая два основных источника образования органоидов; в-третьих, органоиды толстой кишки и головного мозга уже использовались для изучения заболеваний, и характеристика этих органоидов на единичных клетках для большого числа людей облегчит их биомедицинские применения.Помимо первоначальной ориентации на органоиды толстой кишки и мозга, проект HCA | Organoid разработан таким образом, что большая часть инфраструктуры данных является общей и применимой к другим типам органоидов человека. Мы активно стремимся к сотрудничеству с другими проектами, направленными на систематическое профилирование отдельных клеток в других типах органоидов человека, чтобы изучить возможность взаимосвязи или интеграции с Атласом клеток органоидов.

Портал атласа клеток органоидов является центральной целью проекта ЕС h3020 HCA | Органоид.Он предоставит вычислительную инфраструктуру и веб-интерфейс, который упростит доступ и анализ одноклеточных данных для органоидов человека. Эти усилия будут основываться на существующей инфраструктуре платформы координации данных HCA (https://data.humancellatlas.org) для представления, обработки, аннотации и поиска данных. Ключевые особенности, характерные для органоидов, будут включать интерактивное исследование данных по органоидам человека, выбор органоидов на основе данных для функциональных экспериментов и сравнение органоидов, специфичных для болезни, с эталонными коллекциями нормальных органоидов.

Портал атласа клеток органоидов также предоставит интерактивные сопоставления между одноклеточными профилями органоидов человека и соответствующими первичными тканями, доступными в пределах HCA, с использованием алгоритмов, которые позволяют выравнивать клетки-клетки между этими наборами данных. Эта функция облегчит и будет стимулировать использование органоидов в качестве модели для подробных биологических экспериментов, включая идентификацию генов-мишеней для механистических исследований и разработки лекарств. Картирование и интеграция данных также позволит исследовать нормальные вариации между людьми (например, из-за общих генетических различий) в интерактивном режиме, используя органоиды в качестве модели для соответствующей вариации в первичных тканях.Наконец, выравнивание клетки-клетки облегчит анализ и интерпретацию возмущений в органоидах человека в контексте соответствующих первичных тканей.

Мы будем следовать нескольким дополнительным стратегиям, чтобы обеспечить максимально возможное качество и воспроизводимость данных в Атласе клеток органоидов. Во-первых, мы будем инвестировать в стандартизацию и валидацию экспериментальных рабочих процессов для получения органоидов — например, путем сравнения альтернативных протоколов и оценки относительного влияния технических и биологических факторов на одноклеточные профили органоидов толстой кишки и головного мозга.Во-вторых, мы будем способствовать усилиям HCA по созданию стандартов сообщества и инфраструктуры программного обеспечения для обработки данных и аннотации данных — например, путем обеспечения совместимости с конкретной структурой метаданных для органоидов. В-третьих, мы будем разрабатывать и проверять вычислительные методы для гибкого выравнивания и сравнения клеток между органоидами и соответствующей первичной тканью. Наконец, мы внедрим интерактивные инструменты визуализации, которые обеспечат удобный для пользователя контроль качества и исследовательский анализ наборов данных одноклеточных органоидов, внесенных в Атлас клеток органоидов.

Чтобы максимизировать полезность и влияние проекта ЕС h3020 HCA | Organoid для более широкого научного сообщества, профили отдельных клеток будут публиковаться как можно быстрее в соответствии с твердой приверженностью HCA к обмену данными, местным этическим нормам и Европейский закон о защите данных (GDPR). Недавно созданные органоиды будут предоставлены в виде «живого биобанка» через Hubrecht Organoid Technology 14 (толстая кишка) или в виде набора точных протоколов для получения из линий индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, созданных биобанками (мозг).Кроме того, мы будем оценивать и исследовать практическую полезность Атласа органоидных клеток в серии экспериментальных исследований, ориентированных на заболевание, с целью проведения скрининга CRISPR с считыванием одноклеточного транскриптома (CROP-seq) 15 и моделирования заболеваний генетической эпилепсии с использованием мозга. органоиды, выбранные из Атласа клеток органоидов. Наконец, мы стремимся превратить портал атласа клеток органоидов в общедоступную, устойчивую и широко используемую инфраструктуру для поиска, доступа, анализа и интерпретации данных об отдельных клетках органоидов человека.

Органоид против сфероида: в чем разница?

Органоиды и сфероиды могут производить in vivo — , как итерации культур in vitro, , но у них есть уникальные применения, и различные лабораторные сценарии могут потребовать различных многоклеточных структур.

Применение органоидов

Органоидная технология успешно применяется в персонализированной медицине — при моделировании заболеваний, а также при оптимизации открытия лекарств и регенеративной медицины.Применение органоидов в исследованиях CRISPR может помочь ученым лучше изучать развитие органов в контексте редактирования генов.

Специально для исследований рака, трехмерные органоиды могут дать представление о мутационных сигнатурах отдельных видов рака, поскольку они могут имитировать патофизиологию опухолей человека.

Органоиды также могут функционировать как самоорганизующееся миниатюрное проявление родительского органа, что может принести особую пользу исследователям. Например, нейральных органоидов приближают нас к пониманию заболеваний головного мозга, в то время как исследователи изучили кишечных органоида , чтобы лучше понять муковисцидоз.

Приложения Spheroid

Возможно, наиболее примечательно то, что опухолевых сфероидов могут помочь ученым понять микроокружений опухолей in vivo , что может помочь исследователям предсказать эффективность лекарств в исследованиях рака. Самыми ранними версиями сфероидов были , разработанные в 1970-х годах. для изучения воздействия лучевой терапии на опухолевые клетки человека.

Сфероиды также могут использоваться в исследованиях стволовых клеток для создания эмбриоидных тел из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, которые затем могут быть превращены в нейральные стволовые клетки высокой чистоты, полезные при изучении нервных заболеваний и связанных с ними методов лечения.

Ученые также использовали опухолевые сфероиды для изучения цитотоксических эффектов CAR-T-клеток — например, с помощью анализа цитотоксичности KILR ® , разработанного DiscoverX. Когда клетки CAR-T выращивают в опухолевых сфероидах, трансдуцированных KILR, ученые могут формировать, культивировать и анализировать на той же микропланшете сфероида .

Получение аркуатных органоидов гипоталамуса из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток

.2021 2 сентября; 28 (9): 1657-1670.e10. DOI: 10.1016 / j.stem.2021.04.006. Epub 2021 6 мая. Вэй-Кай Хуанг 1 , Самуэль Чжэн Хао Вонг 2 , Sarshan R Pather 3 , Phuong T T Nguyen 4 , Фэн Чжан 5 , Даниэль И Чжан 6 , Чжицзянь Чжан 5 , Лу Лу 5 , Ванки Фанг 5 , Луюнь Чен 5 , Анализа Фернандес 5 , Ицзин Су 5 , Сон Хунцзюнь 7 , Го-Ли Мин 8

Принадлежности Расширять

Принадлежности

  • 1 Отделение неврологии и Институт нейронаук Махони, Медицинская школа Перельмана, Университет Пенсильвании, Филадельфия, Пенсильвания 19104, США; Аспирантура по патобиологии, Медицинский факультет Университета Джона Хопкинса, Балтимор, Мэриленд 21205, США.
  • 2 Отделение нейробиологии и Институт нейронаук Махони, Медицинская школа Перельмана, Университет Пенсильвании, Филадельфия, Пенсильвания 19104, США; Аспирантура по клеточной и молекулярной медицине, Медицинский факультет Университета Джона Хопкинса, Балтимор, Мэриленд 21205, США.
  • 3 Выпускник отделения клеточной и молекулярной биологии, Медицинская школа Перельмана, Университет Пенсильвании, Филадельфия, Пенсильвания 19104, США.
  • 4 Группа выпускников неврологии, Медицинская школа Перельмана, Университет Пенсильвании, Филадельфия, Пенсильвания 19104, США.
  • 5 Отделение нейробиологии и Институт нейробиологии Махони, Медицинская школа Перельмана, Университет Пенсильвании, Филадельфия, Пенсильвания 19104, США.
  • 6 Группа выпускников биохимии и молекулярной биофизики, Медицинская школа Перельмана, Университет Пенсильвании, Филадельфия, Пенсильвания 19104, США.
  • 7 Отделение нейробиологии и Институт нейронаук Махони, Медицинская школа Перельмана, Университет Пенсильвании, Филадельфия, Пенсильвания 19104, США; Департамент клеточной биологии и биологии развития, Медицинская школа Перельмана, Университет Пенсильвании, Филадельфия, Пенсильвания 19104, США; Институт регенеративной медицины Медицинской школы Перельмана Пенсильванского университета, Филадельфия, Пенсильвания, 19104, США; Институт эпигенетики Медицинской школы Перельмана Пенсильванского университета, Филадельфия, Пенсильвания, 19104, США.
  • 8 Отделение нейробиологии и Институт нейробиологии Махони, Медицинская школа Перельмана, Университет Пенсильвании, Филадельфия, Пенсильвания 19104, США; Департамент клеточной биологии и биологии развития, Медицинская школа Перельмана, Университет Пенсильвании, Филадельфия, Пенсильвания 19104, США; Институт регенеративной медицины Медицинской школы Перельмана Пенсильванского университета, Филадельфия, Пенсильвания, 19104, США; Отделение психиатрии Медицинской школы Перельмана Пенсильванского университета, Филадельфия, Пенсильвания, 19104, США.Электронный адрес: [email protected]

Элемент в буфере обмена

Wei-Kai Huang et al. Стволовая клетка клетки. .

Показать детали Показать варианты

Показать варианты

Формат АннотацияPubMedPMID

.2021 2 сентября; 28 (9): 1657-1670.e10. DOI: 10.1016 / j.stem.2021.04.006. Epub 2021 6 мая.

Авторы

Вэй-Кай Хуанг 1 , Самуэль Чжэн Хао Вонг 2 , Sarshan R Pather 3 , Phuong T T Nguyen 4 , Фэн Чжан 5 , Даниэль И Чжан 6 , Чжицзянь Чжан 5 , Лу Лу 5 , Ванки Фанг 5 , Луюнь Чен 5 , Анализа Фернандес 5 , Ицзин Су 5 , Сон Хунцзюнь 7 , Го-Ли Мин 8

Принадлежности

  • 1 Отделение неврологии и Институт нейронаук Махони, Медицинская школа Перельмана, Университет Пенсильвании, Филадельфия, Пенсильвания 19104, США; Аспирантура по патобиологии, Медицинский факультет Университета Джона Хопкинса, Балтимор, Мэриленд 21205, США.
  • 2 Отделение нейробиологии и Институт нейронаук Махони, Медицинская школа Перельмана, Университет Пенсильвании, Филадельфия, Пенсильвания 19104, США; Аспирантура по клеточной и молекулярной медицине, Медицинский факультет Университета Джона Хопкинса, Балтимор, Мэриленд 21205, США.
  • 3 Выпускник отделения клеточной и молекулярной биологии, Медицинская школа Перельмана, Университет Пенсильвании, Филадельфия, Пенсильвания 19104, США.
  • 4 Группа выпускников неврологии, Медицинская школа Перельмана, Университет Пенсильвании, Филадельфия, Пенсильвания 19104, США.
  • 5 Отделение нейробиологии и Институт нейробиологии Махони, Медицинская школа Перельмана, Университет Пенсильвании, Филадельфия, Пенсильвания 19104, США.
  • 6 Группа выпускников биохимии и молекулярной биофизики, Медицинская школа Перельмана, Университет Пенсильвании, Филадельфия, Пенсильвания 19104, США.
  • 7 Отделение нейробиологии и Институт нейронаук Махони, Медицинская школа Перельмана, Университет Пенсильвании, Филадельфия, Пенсильвания 19104, США; Департамент клеточной биологии и биологии развития, Медицинская школа Перельмана, Университет Пенсильвании, Филадельфия, Пенсильвания 19104, США; Институт регенеративной медицины Медицинской школы Перельмана Пенсильванского университета, Филадельфия, Пенсильвания, 19104, США; Институт эпигенетики Медицинской школы Перельмана Пенсильванского университета, Филадельфия, Пенсильвания, 19104, США.
  • 8 Отделение нейробиологии и Институт нейробиологии Махони, Медицинская школа Перельмана, Университет Пенсильвании, Филадельфия, Пенсильвания 19104, США; Департамент клеточной биологии и биологии развития, Медицинская школа Перельмана, Университет Пенсильвании, Филадельфия, Пенсильвания 19104, США; Институт регенеративной медицины Медицинской школы Перельмана Пенсильванского университета, Филадельфия, Пенсильвания, 19104, США; Отделение психиатрии Медицинской школы Перельмана Пенсильванского университета, Филадельфия, Пенсильвания, 19104, США.Электронный адрес: [email protected]

Элемент в буфере обмена

Полнотекстовые ссылки Опции CiteDisplay

Показать варианты

Формат АннотацияPubMedPMID

Абстрактный

Органоиды человеческого мозга представляют собой замечательную платформу для повторения особенностей развития человеческого мозга и болезней.Существующие модели органоидов не позволяют выявить мелкие субрегионы мозга, такие как различные ядра в гипоталамусе. Мы сообщаем о создании дугообразных органоидов (ARCO) из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) для моделирования развития дугообразного ядра гипоталамуса человека. Одноклеточное секвенирование РНК ARCO выявило значительную молекулярную гетерогенность, лежащую в основе различных дугообразных типов клеток, а анализ с помощью машинного обучения, основанный на одноядерном транскриптоме неонатального человеческого гипоталамуса, также показал молекулярную сигнатуру дугообразного ядра человека.Мы также исследовали ARCO, полученные из ИПСК пациентов с синдромом Прадера-Вилли (PWS). Эти органоиды демонстрируют аберрантную дифференцировку и транскриптомную дисрегуляцию, сходную с постнатальным гипоталамусом пациентов с СПВ, что свидетельствует о дефиците клеточной дифференцировки и обострении воспалительных реакций. Таким образом, полученные из ИПСК пациентов ARCOs представляют собой многообещающую экспериментальную модель для исследования специфичных для ядра особенностей и механизмов, связанных с заболеванием, во время раннего дугообразного развития человека.

Ключевые слова: ИПСК пациентов с СПВ; Синдром Прадера-Уиллиса; дугообразное ядро; дугообразные органоиды; одноклеточная РНК-последовательность человеческого гипоталамуса; ИПСК человека; гипоталамус; машинное обучение; трансплантация.

Copyright © 2021 Elsevier Inc. Все права защищены.

Заявление о конфликте интересов

Декларация интересов G.M. входит в консультативный совет Cell Stem Cell. Авторы не заявляют о других конкурирующих интересах.

Похожие статьи

  • Изменчивость полностью метилированного статуса 15q11.2 в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках, полученных от пациента с синдромом Прадера-Вилли.

    Окуно Х., Накабаяши К., Абе К., Андо Т., Саносака Т., Кохьяма Дж., Акамацу В., Охьяма М., Такахаши Т., Косаки К., Окано Х. Окуно Х. и др. Congenit Anom (Киото). 2017 июл; 57 (4): 96-103. DOI: 10.1111 / cga.12206. Epub 2017 22 марта. Congenit Anom (Киото). 2017 г. PMID: 28004416

  • Сравнительный транскриптомный анализ церебральных органоидов и культур корковых нейронов, полученных из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток.

    Катурия А., Лопес-Ленговски К., Ватмафф Б., Кармачарья Р. Kathuria A, et al. Stem Cells Dev. 2020 1 ноября; 29 (21): 1370-1381. DOI: 10.1089 / scd.2020.0069. Epub 2020 22 сен. Stem Cells Dev. 2020. PMID: 32862797

  • Прогрессирующее постнатальное снижение чувствительности к лептину дугообразных гипоталамических нейронов в модели синдрома Прадера-Вилли у мышей с нулевым Magel2.

    Правдивый И., Баллани К., Колмерс В.Ф., Веврик Р. Правдивый И. и др. Hum Mol Genet. 2015 1 августа; 24 (15): 4276-83. DOI: 10,1093 / hmg / ddv159. Epub 2015 29 апреля. Hum Mol Genet. 2015 г. PMID: 25926624

  • Трехмерные органоиды мозга, полученные из плюрипотентных стволовых клеток: многообещающие экспериментальные модели развития мозга и нейродегенеративных расстройств.

    Ли CT, Бендрим RM, Wu WW, Shen RF.Ли CT и др. J Biomed Sci. 2017 20 августа; 24 (1): 59. DOI: 10.1186 / s12929-017-0362-8. J Biomed Sci. 2017 г. PMID: 28822354 Бесплатная статья PMC. Рассмотрение.

  • Продвижение открытия лекарств для неврологических расстройств с использованием нейронных органоидов, полученных из ИПСК.

    Costamagna G, Comi GP, Corti S. Costamagna G, et al. Int J Mol Sci. 2021 6 марта; 22 (5): 2659. DOI: 10.3390 / ijms22052659.Int J Mol Sci. 2021 г. PMID: 33800815 Бесплатная статья PMC. Рассмотрение.

Процитировано

1 артикул
  • Сложная конструкция органов из плюрипотентных стволовых клеток человека для биологических исследований и моделирования заболеваний с использованием новых методов.

    Мацумото Р., Ямамото Т., Такахаши Ю.Мацумото Р. и др. Int J Mol Sci. 2021 22 сентября; 22 (19): 10184. DOI: 10.3390 / ijms221

    4. Int J Mol Sci. 2021 г. PMID: 34638524 Бесплатная статья PMC. Рассмотрение.

Типы публикаций

  • Научно-исследовательская поддержка, N.I.H., заочная форма
  • Поддержка исследований, за пределами США. Правительство

Условия MeSH

  • Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки *

LinkOut — дополнительные ресурсы

  • Полнотекстовые источники

  • Другие источники литературы

  • Медицинские

[Икс]

цитировать

Копировать

Формат: AMA APA ГНД NLM

Долгосрочная визуализация в реальном времени и многомасштабный анализ выявляют гетерогенность и основные принципы морфогенеза эпителиальных органоидов | BMC Biology

Долгосрочная визуализация в реальном времени с помощью LSFM позволяет детально визуализировать динамические процессы в морфогенезе органоидов и выявлять высокую гетерогенность в поведении отдельных клеток и отдельных органоидов

Чтобы получить более глубокое представление о динамических клеточных процессах, происходящих в органоидных системах, мы разработали держатели кювет Z1-FEP для визуализации в реальном времени с помощью Zeiss Lightsheet Z.1 микроскопическая система (дополнительный файл 3: рис. S2). Как описано ранее [16], ультратонкие кюветы из FEP-фольги являются держателями образцов для LSFM, которые сохраняют физиологические условия культивирования органоидных культур и позволяют получать изображения с высоким разрешением на уровне отдельных клеток. Используя кювету Z1-FEP, мы зарегистрировали образование и развитие hCCAO, экспрессирующих h3B-eGFP (ядерный маркер) и LifeAct-mCherry (F-actin цитоскелетный маркер), и mPOs, экспрессирующие Rosa26-nTnG (ядерный маркер), в течение до 7 дней.Среду меняли каждые 48 ч для обеспечения достаточного количества питательных веществ. Температуру и уровни CO 2 контролировали для обеспечения оптимальных условий роста (дополнительный файл 4: рис. S3, дополнительный файл 5: рис. S4). Установка позволила нам контролировать динамические процессы с высоким временным и пространственным разрешением до 120 органоидов, одновременно содержащихся в одной кювете Z1-FEP (в данном примере в общем объеме 5,2 мм 3 из технически возможных 8 мм 3 ) (Дополнительный файл 6: рис.S5a, Дополнительный файл 7: Рис. S6; Дополнительный файл 15: Видео 1). Изображения, полученные LSFM, позволяют проводить детальные качественные проверки и детальное отслеживание характеристик нескольких динамических клеточных процессов при разрешении одной клетки (дополнительный файл 16: видео 2).

Визуальный осмотр полученных данных показал, что первоначально засеянные кластеры органоидных клеток сокращаются до того, как клетки внутри кластеров начинают перестраиваться и формировать сферические структуры (Рис. 1, Формирование). Клетки в этих сферических структурах начинают поляризоваться и образовывать просвет (в этом примере около 13.5 ч), на что указывает более сильный сигнал F-актина на апикальной (просветной) стороне клеточных мембран. Потенциально мертвые клетки накапливаются в просвете, на что указывает потеря сигнала LifeAct-mCherry и меньшие ядра с более сильными сигналами h3B-eGFP, что указывает на апоптотическую ядерную конденсацию [29]. Поляризация клеток в эпителиальном монослое сохраняется во время расширения просвета и все еще отчетливо видна на более поздних стадиях развития органоидов (в этом примере около 41,0 ч) (рис.1, поляризация). Мы также наблюдали колебания размеров (Дополнительный файл 1: Определения) во время расширения просвета, когда органоид раздувается, а затем внезапно схлопывается примерно до своего первоначального размера, прежде чем снова начинает расширяться (Рис. 1, Колебания размера). Интервал регистрации 30 мин также позволяет нам визуально отслеживать события одноклеточного деления (здесь: в течение 2,5 ч) (рис. 1, деление клеток). Мы также смогли наблюдать события поляризации и деления клеток в изолированных одиночных клетках (дополнительный файл 6: рис.S5b), которые оставались бездействующими в течение относительно длительных периодов времени во время наблюдений, но в конечном итоге начали образовывать органоиды. Мы определили общее сокращение органоида, ядерную конденсацию и затухание сигнала ядер как признаки дегенерации органоида (Дополнительный файл 1: Определения) (Рис. 1, Дегенерация; Дополнительный файл 15: Видео 1). Этот процесс начинается после продолжительного культивирования без дальнейшей замены среды (здесь: примерно через 100 часов).

Рис. 1

Живые LSFM-записи с временным разрешением для подробных качественных исследований динамических морфологических процессов в развитии органоидов.hCCAO и mPO были засеяны в кюветы Z1-FEP для долговременных живых наблюдений. Они экспрессировали ядерный маркер h3B-eGFP (пурпурный) или Rosa26-nTnG (серый) и цитоскелетный маркер F-актина LifeAct-mCherry (зеленый). Около 120 органоидов были зарегистрированы в стопках изображений глубиной до 900 z плоскостей в течение не более 7 дней. На рисунке показаны фрагменты максимальной интенсивности z -проекций. Микроскоп: Zeiss Lightsheet Z.1; линзы объектива: обнаружение: W Plan-Apochromat × 20 / 1.0, освещение: Zeiss LSFM × 10/0.2; лазерные линии: 488 нм, 561 нм; фильтры: лазерный блочный фильтр (LBF) 405/488/561; размер вокселя: 1,02 × 1,02 × 2,00 мкм 3 ; интервал записи: 30 мин; масштабные линейки: 50 мкм, 25 мкм (вставка)

Дополнительный файл 15: Видео 1. Наблюдения с временным разрешением за эпителиальными органоидами, растущими в кюветах Z1-FEP. hCCAO, экспрессирующие h3B-eGFP в качестве маркера ядра (красный) и LifeAct-mCherry в качестве маркера цитоскелета F-актина (зеленый), и mPO, экспрессирующие Rosa26-nTnG (серый) в качестве маркера ядра, были зарегистрированы в течение 10 часов и 143 часов соответственно.Можно проследить образование органоидов из первоначально засеянных кластеров клеток, включая сокращение кластеров клеток, поляризацию клеток, образование и расширение просвета. Примерно через 100 часов наблюдения некоторые мПО начинают проявлять признаки дегенерации из-за продолжительного культивирования без дальнейшей замены среды. Эти признаки дегенерации включают общее сокращение органоида с последующей ядерной конденсацией и исчезновением сигнала ядра. Временная потеря сигнала во время сбора данных происходит из-за испарения и последующей постоянной потери монтажной среды в камере формирования изображения.Заправка вручную восстановила оптимальные условия для сбора. Потеря монтажной среды не изменяет органоиды внутри кюветы, поскольку кювета отделяет монтажную среду от среды для роста органоидов. Микроскоп: Zeiss Lightsheet Z.1; объектив обнаружения: W Plan-Apochromat 20x / 1.0, световой объектив: Zeiss LSFM 10x / 0,2; лазерные линии: 488 нм, 561 нм; фильтры: лазерный блочный фильтр (LBF) 405/488/561; размер вокселя: 1,02 × 1,02 × 2,00 мкм 3 ; интервал записи: 30 мин; масштабная линейка: 50 мкм.(MP4 10 289 кб)

Дополнительный файл 16: Видео 2. Трехмерная объемная визуализация с временным разрешением процесса формирования всей органоидной культуры, наблюдаемой в одной кювете Z1-FEP. hCCAO, экспрессирующие h3B-eGFP в качестве маркера ядра (красный) и LifeAct-mCherry в качестве маркера цитоскелета F-актина (зеленый), были визуализированы в течение 5 дней. В фильме показан отрывок из первых 10 часов записанного набора данных. Все органоиды в кювете были сегментированы и отслеживались в течение первых 10 часов записи.Показаны начальные процессы сокращения клеточного кластера, образования просвета и последующего расширения. В зависимости от начального размера кластера клеток органоиды различаются по времени, необходимому для образования просвета. Изменяющиеся цвета указывают на новый сегментированный объект в каждый момент времени. Сегментация и отслеживание служат только для визуализации поведения органоидов на уровне отдельной клетки и не оцениваются и не контролируются вручную. Следовательно, сегментированная клетка может исчезнуть из-за неправильной сегментации, или клетка теряет свой сигнал при гибели клетки.Микроскоп: Zeiss Lightsheet Z.1; объектив обнаружения: W Plan-Apochromat 20x / 1.0, световой объектив: Zeiss LSFM 10x / 0,2; лазерные линии: 488 нм, 561 нм; фильтры: лазерный блочный фильтр (LBF) 405/488/561; размер вокселя: 1,02 × 1,02 × 2,00 мкм 3 ; интервал записи: 30 мин; Программное обеспечение для 3D-рендеринга и отслеживания: Arivis Vision4D. (MP4 88,754 кб)

Сегментация на основе изображений и трехмерная (3D) объемная визуализация полученных данных позволяют еще более детально изучить особенности, наблюдаемые в высокодинамичной системе органоидов.В то время как большинство процессов уже можно наблюдать в проекциях с максимальной интенсивностью z полученных данных изображения, трехмерный объемный рендеринг способствует более детальному пониманию лежащей в основе клеточной динамики с различных точек зрения. Мы определили, что слияние органоидов является частым явлением в исследованных культурах (рис. 2, слияние; дополнительный файл 17: видео 3). После того, как эпителиальные монослои обоих органоидов соприкасаются друг с другом, они открывают отверстие, соединяющее оба просвета. Это отверстие затем расширяется, в то время как клетки мигрируют в один связанный монослой.Аналогичная динамика миграции клеток в один связанный монослой наблюдалась при формировании, последующей ретракции и возможном разрыве протоковидных структур в просвете большого органоида (диаметром ≥ 500 мкм), предположительно возникшего в результате слияния нескольких органоидов (дополнительный файл 1: Определения) (Рис. 2, Световая динамика — нижняя панель ; Дополнительный файл 18: Видео 4, Дополнительный файл 19: Видео 5). В других примерах отдельные органоиды демонстрируют аналогичное поведение, которое можно описать как сужение просвета, спонтанное «почкование» или образование протоковой структуры (дополнительный файл 8: рис.S7 и Дополнительный файл 9: Рис. S8). Объемная визуализация ядер клеток показала, что маленькие органоиды (диаметр в конце наблюдения (48 ч): 100 мкм) с большими ядрами (самая длинная ось: 52 мкм) показывают меньше клеточных делений и в целом меньшее движение клеток, чем более крупные органоиды (диаметр в конце наблюдение (48 ч): 180 мкм) с меньшими ядрами (самая длинная ось: 32 мкм) (дополнительный файл 20: видео 6). Это еще раз подчеркивает неоднородность исследованных систем органоидов.

Рис. 2

Высококачественные данные изображения LSFM в реальном времени обеспечивают отличную основу для объемного рендеринга и подробного отслеживания функций.Его можно использовать для количественного описания клеточной динамики в развитии органоидов. 3D-рендеринг предлагает подробные представления о таких процессах, как слияние органоидов, и проясняет пространственный контекст в наблюдаемой динамике просвета. Трехмерное отслеживание клеток показывает сложное вращение монослоя эпителиальных клеток. hCCAO (засеянные и сохраненные в кюветах Z1-FEP) экспрессировали ядерный маркер h3B-eGFP (пурпурный) и цитоскелетный маркер F-актина LifeAct-mCherry (зеленый). На рисунке показаны сегментированные и отслеживаемые ядра клеток (вращение; центроиды — красный; дорожки — радуга), фрагменты максимальной интенсивности z -проекции и трехмерные изображения соответствующих наборов данных.Сегментация, отслеживание и 3D-рендеринг выполнялись с помощью Arivis Vision4D. Микроскоп: Zeiss Lightsheet Z.1; линзы объектива: детектирование: W Plan-Apochromat × 20 / 1.0, освещение: Zeiss LSFM × 10 / 0.2; лазерные линии: 488 нм, 561 нм; фильтры: лазерный блочный фильтр (LBF) 405/488/561; размер вокселя: 1,02 × 1,02 × 2,00 мкм 3 ; интервал записи: 30 мин; масштабные линейки: Fusion, Migration — 50 мкм, Luminal Dynamics — 100 мкм, 50 мкм (вставка)

Дополнительный файл 17: Видео 3. Объемный 3D-рендеринг с временным разрешением процесса слияния двух органоидов. hCCAO, экспрессирующие h3B-eGFP в качестве маркера ядра (красный) и LifeAct-mCherry в качестве маркера цитоскелета F-актина (зеленый), регистрировали в кювете Z1-FEP в течение 5 дней. В фильме показан отрывок из записанных данных за 12 часов, охватывающих процесс слияния двух органоидов. Процесс слияния визуализируется трехмерной объемной визуализацией данных, полученных для маркера цитоскелета (LifeAct-mCherry — зеленый). После соприкосновения эпителиальных монослоев обоих органоидов они начинают образовывать отверстие, соединяющее оба просвета в течение одного часа.Это отверстие затем расширяется, в то время как клетки мигрируют в один связанный монослой. Микроскоп: Zeiss Lightsheet Z.1; объектив обнаружения: W Plan-Apochromat 20x / 1.0, световой объектив: Zeiss LSFM 10x / 0,2; лазерные линии: 488 нм, 561 нм; фильтры: лазерный блочный фильтр (LBF) 405/488/561; размер вокселя: 1,02 × 1,02 × 2,00 мкм 3 ; интервал записи: 30 мин; Программное обеспечение для 3D-рендеринга: Arivis Vision4D. (MP4 37 946 кб)

Дополнительный файл 18: Видео 4. Трехмерная объемная визуализация динамики внутриорганоидного просвета с временным разрешением. hCCAO, экспрессирующие h3B-eGFP в качестве маркера ядра (красный) и LifeAct-mCherry в качестве маркера цитоскелета F-актина (зеленый), регистрировали в кювете Z1-FEP в течение всего 132 часов. В фильме показаны данные, записанные между 84 и 108 часами. Люминальная динамика визуализируется с помощью трехмерной объемной визуализации данных, полученных для маркера цитоскелета (LifeAct-mCherry — зеленый) большого органоида (диаметр: ≥ 500 мкм), предположительно образованного после слияния нескольких органоидов.Мы можем проследить формирование, последующую ретракцию и возможный разрыв протоковидных структур в просвете органоида. Микроскоп: Zeiss Lightsheet Z.1; объектив обнаружения: W Plan-Apochromat 20x / 1.0, световой объектив: Zeiss LSFM 10x / 0,2; лазерные линии: 488 нм, 561 нм; фильтры: лазерный блочный фильтр (LBF) 405/488/561; размер вокселя: 1,02 × 1,02 × 2,00 мкм 3 ; интервал записи: 30 мин; Программное обеспечение для 3D-рендеринга: Arivis Vision4D.

Дополнительный файл 19: Видео 5. Трехмерный объемный рендеринг с временным разрешением растущего органоида печени с сегментацией и отслеживанием клеток. hCCAO, экспрессирующие h3B-eGFP в качестве маркера ядра (красный) и LifeAct-mCherry в качестве маркера цитоскелета F-актина (зеленый), регистрировали в кювете Z1-FEP в течение всего 132 часов. В фильме показаны данные, записанные между 84 и 108 часами. Красные сферы иллюстрируют отслеживаемые ядра клеток, а линии цвета радуги указывают пройденные пути (цветовой код: от красного к синему — временные точки с 84 по 108). Показано как одиночное, так и множественное отслеживание органоидов.Видны вращение, а также однонаправленные движения клеток. Микроскоп: Zeiss Lightsheet Z.1; объектив обнаружения: W Plan-Apochromat 20x / 1.0, световой объектив: Zeiss LSFM 10x / 0,2; лазерные линии: 488 нм, 561 нм; фильтры: лазерный блочный фильтр (LBF) 405/488/561; размер вокселя: 1,02 × 1,02 × 2,00 мкм 3 ; интервал записи: 30 мин; Программное обеспечение для 3D-рендеринга и отслеживания: Arivis Vision4D. (MP4 36,759 кб)

Дополнительный файл 20: Видео 6. Изменение скорости вращения соседних органоидов. На видео показаны два мПО в виде выдержки из всей культуры, выращенной в одной кювете Z1-FEP. Органоиды экспрессировали Rosa26-nTnG (серый цвет) в качестве маркера ядра, и их изображение отображалось в течение 20 часов. Помимо различий в размере ядер, оба органоида демонстрируют разное поведение. Отслеживание клеток выявило вращательное движение монослоя эпителиальных клеток органоида с маленькими округлыми ядрами и отсутствие вращательного движения органоида с большими удлиненными клеточными ядрами.Два органоида находятся в тесном контакте, но не сливаются и не взаимодействуют друг с другом. Микроскоп: Zeiss Lightsheet Z.1; объектив обнаружения: W Plan-Apochromat 20x / 1.0, световой объектив: Zeiss LSFM 10x / 0,2; лазерные линии: 488 нм, 561 нм; фильтры: лазерный блочный фильтр (LBF) 405/488/561; размер вокселя: 1,02 × 1,02 × 2,00 мкм 3 ; интервал записи: 30 мин; Программное обеспечение для 3D-рендеринга и сегментации: Arivis Vision4D. (MP4 61,855 кб)

Наблюдаемые гетерогенные динамические процессы в органоидах и системах органоидов были дополнительно визуализированы с помощью инструментов отслеживания признаков.Отслеживание отдельных клеток показало, что ранее наблюдаемое движение клеток в более крупных органоидах с меньшими ядрами клеток можно описать как равномерное вращение монослоя эпителиальных клеток (рис. 2, вращение; дополнительный файл 18: видео 5, дополнительный файл 20: видео 6 ). Более того, мы наблюдали, что до образования органоидов некоторые из первоначально засеянных кластеров клеток мигрируют через ECM, прежде чем они начинают формировать сферическую структуру (Fig. 2, Migration; Additional file 21: Video 7). В этом примере (дополнительный файл 21: видео 7) кластер ячеек перемещается со средней скоростью 10 мкм в час (максимальная скорость: 23 мкм в час), покрывая в целом расстояние около 250 мкм.Дополнительные примеры всех описанных процессов, происходящих в культурах hCCAO и mPO, показаны в дополнительных файлах 6-9: Рис. S5-S8.

Дополнительный файл 21: Видео 7. Миграция кластеров органоидных клеток до образования органоидов На видео показан один мПО в виде фрагмента всей культуры, выращенной в одной кювете Z1-FEP. Органоиды экспрессировали Rosa26-nTnG (серый цвет) в качестве маркера ядра, и их изображение отображалось в течение 20 часов. Перед образованием органоида первоначально засеянный кластер органоидных клеток мигрирует через ECM в течение примерно 25 часов, прежде чем клетки перегруппируются, чтобы сформировать сферическую структуру.Расстояние миграции составляет около 250 мкм при средней скорости 10 мкм (от зеленого / минимального до красного / максимального: 2,5 мкм / ч — 23 мкм / ч). Микроскоп: Zeiss Lightsheet Z.1; объектив обнаружения: W Plan-Apochromat 20x / 1.0, световой объектив: Zeiss LSFM 10x / 0,2; лазерные линии: 488 нм, 561 нм; фильтры: лазерный блочный фильтр (LBF) 405/488/561; размер вокселя: 1,02 × 1,02 × 2,00 мкм 3 ; интервал записи: 30 мин; Программное обеспечение для 3D-рендеринга и отслеживания: Arivis Vision4D. (MP4 8503 кб)

Дополнительный файл 22: Видео 8. Образцовая сегментация и отслеживание процесса образования органоидов. Видео показывает mPO как выдержку из всей культуры, выращенной в одной кювете Z1-FEP. Органоиды экспрессировали Rosa26-nTnG (серый) в качестве маркера ядра. В фильме показан отрывок из первых 10 часов записанного набора данных за 6 дней. Формирование начинается с скопления клеток в одну компактную структуру и заканчивается образованием просвета. Каждая цветная точка представляет собой одно ядро ​​клетки, но не каждое ядро ​​отслеживалось (линии).Чтобы обеспечить правильную сегментацию и отслеживание изображений с более высоким разрешением, необходимо получать изображения, например могут использоваться объективы обнаружения с большим увеличением. Микроскоп: Zeiss Lightsheet Z.1; объектив обнаружения: W Plan-Apochromat 20x / 1.0, световой объектив: Zeiss LSFM 10x / 0,2; лазерные линии: 488 нм, 561 нм; фильтры: лазерный блочный фильтр (LBF) 405/488/561; размер вокселя: 1,02 × 1,02 × 2,00 мкм 3 ; интервал записи: 30 мин; Программное обеспечение для 3D-рендеринга и отслеживания: Arivis Vision4D.(MP4 11,909 кб)

Долгосрочный одноклеточный анализ органоидов, происходящих из поджелудочной железы, выявляет межклеточную гетерогенность в пролиферации клеток

Далее мы стремились провести более глубокий количественный анализ динамических клеточных процессов при расширении просвета, особенно в отношении наблюдаемых колебаний размеров. Собранные LSFM-изображения с высоким разрешением позволили полуавтоматическую сегментацию и количественное извлечение признаков в течение 6-дневного сбора данных. Это обеспечило надежные данные с временным разрешением о количестве ядер клеток, объеме органоидов, площади поверхности, количестве соседних клеток для каждой клетки и плотности клеток.

Используя наш ранее опубликованный конвейер сегментации [16, 22], мы обработали один набор данных покадровой съемки культуры mPO, в результате чего было получено 288 сегментированных временных точек. Чтобы оценить производительность сегментации, мы сгенерировали наборы достоверных данных для оценки оценки F (от 0,74 до 0,83, дополнительный файл 10: рис. S9, дополнительный файл 23: таблица S2). Из сегментированных данных мы выбрали для анализа три репрезентативных органоида. Один небольшой органоид (диаметр <400 мкм), один большой органоид (диаметр> 400 мкм) и один органоид, размер которого был сопоставим с большим органоидом, но показал большее количество клеток.Три мПО экспрессировали Rosa26-nTnG в качестве маркера ядра (фиг. 3).

Рис. 3

Долгосрочный одноклеточный анализ мПО выявляет гетерогенность потенциалов пролиферации. mPO (засеянные и сохраненные в одной кювете Z1-FEP) экспрессировали ядерный маркер Rosa26-nTnG (серый). Органоиды были визуализированы в течение 6 дней и проанализированы с помощью нашего ранее опубликованного конвейера сегментации ядер [22]. a Три типичных органоида показаны сразу после посева (0 ч, верхний ряд) и через 6 дней (144 ч, нижний ряд).В каждом ряду показан один вид одной и той же кюветы Z1-FEP. Следовательно, все отображаемые органоиды выращивались одновременно в одной кювете FEP. Крупные планы показывают сегментацию органоида в соответствующий момент времени. Разные цвета относятся к отдельным ядрам клетки. Цветными рамками обозначены органоиды с разной скоростью распространения — зеленый / высокий, синий / низкий и красный / средний. b Сверху вниз, соответствующие оценки объема, площади поверхности и отношений соседства (DCG: граф ячеек Делоне; PCG: граф ячеек близости).Микроскоп: Zeiss Lightsheet Z.1; линзы объектива: детектирование: W Plan-Apochromat × 20 / 1.0, освещение: Zeiss LSFM × 10 / 0.2; лазерные линии: 561 нм; фильтры: лазерный блочный фильтр (LBF) 405/488/561; размер вокселя: 1,02 × 1,02 × 2,00 мкм 3 ; интервал записи: 30 мин; масштабная линейка: 100 мкм

Мы наблюдали, что в отдельных органоидах количество клеток увеличивается с разной скоростью, даже если они имеют одинаковое начальное количество клеток. Мы показываем, что органоид с начальным числом клеток восемь растет с низкой скоростью (в среднем: 0.65 клеток в час) и достигает максимального количества 107 клеток через 6 дней, тогда как органоид, начинающийся с девяти клеток, увеличивается с высокой скоростью (в среднем: 7,41 клеток в час) и заканчивается 1077 клетками через 6 дней (рис. 3a. , синие и зеленые рамки). Поскольку процедура разделения приводит к разным размерам кластеров клеток, мы также проанализировали один органоид, который начинался с 37 клеток и достиг общего числа 644 через 6 дней (в среднем: 4,12 клеток в час) (рис. 3a, красные рамки).

Чтобы лучше понять неоднородность потенциала пролиферации и коллективное поведение клеток в целом, мы также количественно оценили объем и площадь поверхности органоида, а также отношения соседства отдельных клеток (рис.3б). Мы наблюдали, что органоид с наибольшим конечным числом клеток не показал наибольшего объема и площади поверхности (конечный номер ячейки: 1077, конечный объем: 10 × 10 7 вокселей, конечная площадь поверхности: 24 × 10 3 пикселей. , Рис. 3б, зеленые линии). В этом органоиде среднее количество соседних клеток было выше в графе соседних ячеек (PCG), что означает, что клетки являются соседями, если они находятся ближе, чем определенное расстояние (расстояние: 50 пикселей, окончательное значение PCG: 35), для сравнения. к органоиду с наибольшим объемом и площадью поверхности (конечное значение PCG: 19, конечное число ячеек: 644, конечный объем: 15 × 10 7 вокселей, конечная площадь поверхности: 30 × 10 3 пикселей, рис.3б, красные линии). Эти результаты коррелируют с различной плотностью ячеек, отображаемой количеством соседних ячеек в графе ячеек Делоне (DCG) 26 и 21 соответственно.

Все три органоида показали частые колебания размера (рис. 4). Таким образом, мы проанализировали колебания размера на основе объема органоида (рис. 4c показывает пример колебания размера в сегментированных данных). Однако в течение 6 дней маленький органоид (рис. 4a, b, синие линии) показал семь колебаний, тогда как два больших органоида показали три (рис.4а, б, красные линии) и два (рис. 4а, б, зеленые линии) события соответственно. Интересно, что мы не наблюдали никакой корреляции между событиями колебаний размера и изменениями числа или количества клеток и расстояния до соседних клеток. Кроме того, мы не наблюдали каких-либо событий колебаний размера в первые 80 часов (в пределах 5% -ного порога), а также не наблюдали никакого синхронизированного колебательного поведения между органоидами в пределах одной культуры.

Рис. 4

Объемный анализ трех репрезентативных mPO показывает разные частоты колебаний . MPO (засеянные и сохраненные в одной кювете Z1-FEP) экспрессировали ядерный маркер Rosa26-nTnG (серый). Органоиды были визуализированы в течение 6 дней, и три репрезентативных органоида были проанализированы с помощью нашего ранее опубликованного конвейера сегментации ядер [22] в отношении событий колебаний размера. Колебание размера длится от 30 минут до 2 часов. a Объем во времени для каждого органоида приблизительно на основе сегментации ядер клеток. b Крупный план трех (красный), двух (зеленый) и семи (синий) событий колебаний размера с уменьшением объема более чем на 5%. c Типичные изображения колебаний размеров органоидов. Верхний ряд показывает ядра серым цветом на необработанном изображении, нижний ряд — сегментированные ядра клеток. Каждый цвет иллюстрирует ядро ​​одной клетки. Микроскоп: Zeiss Lightsheet Z.1; линзы объектива: детектирование: W Plan-Apochromat × 20 / 1.0, освещение: Zeiss LSFM × 10 / 0.2; лазерные линии: 561 нм; фильтры: лазерный блочный фильтр (LBF) 405/488/561; размер вокселя: 1,02 × 1,02 × 2,00 мкм 3 ; интервал записи: 30 мин; масштабная линейка: 100 мкм

Закон масштабирования, полученный из упрощающих предположений, указывает на зависимость событий колебаний размера от динамики деления клеток

Чтобы решить механические принципы, лежащие в основе событий колебаний размера, мы разработали математическую модель, основанную на следующих предположениях.Поскольку органоиды представляют собой сферические однослойные многоклеточные кластеры, они описываются их объемом V ( t ) и количеством поверхностных клеток N ( t ) в момент времени t . Мы предлагаем функциональную взаимосвязь для увеличения объема органоида \ (\ dot {V} (t) \), которая является производной от двух процессов: (a) Внутреннее давление органоида увеличивается со временем из-за притока, следующего за разделение клетками осмотического активного вещества.(b) Из-за митоза количество клеток N ( t ) увеличивается, а площадь поверхности A ( t ) увеличивается (рис. 1, деление клеток).

Мы предполагаем, что увеличение количества клеток \ (\ dot {N} (t) \) может уравновесить увеличение внутреннего давления органоида и предотвратить события колебаний размера. Далее мы показываем, что для этого требуется, чтобы количество ячеек N ( t ) росло быстрее или равнялось N ( t ) ~ t 2 .3 $$

и площадью поверхности

Соотношение между объемом и площадью поверхности можно записать как

  1. II.

    Каждая клетка производит вещества, которые секретируются в просвет органоида. Мы предполагаем, что скорость продукции постоянна во времени и одинакова для всех ячеек, а значит, пропорциональна количеству поверхностных ячеек.

$$ \ dot {n} (t) \ sim N (t) $$

  1. iii.

    Мы также предполагаем, что соотношение между секретируемым веществом и осмотическим давлением (Π) следует закону Ван-Ат-Гоффа

$$ \ Pi = c \ times {i} _ {vH} \ times R \ times T = \ frac {n} {V} \ times {i} _ {vH} \ times R \ times T \ sim \ frac {n} {V} $$

  1. iv.

    Из-за деления клеток площадь поверхности увеличивается как функция времени: A = A ( t ). {3/2}} $$

    Во избежание разрыва нарастание поверхности A ( т, ) должен уравновесить результирующее осмотическое давление Π, возникающее в результате постоянного производства n на A .{3/2}} = \ mathrm {const}. $$

    Это соотношение выполняется, когда A ( т ) ~ т 2 . Этот закон масштабирования дает следующие прямые последствия: постоянная скорость деления клеток вызывает экспоненциальное увеличение количества клеток. Экспоненциальный рост быстрее квадратичного; из-за теоретических соображений здесь мы не ожидаем разрыва и последующих событий размерных колебаний. Некоторые органоиды, однако, показывают квазилинейное увеличение количества клеток, что соответствует скорости митоза, которая снижается на 1/ t .Линейное увеличение происходит медленнее, чем т 2 ; следовательно, в этих органоидах мы ожидаем разрыва и колебания размера.

    Кроме того, мы отмечаем, что отношение поверхности к объему сферы изменяется с радиусом, поскольку объем растет намного быстрее, чем поверхность. Поскольку осмотически активное вещество в просвете продуцируется поверхностью, это означает, что более мелкие органоиды достигают критического внутреннего давления раньше, чем крупные органоиды.

    Агентная математическая модель фиксирует экспериментальную динамику органоидов и подтверждает теоретические соображения

    Чтобы подтвердить наши гипотезы, мы разработали механическую трехмерную агентную модель колебаний размеров органоидов, основанную на экспериментальных данных, полученных с помощью долгосрочных одиночных клеточный анализ мПО (рис.5а; Дополнительный файл 11: Рис. S10).

    Рис. 5

    Расчетное моделирование многоагентного объекта. а Иллюстрация общей модели. b Снимок моделируемой сферы, разрезанной пополам. c Кусочно-экспоненциально-линейное соответствие (черные пунктирные линии) темпам роста для долгосрочного анализа мПО на отдельных клетках. Цвета напоминают органоиды, показанные на рис. 3. Точки указывают количество клеток органоидов. Цветные пунктирные линии показывают переход от экспоненциального к линейному росту. d Объемы смоделированных органоидов. Цветные пунктирные линии показывают переход от экспоненциальной к линейной скорости роста. Цветные сплошные линии показывают объемы сфер.

    Мы предполагаем, что органоиды могут быть представлены в виде эластичных сфер с растущей поверхностью за счет деления клеток (рис. 5b). Агенты представляют собой отдельные клетки, применяющие механические силы к соседним клеткам. Что касается механических свойств клеток, мы использовали общую схему, описывающую взаимодействие эпителиальная клетка-клетка, которая ранее использовалась для выяснения лежащей в основе динамики миграции клеток рака легкого и локального кластеризации клеточных судеб во внутренних органоидах клеточной массы [25, 30].Мы предполагаем, что наблюдаемая поляризация клеток (рис. 1) поддерживает сферическую форму органоидов. Таким образом, к модели добавляется изгибающий потенциал. На основании выводов Ruiz-Herrero et al. [24], мы предполагаем, что клетки непрерывно секретируют вещество в просвет, что приводит к осмотическому притоку. Этот приток приводит к увеличению внутреннего давления, которое, однако, может быть уравновешено увеличением объема. Когда среднее расстояние между соседними клетками превышает определенный предел, оболочка органоида разрывается, что приводит к значительному оттоку жидкости и дефляции органоида.Следуя закону экономии, мы считаем, что механические свойства, размер клеток и вклад каждой клетки в осмотический приток однородны для всех органоидов. В соответствии с данными, динамика деления клеток при моделировании различается между органоидами, но также считается однородной в пределах одного органоида. Основываясь на этих предположениях, мы пришли к выводу, что органоид может уравновешивать внутреннее давление, когда количество клеток увеличивается, по крайней мере, квадратично (Дополнительный файл 24: Дополнительные теоретические соображения).Кроме того, для небольших органоидов соотношение между поверхностью и объемом меньше, чем для крупных органоидов. Следовательно, небольшие органоиды должны достигать критического давления для утечки быстрее, чем крупные органоиды. Таким образом, мы ожидаем, что колебания размера будут критически зависеть от (а) динамики деления клеток и (б) размера органоида. Последнее (б) подтверждается данными светлопольного анализа (рис. 6д).

    Рис. 6

    Анализ множественных моноцистозных мПО выявляет гетерогенность, а также основные регуляторные принципы. a Обзорное изображение в светлом поле мПО, демонстрирующих моноцистный фенотип. Микроскоп: Zeiss Axio Observer Z.1; линзы объектива: Plan-Apochromat × 5 / 0,16, средн. z — выступ, размер вокселя: 1,29 × 1,29 × 50 мкм 3 , обзор масштабной линейки: 500 мкм, крупный план: 25 мкм. b Схематический график выделения признаков на основе изображений с ярким полем с временным разрешением. Были проанализированы различные характеристики, такие как проекция площади просвета, фазы расширения и размерные колебания. c Прогнозируемые площади единичных органоидов, растущих в пределах одной скважины, были проанализированы в течение 48 часов, начиная через 12 часов после посева, и выявили высокую неоднородность прогнозируемых площадей. Высокая межкультурная неоднородность иллюстрируется широким межквартильным диапазоном (черный) и выбросами (пунктирные линии) внутри прямоугольной диаграммы ( n = 34). d Медианы проектных площадей трех скважин (технические реплики) различаются. Медианы нормализованных прогнозируемых площадей согласованы между отдельными скважинами.Медиана, показанная в c , выделена зеленым ( n = 34, 31, 35). e Цветовой код указывает количество зарегистрированных событий колебаний размера. Органоиды меньшего размера демонстрируют повышенное количество событий осцилляции. Крупный план показывает расположение органоидов, разрушающихся четыре-шесть раз ( n = 100). f Среднее значение коэффициента расширения составляет 0,11 (зеленая линия). Независимо от их исходной площади проекции [ 2 мм], 50% всех органоидов имеют средний коэффициент расширения от 0.09 и 0,14. Здесь 12% органоидов имеют средний коэффициент расширения выше 0,22 и отмечены как выбросы (красный) ( n = 100)

    Модель используется для подтверждения теоретических соображений и для качественного воспроизведения колебаний размеров трех проанализировали мПО (рис. 4а, б). Таким образом, скорость деления клеток напрямую извлекается из экспериментальных данных (рис. 3b). Моделирование двух крупных органоидов не показывает колебания размера во время фаз экспоненциального увеличения числа клеток, но начинает колебаться после перехода к линейному росту (рис.5в, г, зеленая и красная линии). Моделирование с небольшим органоидом демонстрирует колебания размера даже во время начального экспоненциального роста, что подтверждает нашу гипотезу о том, что маленькие органоиды более склонны к разрыву и дефляции (рис. 5c, d, синие линии; рис. 6e).

    Таким образом, результаты моделирования демонстрируют большое качественное согласие осцилляций размеров с экспериментальными данными, а также совпадают с аналитическими результатами.

    Макро- и мезомасштабный анализ с временным разрешением выявляет гетерогенность от органоидов к органоидам, а также основные регуляторные принципы.

    Процессы, наблюдаемые с помощью LSFM, предполагают огромное разнообразие сложных динамических процессов в органоидных культурах.Чтобы проанализировать характеристики роста на макроуровне и подтвердить прогнозы, предлагаемые вычислительной моделью, мы создали конвейер, основанный на наблюдениях в светлом поле с временным разрешением. Анализ позволяет охарактеризовать глобальное поведение культуры. Посредством полуавтоматической сегментации на основе водоразделов трубопровод позволяет количественно оценить проектируемые площади просвета [ 2 мм] во времени для нескольких параллельных органоидов (дополнительный файл 2: рис. S1). Впоследствии по нормализованным проецируемым областям оценивается относительное увеличение размера.Далее для отдельных органоидов идентифицируются фазы расширения (время, наклон, продолжительность), события колебаний размера (время, наклон, продолжительность), а также минимальные и максимальные проецируемые площади просвета (рис. 6b).

    На рис. 6в показаны площади 34 органоидов поджелудочной железы, растущих в пределах одной лунки, за 48 часов. Спроектированные площади демонстрируют высокую неоднородность, причем распределение площадей со временем расширяется. После 48 часов наблюдения проектируемые области имеют медианное значение 0,1 мм 2 , а их межквартильный размах (IQR) колеблется от 0.03 до 0,17 мм 2 .

    Далее, мы демонстрируем, что конвейер светлого поля обеспечивает последовательные и надежные данные анализа роста в технических репликах (Дополнительный файл 1: Определения) (три скважины, n = 34, 31, 35) (Рис. 6d). Средние значения нормализованных спроецированных площадей не показывают значительных различий между техническими повторами (ANOVA Краскела-Уоллиса).

    Извлеченные признаки могут в дальнейшем использоваться в последующих анализах для классификации поведения органоидов.Мы обнаружили, что размер органоида имеет решающее значение для количества отображаемых им колебаний. Светлопольный анализ показывает, что за период наблюдений органоиды увеличивают свою проектируемую площадь примерно до шестикратной площади. Первоначально меньшие органоиды (площадь <0,01 мм 2 ) характеризуются более крупными колебательными событиями, в то время как первоначально более крупные органоиды демонстрируют меньшие колебания (площадь> 0,01 мм 2 ) (рис. 6e). Это совпадает с математическими соображениями о том, что отношение поверхности к объему важно для колебательного поведения органоидов.Чтобы проверить, может ли математическая модель воспроизвести это наблюдение, мы используем начальный и конечный размер органоидов, которые известны из экспериментов. Поскольку динамика клеточного деления не извлекается из конвейера светлого поля, мы предполагаем для простоты линейное увеличение количества клеток для всех смоделированных органоидов. В этом случае модель полностью согласуется с экспериментальными данными, воспроизводя тенденцию, согласно которой первоначально меньшие органоиды демонстрируют увеличенное количество событий колебаний размера (дополнительный файл 12: рис.S11). Таким образом, модель подтверждает влияние размера и роста органоидов на события осцилляции. Кроме того, средний коэффициент расширения (показатель постоянства скорости расширения) со средним значением 0,11 аналогичен для органоидов с различными начальными площадями — 50% всех значений находятся в диапазоне от 0,09 до 0,14, в то время как только 12% оцененных органоидов являются выбросами со значениями выше 0,22 (рис. 6е). Далее становится очевидной линейная корреляция между начальной областью и конечной областью ( R 2 = 0.7445), что показывает, что рост не зависит от начальной области (дополнительный файл 13: рис. S12a). Это указывает на сильное сходство в постоянстве скорости расширения между отдельными органоидами в пределах одной культуры, несмотря на их (высокую) неоднородность по размеру.

    Помимо уже упомянутых признаков, другие извлеченные признаки облегчают определение количественных эталонных параметров органоидных систем. Например, сравнивая конечную площадь с максимальной площадью, доказывается непрерывный рост mPO в течение анализируемого временного окна.Сравнение начальной площади с минимальной площадью идентифицирует события колебания размера или общее уменьшение размера в культурах органоидов. В mPO минимальная площадь лишь немного ниже начальной области, которая может быть связана с событиями колебаний (дополнительный файл 13: рис. S12c). Помимо среднего коэффициента расширения, анализ максимального коэффициента расширения указывает на вариации скорости расширения внутри органоидных культур. В качестве переменного фактора максимальное расширение может использоваться для сравнения различных условий культивирования (дополнительный файл 13: рис.S12b). Дополнительной характеристикой, которая может измениться при дифференцировке или других нарушениях (например, при лечении лекарственными препаратами), является округлость органоида. В здоровых мПО округлость в среднем составляет 0,9, а отклонение от среднего со временем сужается (дополнительный файл 13: рис. S12e). В дополнение к анализу моноцистозных эпителиальных органоидов, таких как mPO, наш технологический анализ светлого поля также может быть использован для анализа отклоняющейся морфологии органоидов, таких как поликистозные hCCAO (дополнительный файл 14: рис. S13a-f).Поликистозные hCCAO показывают среднюю округлость 0,8 в течение 48 часов наблюдения (дополнительный файл 14: рис. S13b). Следовательно, как общая культурная особенность, округлость может служить дополнительным параметром контроля качества.

    Границы | Органоиды ствола мозга из плюрипотентных стволовых клеток человека

    Введение

    Ствол мозга — это задний отдел мозга между глубокими структурами полушарий головного мозга. Он соединяет головной мозг со спинным мозгом и делится на три части: средний мозг, мост и продолговатый мозг.Они содержат множество ядер и небольших волоконных трактов, широко простирающихся в кору головного мозга, базальные ганглии и другие части головного мозга. Функции ствола мозга, такие как бдительность, сердцебиение, артериальное давление и дыхание, считаются более важными для жизни, чем функции коры головного мозга. Следовательно, повреждения или нарушения ствола мозга, включая инфаркт, кровотечение, опухоли или любые нейродегенеративные заболевания, могут привести к смерти. Чтобы исследовать патологию этих заболеваний и разработать новые методы лечения, необходимы модели, воспроизводящие ткань ствола мозга.

    Недавний прогресс в протоколах индукции органов в блюде (органоидов) открывает возможности для моделирования различных заболеваний (Clevers, 2016). Органоиды имитируют структуру органов, состоящих из различных клеток, таких как почка (Takasato et al., 2015), мозг (Dang et al., 2016), толстая кишка (Sato et al., 2009) и сетчатка (Eiraku et al. , 2011; Накано и др., 2012). Использование органоидов головного мозга является признанным методом повторения развития человеческого плода во время культивирования in vitro (Lancaster et al., 2013; Ланкастер и Кноблих, 2014; Трухильо и др., 2019).

    Тем не менее, улучшения протоколов все еще необходимы, особенно в таких аспектах, как зрелость, эффективность и степень рекапитуляции, зафиксированной в органоидах. Недавно сообщалось о протоколе создания органоидов, подобных среднему мозгу человека, из плюрипотентных стволовых клеток (hPSC) человека (Jo et al., 2016). Имеются также сообщения о влиянии реагентов или факторов роста на дифференцировку дофаминергических нейронов (Diaz et al., 2009; Ayton et al., 2016; Ли и др., 2016). Основываясь на этих результатах, мы разработали новый метод создания модели органоида ствола мозга человека (hBSO), в которой средний мозг, окружающие части ствола мозга и область нервного гребня позади них индуцируются добавлением основного фактора роста фибробластов (bFGF) и роста эпидермиса. фактор (EGF) для размножения нейрональных стволовых клеток / клеток-предшественников. За этим следует лечение нейротрофическим фактором головного мозга (BDNF), нейротрофическим фактором линии глиальных клеток (GDNF), нейротрофином 3 (NT-3), циклическим аденозинмонофосфатом (цАМФ) и аскорбиновой кислотой для дифференциации дофаминергических нейронов. .В настоящем исследовании мы разработали новый метод индукции hBSO. Мы считаем, что наши методы станут мощным инструментом в изучении патологии нейродегенеративных заболеваний или заболеваний нервной системы, поражающих ствол мозга.

    Материалы и методы

    Культура клеток

    Человеческие индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) и эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) поддерживаются в условиях отсутствия питателя с помощью среды mTeSR1. Линия ИПСК человека (XY) была получена из Такара, Кусацу, Сига, Япония, а линия ESC человека H9 (WA09) была приобретена в Исследовательском институте WiCell, Мэдисон, Висконсин, США.Эмбриональные стволовые клетки и ИПСК культивировали в среде mTeSR1 (Stemcell Technologies, Ванкувер, Британская Колумбия, Канада) на основе протоколов культивирования без фидера на шестилуночных планшетах (Corning, Corning, Нью-Йорк, США), покрытых восстановленными факторами роста. Матригель (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния, США). Во время пассажа мы добавляли ингибитор ROCK (конечная концентрация 10 мкМ; Selleck Chemicals, Хьюстон, Техас, США). Эти клетки поддерживали с ежедневной сменой среды без ингибитора ROCK до тех пор, пока они не достигли примерно 70% слияния.Затем они были отделены Versene Solution (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) и засеяны в соотношении разбавления 1:20.

    Поколение органоидов ствола мозга человека

    hBSO были созданы с некоторыми модификациями протокола церебральных кортикальных органоидов (Thomas et al., 2017; Trujillo et al., 2018). ИПСК / ЭСК человека осторожно диссоциировали в течение 10 минут обработки 50% -ной аккутазой (Sigma A6964) в фосфатно-солевом буфере (PBS). Отделенные клетки переносили в шестилуночные планшеты при плотности четырех миллионов клеток в 5 мл среды mTeSR1 с 5 мкМ ингибитора ROCK, 1 мМ дорсоморфина (Wako, 040-33753) и 10 мкМ SB431542 (Cayman Chemical, 13031) на лунку в лунке. 6-луночные планшеты на орбитальном шейкере (WakenBtech), чтобы клетки оставались в суспензии.Для нейрональной индукции с 3-го дня среду меняли на среду, состоящую из нейробазальной среды (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) и 2 × Gem21NeuroPlex (Gemini Bio-Products, Калифорния, США), 1 × несущественных аминокислот. кислотный раствор (NEAA, Sigma-Aldrich), 1 × GlutaMAX (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США), 1 мМ дорсоморфин, 10 мкМ SB431542, 10 мкМ трансферрин, 5 мг / л человеческого инсулина и 0,063 мг / л прогестерон. После 9 дней воздействия дорсоморфина и SB431542 мы обрабатывали клетки 20 нг / мл bFGF (Peprotech, AF-100-18B) для индукции пролиферации нервных клеток-предшественников (NPC) в присутствии нейробазальной среды-A (Thermo Fisher Scientific , Waltham, MA, США), с добавлением 2 × Gem21NeuroPlex, 1 × NEAA, 1 × GlutaMax, 10 мкМ трансферрина, 5 мг / л человеческого инсулина и 0.063 мг / л прогестерона до 16 дня. Затем клетки хранили в той же среде, содержащей не только 20 нг / мл bFGF, но также 20 нг / мл EGF (Wako, 059-07873), до 22-го дня. После 22-го дня EGF и bFGF были заменены аскорбиновой кислотой (nacalai, 13048-42), цАМФ (nacalai, 11540-74), BDNF (Wako, 028-16451), GDNF (Wako, 075-04153) и NT-3 (Peprotech, 450- 03). После 28 дня клетки культивировали без каких-либо факторов роста для созревания нейронов. Результаты по органоидам были объединены по крайней мере из трех отдельных серий индукций.

    Поколение церебральных органоидов человека

    Человеческие церебральные органоиды (hCO) были получены в соответствии с ранее описанными протоколами (Lancaster et al., 2013; Lancaster and Knoblich, 2014). ИПСК / ЭСК человека были отделены и подвергнуты индукции эмбриоидных тел (ЭТ) с использованием протокола. Через 4 дня половину среды заменили средой EB человека без ингибитора ROCK и bFGF. Через 2 дня EB переносили в среду для нейронной индукции и через 5 дней помещали в матригель.Органоиды были впоследствии индуцированы с помощью орбитального шейкера в соответствии с первоначальным протоколом.

    Иммуногистохимический анализ

    Каждый церебральный органоид или органоид ствола мозга человека фиксировали в 4% параформальдегиде в PBS в течение ночи при 4 ° C, обезвоживали 30% сахарозой в PBS и заключали в O.C.T. соединение (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США). Срезы криостата (14 мкм) вырезали и помещали на предметные стекла (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США).Установленные срезы инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с блокирующим раствором [3% нормальная козья сыворотка + 0,3% Triton X-100 в трис-буферном солевом растворе (TBS)] и инкубировали с первичными антителами (дополнительная таблица S1), разведенными в блокирующем растворе, в течение ночи. при 4 ° C. После трех промывок TBS добавляли соответствующие конъюгированные с флуорофором вторичные антитела, разведенные в блокирующем растворе, и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре с последующим окрашиванием DAPI. Наконец, окрашенные предметные стекла трижды промывали TBS, устанавливали и анализировали с использованием конфокального микроскопа FV3000 (Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan).

    Выделение РНК, обратная транскриптаза – полимеразная цепная реакция и количественная полимеразная цепная реакция

    РНК из hCO / hBSO и ESC экстрагировали согласно протоколу, прилагаемому к реагенту TRIzol (15596018; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, США). Концентрацию и чистоту образцов РНК измеряли с помощью спектрофотометра (Beckman Coulter, Бреа, Калифорния, США). Извлеченные образцы РНК либо отправлялись в биоинженерную лабораторию для анализа секвенирования РНК, либо подвергались обратной транскриптазно-полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР).Для ОТ-ПЦР экстрагированные РНК подвергали обратной транскрипции в соответствии с протоколом, поставляемым с ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (FSQ-201; TOYOBO, Осака, Осака, Япония). Систему ПЦР в реальном времени StepOne Plus (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) использовали для амплификации и количественной оценки уровней кДНК целевого гена. Количественную ОТ-ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) проводили с использованием SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix (172-5271; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, США) и специфических праймеров для qRT-PCR (дополнительная таблица S2).Условия цикла для программы ПЦР: 2 мин при 95 ° C для активации, затем 40 циклов при 95 ° C в течение 5 с для денатурации, 60 ° C в течение 30 с для отжига, 95 ° C в течение 15 с, 60 ° C в течение 30 с и 95 ° C в течение 15 с для стадии кривой плавления. Реакции проводили в трех экземплярах. Экспрессию каждого гена нормализовали к среднему геометрическому значению β-актина как домашнего гена и анализировали с использованием метода ΔΔCT. Средние значения порогового цикла каждого гена в qPCR показаны в дополнительных таблицах S3 и S4.Статистическая значимость рассчитывалась с помощью двустороннего критерия Стьюдента t . Значение p менее 0,05 считалось статистически значимым.

    Секвенирование РНК

    Суммарную РНК

    выделяли из клеток с использованием набора PureLink RNA Mini Kit (12183018A) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию РНК анализировали с помощью набора Qubit RNA HS Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США), а чистоту оценивали с помощью анализатора фрагментов ДНК Qsep100 и картриджа RNA R1 (BiOptic, New Taipei City, Тайвань).Впоследствии тотальную РНК преобразовали в кДНК и использовали для получения библиотеки секвенирования Illumina на основе протоколов KAPA Stranded mRNA-Seq Kit (KAPA Biosystems, Wilmington, MA, США). Затем фрагменты ДНК подвергали лигированию адаптера, при этом адаптеры дцДНК с выступами 3’-dTMP лигировали с фрагментами вставки библиотеки с А-хвостом с помощью набора адаптеров FastGene (NIPPON Genetics, Бункё, Токио, Япония). Очищенные продукты библиотеки кДНК оценивали с использованием набора Qubit и dsDNA HS Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) с последующей оценкой качества с использованием анализатора фрагментов и набора реагентов dsDNA 915 (Advanced Analytical Technologies, Ankeny, IA, United States). States) и, наконец, секвенированием (2 × 75 п.н.) на NextSeq 500 (Illumina, Сан-Диего, Калифорния, США).

    Анализ транскриптома

    Анализ дифференциальной экспрессии на основе подсчета «TCC» был использован для идентификации по-разному экспрессируемых генов (DEG) в данных РНК-seq с пороговой частотой ложного обнаружения 20% (Sun et al., 2013). iRegulon (Janky et al., 2014) был использован для идентификации факторов транскрипции (TF), потенциально регулирующих DEG, с нормализованными показателями обогащения> 4 в качестве порога. Genotype-Tissue Expression (GTEx) (GTEx Consortium, 2013) использовался для анализа сходства паттернов экспрессии органоидов и различных тканей в головном мозге.

    Электрофизиология

    Были выполнены электрофизиологические записи клеток в hBSO через 3 месяца. Органоид переносили в записывающую камеру со стеклянным дном на вертикальном микроскопе (Leica DM LFS; Leica, Wetzlar, Германия) и непрерывно перфузировали внеклеточным раствором, содержащим (в мМ) 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl 2 , 1 MgCl 2 , 1,25 NaH 2 PO 4 , 26 NaHCO 3 и 25 глюкозы и аэрация 95% O 2 и 5% CO 2 (pH 7.4) со скоростью 2 мл / мин. Органоид удерживался утяжеленной сеткой, чтобы предотвратить его перемещение. Температуру бани поддерживали на уровне 30–32 ° C с помощью проточного нагревателя (TC-324B; Warner Instruments, Хамден, Коннектикут, США). Регистрацию с фиксацией тока целых клеток выполняли с использованием усилителя с фиксацией патч-фиксации EPC-8 (HEKA, Дармштадт, Германия). Пипетки-накладки были изготовлены из капилляров из боросиликатного стекла и заполнены внутренним раствором, содержащим (в мМ) 120 K-метилсульфат, 10 KCl, 0,2 EGTA, 2 MgATP, 0,0.3 NaGTP, 10 HEPES, 10 Na 2 -фосфокреатин и 0,1 спермина, доведенные до pH 7,3 с помощью КОН. Осмолярность внутреннего раствора составляла 280–290 мОсм / л, а сопротивление накладных электродов в растворе ванны составляло 4–8 МОм. Сигналы напряжения были отфильтрованы на частоте 3 кГц и оцифрованы на частоте 10 кГц. Расчетный потенциал жидкого перехода -5 мВ был скорректирован. Данные были получены с использованием системы pClamp 9 (Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния, США). Отклики напряжения клеток исследовали путем применения импульсов тока деполяризации и гиперполяризации (длительностью 400 мс).Автономный анализ выполняли с использованием программного обеспечения AxoGraph X (AxoGraph Scientific, Беркли, Калифорния, США). Входная емкость оценивалась на основе тока, индуцированного скачком напряжения 10 мВ от удерживающего потенциала -70 мВ. Входное сопротивление оценивалось на основе изменения напряжения, вызванного приложенным импульсом гиперполяризующего тока, равным -40 пА. Амплитуда импульса определялась высотой выброса от его порога, определяемого как мембранный потенциал, при котором производная кривой напряжения достигает 10 В / с.Максимальная частота возбуждения была получена для клеток, которые демонстрировали более одного спайка, и рассчитывалась как величина, обратная самому короткому интервалу между спайками между последовательными парами спайков.

    Масс-спектрометрический анализ

    ЭСК человека (чЭСК), ИПСК, органоиды, полученные из ЭСК, и органоиды, полученные из ИПСК, промывали ледяным PBS, собирали соскабливанием и центрифугированием и замораживали в жидком азоте. Замороженные клетки и органоиды измельчали, используя шокер Multi-beads (Yasui Kikai, Japan), а затем лизировали ультразвуком в 9.8 М мочевина с коктейлем ингибиторов протеазы (cOmplete; Roche, Базель, Швейцария) и коктейлем ингибиторов фосфатазы (PhosSTOP; Roche, Базель, Швейцария). Прозрачный лизат собирали центрифугированием, и концентрацию белка измеряли с помощью анализа белка BCA. Двадцать микрограммов белков смешивали со смесью белков внутреннего стандарта (10 фмоль / мл MassPREP; Waters, Милфорд, Массачусетс, США) и инкубировали с 2 мМ гидрохлоридом три (2-карбоксиэтил) фосфина (TCEP-HCl) в течение 30 мин при 37 ° C для восстановления с последующим алкилированием 55 мМ йодацетамида в течение 30 минут при комнатной температуре.Затем смесь разбавляли в четыре раза 0,1 М бикарбонатом триэтиламмония и подвергали расщеплению трипсином (соотношение трипсин: образец 1:40) в течение 3 часов при 37 ° C. Расщепление прекращали трифторуксусной кислотой с последующим обессоливанием с помощью SDB-XC StageTips. Образцы были разделены на восемь фракций с помощью подсказок SDB StageTips. Каждую фракцию сушили в вакууме и растворяли в буфере для измерений (3% ацетонитрила и 0,1% муравьиной кислоты). Масс-спектрометрию проводили, как описано ранее (Uetsuka et al., 2015). Для идентификации белков исходные данные пептидов анализировали с использованием Proteome Discoverer 2.2 (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) и Mascot 2.6 (Matrix Science, Лондон, Соединенное Королевство). Результаты по пептидам из всех восьми фракций были объединены и подвергнуты поиску подходящих белков в человеческой базе данных UniProt (Консорциум Uniprot, 2018). Максимальное количество пропущенных расщеплений, допуск по массе предшественника и допуск по массе фрагмента были установлены равными 3, 10 м.д. и 0,01 Да, соответственно.Карбамидометилирование Cys было задано как фиксированная модификация, тогда как окисление Met и дезамидирование Asn и Gln были заданы как переменные модификации. К данным был применен фильтр ложного обнаружения менее 1%.

    Узел Minora Feature Detector использовался для количественной оценки без меток, а рабочий процесс консенсуса включал узлы Feature Mapper и Preursor Ion Quantifier, использующие интенсивность для количественной оценки предшественников. Интенсивность белков нормализовали по общей интенсивности пептидов.Кроме того, для определения локализации и функциональных категорий идентифицированных белков использовались аннотации из базы знаний Ingenuity Knowledge Base (IKB; выпущена осенью 2018 г .; Qiagen, Редвуд-Сити, Калифорния, США) и базы данных анализа пути изобретательности.

    Для последующего анализа мы использовали данные, нормализованные Proteome Discoverer 2.2. Весь последующий анализ был рассчитан на R. Для обработки отсутствующих значений мы сначала применили метод удаления по списку и удалили строки, содержащие отсутствующие значения.Удаленные строки показаны в дополнительной таблице S5. Соответствующие коэффициенты корреляции между ИПСК, ЭСК, органоидом ствола мозга ИПС и органоидом ствола мозга ЭС были рассчитаны после логарифмической трансформации, и были показаны коэффициент корреляции, распределения всех генов и диаграммы разброса всех генов в каждом образце. с помощью функции «pair.panels» в пакете mental, R (дополнительный рисунок S1A). Мы выполнили анализ основных компонентов (PCA) и проанализировали долю каждого основного компонента (PC) на данных, преобразованных в журнал (дополнительные рисунки S1B, C).Затем, после нормализации усеченного среднего значения M (TMM), мы извлекли DEG между стволовыми клетками и органоидами ствола мозга на основе теста отношения правдоподобия с помощью пакета edgeR, R). Порог ДЭГ составил p <0,05.

    scRNA-Seq и анализ данных

    Для диссоциации hBSO на отдельные клетки мы инкубировали их в течение ~ 30 мин в Accutase (Stemcell Technologies, Ванкувер, Британская Колумбия, Канада) при 37 ° C. Библиотеки scRNA-seq на основе капель были созданы с использованием наборов реагентов Chromium Single Cell 3 ’V2 (10X Genomics, Плезантон, Калифорния, США).Число клеток и их жизнеспособность оценивали с использованием автоматического счетчика клеток Countess II (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США). После этого клетки смешивали с основной смесью Single Cell и загружали вместе с 3 ’гелевыми шариками Single Cell и разделяющим маслом в 3’ чип для одиночных клеток. Транскрипты РНК были уникальным образом закодированы и подвергнуты обратной транскрипции в каплях. кДНК были объединены и амплифицированы в соответствии с протоколом производителя. Библиотеки количественно оценивали с помощью высокочувствительных ДНК-реагентов (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США) и набора для количественной оценки библиотек KAPA (KAPA Biosystems, Уилмингтон, Массачусетс, США).Затем библиотеки были секвенированы с помощью Illumina Hiseq 2500 в быстром режиме.

    Необработанные данные секвенирования органоида были предварительно обработаны с использованием программного обеспечения Cell Ranger (версия 2.2.0; 10X Genomics, Плезантон, Калифорния, США) (Zheng et al., 2017). Считанные данные были сопоставлены с эталонным геномом человека GRCh48 с использованием STAR. После обработки в Cell Ranger данные scRNA-seq анализировали с помощью пакета Seurat v.3.0.0 R (Satija et al., 2015). Клетки с более чем 8000 или менее чем 750 обнаруженными генами, а также клетки, экспрессирующие более 5% митохондриальных генов, были исключены.Гены, экспрессируемые менее чем в трех клетках, были исключены. Мы собрали в общей сложности 2345 клеток, экспрессирующих 19 454 гена. Наборы данных были нормализованы по логарифмической шкале и масштабированы до 10 000 транскриптов на клетку. Лучшие 2000 генов с высокой степенью вариабельности были определены с использованием метода трансформации, стабилизирующей дисперсию. Наборы данных были масштабированы, и количество уникальных молекулярных идентификаторов, рибосомных и митохондриальных генов было регрессировано. Мы проанализировали наборы данных с помощью функции «SCTransform» в Сурате (Hafemeister and Satija, 2019).После PCA кластеризация была выполнена на основе 15 лучших компьютеров с использованием оптимизации модульности общего ближайшего соседа с разрешением 0,8. Идентичность кластера была присвоена на основе маркеров гена кластера, определенных функцией «FindAllMarkers» в Сёра (дополнительная таблица S6).

    Результаты

    Для создания hBSO из hPSC мы использовали комбинацию нескольких факторов роста, включая EGF / bFGF для начальной пролиферации нейрональных стволовых / клеток-предшественников и BDNF, GDNF и NT-3 для последующей дифференцировки дофаминергических нейронов и нервного гребня. клетки.Эта процедура отличается от протоколов в ранее опубликованных исследованиях (рисунок 1A и дополнительный рисунок S2). Недавнее исследование Муотри и его коллег сообщило о наличии нейронных сетей в их корковых органоидах с высокой степенью зрелости (Trujillo et al., 2018). Мы дополнительно изменили их протокол, чтобы вызвать дофаминергические нейроны, добавив инсулин, трансферрин и прогестерон, каждый из которых, как было показано, обладает защитным действием или индуцирует дифференцировку дофаминергических нейронов в двумерной культуре (Diaz et al., 2009; Ayton et al., 2016; Ли и др., 2016). Наш новый подход к созданию hBSO дал клетки с темными гранулами между 22 и 28 днями культивирования (рис. 1A), наблюдение, которое отсутствовало на аналогичной стадии в предыдущих исследованиях (Thomas et al., 2017; Trujillo et al., 2018) .

    Рисунок 1. Схематическая процедура индукции hBSO и иммуногистохимический анализ 1-месячных hBSO из hESC. (A) Схематическая процедура получения органоидов ствола мозга человека.SB, SB431542; D, дорсоморфин; I, инсулин; Р, прогестерон; Т, трансферрин; bF, основной фактор роста фибробластов; E, фактор роста эпидермиса; AA, аскорбиновая кислота; сА, циклический аденозинмонофосфат; N нейротрофин 3; G — нейротрофический фактор, полученный из линии глиальных клеток; B, нейротрофический фактор головного мозга. Фотографии органоидов были сделаны на 0, 9, 22 и 28 дни. Полосы = 500 мкм. (B) Иммуногистохимия hBSO в возрасте 1 месяца из hESC для маркеров меланоцитов (Fontana – Masson, HMB45) и клеток нервного гребня (SOX9).Штанги = 100 мкм.

    С помощью иммуногистохимии (ИГХ) мы обнаружили меланин в hBSO с помощью окрашивания гематоксилин-эозином, Фонтана-Массона и HMB45 (рис. 1B), показывая, что эти темные клетки были меланоцитами, происходящими из клеток нервного гребня в органоидах. Экспрессия SOX9 [12,1% (74 из 608 клеток)], которая играет роль в миграции клеток нервного гребня (Spokony et al., 2002), также подтверждает существование популяции нервного гребня в органоидах ствола мозга ( Рисунок 1B).

    На основе количественного анализа ПЦР (кПЦР) 1-месячных hBSO мы подтвердили отчетливую экспрессию различных маркеров нейрональных клеток. Кроме того, мы обнаружили маркеры нервных стволовых / предшественников SOX2 , ASCL1 , SLC1A3 и OTX2 (рис. 2A), которые необходимы для развития передних структур головного мозга, включая средний мозг (Wurst and Prakash, 2014). Наш анализ также продемонстрировал экспрессию FOXA2 , мощного индуктора дофаминергических предшественников среднего мозга (mDA) (Sasaki and Hogan, 1993; Norton et al., 2005; Kittappa et al., 2007; Lin et al., 2009; Ribes et al., 2010) и NR4A2 , который необходим как для выживания, так и для окончательной дифференциации вентральных мезэнцефальных нейронов поздних дофаминергических предшественников в дофаминергические нейроны (Saucedo-Cardenas et al., 1998), и SOX6 , важно для спецификации дофаминовых нейронов черной субстанции (Panman et al., 2014; рисунок 2A и дополнительный рисунок S3). Мы также обнаружили экспрессию LMX1A , необходимую для запуска дифференцировки дофаминовых клеток (Andersson et al., 2006) и EN1 , необходимые для раннего развития mDA нейрона (Alves dos Santos and Smidt, 2011) в hBSOs, и оба гена не были обнаружены в hESCs (Supplementary Table S3). Соответственно, мы обнаружили экспрессию мРНК, кодирующих пан-нейрональный маркер MAP2 и зрелый допаминергический нейрональный маркер TH (рис. 2А). Используя IHC, мы продемонстрировали, что органоиды имеют компоненты среднего мозга посредством обнаружения белковой экспрессии SOX2 [26,8% (153 из 571 клетки)], OTX2 [16.5% (55 из 333 клеток)] и TH [14,7% (84 из 571 клетки)], что также указывает на то, что органоиды содержат компоненты среднего мозга (рис. 2B). Другие маркеры среднего мозга или mDA также были обнаружены в 1-месячных hBSO с помощью кПЦР (дополнительный рисунок S3 и дополнительная таблица S3).

    Рисунок 2. Количественный ПЦР и иммуногистохимический анализ 1-месячных hBSO из hESC. (A) Количественный анализ ПЦР месячных hBSO на маркеры нервных стволовых клеток / клеток-предшественников (SOX2, Mash2, SLC1A3), зрелого нейрона (MAP2), среднего мозга (OTX2) и mDA (FOXA2, NR4A2, TH).Планки погрешностей указывают среднее значение ± SEM; * p = 0,0167 (ASCL1), * p = 0,0412 (OTX2), * p = 0,0387 (NR4A2), **** p <0,0001 (MAP2), * p = 0,0178 ( TH). (B) Иммуногистохимическое окрашивание маркера среднего мозга (OTX2), маркера mDA (TH) и маркера нервных стволовых клеток (SOX2) через 1 месяц. Штанги = 100 мкм.

    Кроме того, мы наблюдали экспрессию ChAT при кПЦР и ИГХ [17,4% (83 из 478 клеток)] (рис. 3А). Обнаружение ChAT, маркера холинергических нейронов, предполагает существование популяции мозгового вещества (Stornetta et al., 2013). GBX2 — это маркер заднего мозга, который играет роль в позиционировании границы среднего / заднего мозга с OTX2. Его экспрессия [в 15,2% (44 из 289) клеток] указывает на то, что hBSOs включают популяцию среднего и заднего мозга (Waters and Lewandoski, 2006; Рисунок 3B). Экспрессия DBH [13,9% (63 из 453 клеток)], маркера центральной норадренергической нервной системы, может указывать на то, что компоненты моста и продолговатого мозга содержатся в hBSO (Swanson and Hartman, 1975; Рисунок 3B). Кроме того, мы обнаружили VGLUT1 и GAD67 , маркеры для зрелых и функциональных возбуждающих и тормозных нейронов, соответственно (Soghomonian and Martin, 1998; Fremeau et al., 2004). Экспрессия OLIG2 и MBP указывает на то, что наши органоиды содержат предшественники олигодендроцитов и зрелые олигодендроциты (Wei et al., 2003), тогда как присутствие S100β предполагает существование астроцитов (рисунок 3C и дополнительный рисунок S3). Кроме того, анализ qPCR на hBSO 3-месячного возраста продемонстрировал экспрессию различных нейронных компонентов (дополнительный рисунок S4 и дополнительная таблица S4).

    Рисунок 3. Количественный ПЦР и иммуногистохимический анализ 1-месячных hBSO из hESC. (A) Количественный анализ ПЦР и иммуногистохимическое окрашивание маркера холинергического нейрона (ChAT). Планки погрешностей указывают среднее значение ± SEM; * p = 0,0337 (ChAT). Штанги = 100 мкм. (B) Иммуногистохимическое окрашивание DBH, маркера норадренергического нейрона и маркера заднего мозга (GBX2). Штанги = 100 мкм. (C) Количественный анализ ПЦР для маркера возбуждающего нейрона (VGLUT1), тормозного нейрона (GAD67), олигодендроцита (OLIG2, MBP) и астроцита (S100β).Планки погрешностей указывают среднее значение ± SEM; * p = 0,0127 (VGLUT1), * p = 0,0155 (GAD67), * p = 0,0320 (MBP).

    Для дальнейшей проверки транслированных продуктов в hBSO мы провели масс-спектрометрический анализ белков hBSO через 1 месяц. Наконец, мы идентифицировали 3458 DEG, из которых 763 гена удовлетворяли коэффициенту ложного восстановления (FDR) <0,05. Из этих 763 белков мы идентифицировали гены, обогащенные стволом мозга, мозжечком или базальными ганглиями (таблица 1), что позволяет предположить, что hBSO имеют специфические компоненты для ствола мозга или мозжечка (Uhlen et al., 2015, 2017; Thul et al., 2017).

    Таблица 1. Дифференциально экспрессируемые гены, специфичные для мозга при масс-спектрометрическом анализе (FDR <0,05).

    Чтобы оценить электрическую функциональность нейронов в hBSOs, мы выполнили электрофизиологическую характеристику с использованием метода группировки целых клеток. Большинство клеток не показывали ни потенциала действия, ни мембранного потенциала ниже -40 мВ сразу после разрыва заплаты мембраны. Одна ячейка показала гиперполяризационные отклики напряжения с очевидным провалом напряжения, определяемым как быстрая гиперполяризация с последующей медленной деполяризацией (Рисунок 4, слева-1, стрелка), тогда как другие ячейки ( n = 8) не показали провала (Рисунок 4 , средний-1, правый-1).В нейронах, демонстрирующих повторяющиеся срабатывания, спайк перескакивал (52,9 ± 5,5 мВ по амплитуде), а его ширина была узкой (1,1 ± 0,3 мс от полуширины). Однако в нейроне, демонстрирующем несколько спайков, амплитуда спайков была небольшой (33,9 ± 7,9 мВ), а полуширина была широкой (2,8 ± 1,6 мс), что позволяет предположить, что эти нейроны все еще находились в процессе развития.

    Рисунок 4. Отклик напряжения записанных клеток в hBSO месячного возраста от hESCs на импульсы тока. (Слева, посередине, справа) Три типа клеток, демонстрирующих разные реакции гиперполяризации и возбуждения.(1) Отклик напряжения на импульсы гиперполяризующего тока. Стрелка: характеристики напряжения, характеризующиеся провалом напряжения. (2) Пусковые реакции на деполяризующие импульсы тока. Ответы на стрельбу с несколькими шипами (слева), незрелыми шипами (в центре) и несколькими шипами (справа). Значения импульсов деполяризующего тока приведены в позиции справа .

    Для дальнейшего анализа профиля экспрессии генов hBSO мы провели анализ общего секвенирования РНК (RNA-seq) индуцированных hCO с использованием протокола Ланкастера и его коллег (Lancaster et al., 2013; Lancaster and Knoblich, 2014) и hBSO на 28 день. Анализ последовательности РНК показал, что hBSO содержат популяции клеток, подобные стволу мозга человека. В возрасте 1 месяца hBSO экспрессировали гены, которые были характерны для среднего мозга плода, такие как LMX1A и LMX1B , и гены, указывающие на дофаминергические нейрональные свойства, такие как EN1 , EN2 , TYR , и TH , экспрессия которого была сильнее, чем в hCO (дополнительная таблица S7).Кроме того, MLANA и MITF , известные как гены-маркеры меланоцитов, и MBP , маркер олигодендроцитов, также показали более высокую экспрессию в hBSO. Мы также наблюдали значительную экспрессию NGF и SOX9, специфичных для стволовых клеток нервного гребня. С другой стороны, специфические маркеры кортикальных нейронов, такие как Reelin и Lhx2, были ниже в hBSO, чем в hCO, что указывает на их отдельные клеточные популяции.

    Чтобы лучше понять молекулярный механизм, регулирующий дифференцировку hBSO, мы идентифицировали DEG (рис. 5A) между hBSO и hESC (дополнительная таблица S8) и между hCO и hESC (дополнительная таблица S9).Мы обнаружили 91 DEG, которые избирательно регулировались в hBSO (дополнительная таблица S10) и 215 DEG в hCO (дополнительная таблица S11).

    Фигура 5. Транскриптомный анализ RNA-seq 1-месячных hBSO из hESC. (A) Диаграммы Венна количества генов, дифференциально экспрессируемых между органоидами ствола мозга человека (hBSO), церебральными органоидами человека (hCO) и hESC. (B) Кластеризация областей мозга на основе экспрессии дифференциально экспрессируемых генов, селективных в hBSO (FDR <10%). (C) Кластеризация областей мозга на основе экспрессии дифференциально экспрессируемых генов, селективных в отношении hCO (FDR <3%). (D) Факторы транскрипции, которые потенциально регулируют дифференциально экспрессируемые гены в hBSO. (E) Факторы транскрипции, которые потенциально регулируют дифференциально экспрессируемые гены в hCO.

    Для анализа корреляции между генами, избирательно регулируемыми в hBSO, hCO и в различных частях мозга, мы использовали GTEx, всеобъемлющий общедоступный ресурс для изучения тканеспецифической экспрессии и регуляции генов (рисунки 5B, C) (Консорциум GTEx , 2013).Высокая экспрессия EN2 , CNPY1 отражала связь между hBSO, мозжечком человека и черной субстанцией, тогда как экспрессия EN1 и RPE65 продемонстрировала взаимосвязь между hBSO, черной субстанцией и гипоталамусом (Рисунок 5B ). Низкая экспрессия TRIML2 в hBSO характерна для мозжечка, черной субстанции и гипоталамуса (рис. 5В).

    Чтобы идентифицировать TF, потенциально управляющие генами, избирательно регулируемыми в hBSO и hCO, мы применили iRegulon (Janky et al., 2014), вычислительный метод, основанный на том факте, что гены, корегулируемые одним и тем же TF, содержат общие сайты связывания TF и ​​который использует наборы генов, полученные из данных ENCODE ChIP-seq (Gerstein et al., 2012). CTCF , RAD21 , BRF2 , JUND и SUZ12 были идентифицированы как потенциальные TF для генов, избирательно регулируемых в hBSO (рис. 5D). Это предполагает, что EN1 и CNPY1 , относящиеся к дофаминергическим нейронам, контролируются CTCF и RAD21 .Также было показано, что MLANA, один из маркеров меланоцитов, контролируется CTCF , RAD21 и SUZ12 . С другой стороны, в hCOs были обнаружены FOXA1 , FOXA2 , HDAC2 , EP300 , NFIC , HNF4G , NR2F2 , CTBP2 и SUZ12 . , и были показаны более сложные и разнообразные факторы (рис. 5E).

    Наконец, чтобы исследовать гетерогенность и динамику экспрессии генов в hBSO, мы выполнили анализ scRNA-seq на 1-месячных hBSO.После обработки, контроля качества и фильтрации мы проанализировали в общей сложности 2345 клеток, экспрессирующих 19 454 гена. Чтобы идентифицировать отдельные популяции клеток на основе общих и уникальных паттернов экспрессии генов, мы выполнили уменьшение размерности и неконтролируемую кластеризацию клеток с использованием унифицированного многообразия аппроксимации и проекции (UMAP) (рис. 6А). График UMAP выявил 10 различных популяций клеток, состоящих из различных типов клеток. Популяции клеток идентифицировали на основе маркеров кластерных генов (дополнительная таблица S6) и экспрессии известных маркерных генов.Мы не смогли аннотировать кластер 1 и назвали этот кластер «неизвестным» (U). Точечный график показал набор генов, которые можно использовать для идентификации типов клеточной популяции (рис. 6B). Каждая клеточная популяция экспрессировала маркеры канонического типа клеток. Графики скрипки показали распределение интенсивности экспрессии маркерных генов в каждом кластере (Рисунок 6C и дополнительный рисунок S5). Кластер нейрональных предшественников экспрессировал гены клеточной пролиферации (например, MKI67 ) и маркеры нервных стволовых клеток (например, MKI67 ).г., ПЛАГЛ1 ). Кластер клеток радиальной глии экспрессировал PAX6, а кластер предшественников конечного мозга экспрессировал гены, связанные с развитием конечного мозга ( FOXG1 , LHX2 ) (Godbole et al., 2018). Кластер эпендимных клеток экспрессирует гены, связанные с развитием и формированием ресничек ( FOXJ1 , PIFO ) (Jacquet et al., 2009). Кластеры переднего и среднего мозга (FB / MB) экспрессируют гены предшественников переднего и среднего мозга ( OTX2 ).Кроме того, кластеры FB / MB экспрессировали дофаминергические ( FGFR2 , NR4A2 , LMX1A , CALB1 ), серотонинергические ( HTR2C ) и маркеры развития и дифференцировки меланоцитов (MITF) (Quilter et al. 2012; Ratzka et al., 2012; Anderegg et al., 2015). Кластер зрелых нейронов (mNeu) экспрессировал пан-нейрональные ( MAP2 , SNAP25 ), холинергические ( ACHE ) и глутаматергические ( SLC17A6 ) маркеры. Кластер заднего мозга экспрессировал гены образования мозжечка или продолговатого мозга ( ZIC1 , ZIC4 ) (Blank et al., 2011). Кластер воспаления экспрессировал гены клеток микроглии ( AIF1 ) и эндотелиальных клеток ( ICAM1 ). ScRNA-seq показал, что органоиды содержат различные типы клеток и подтипы нейронов.

    Рисунок 6. Анализ одноклеточной РНК-seq 1-месячных hBSO из hESC. (A) Неконтролируемая кластеризация всех клеток органоидов ствола мозга человека. INF; воспаление, НП; предшественники нейронов, TCP; предшественники конечностей, RGC; клетки радиальной глии, HB; задний мозг, ЭК; эпендимные клетки, FB / MB; передний и средний мозг — mNeu; зрелые нейроны, U; неизвестный. (B) Точечные графики, показывающие выбор генов, которые идентифицируют типы популяций клеток. (C) График распределения клеток OTX2, FGFR2, ZIC4 и MAP2.

    Обсуждение

    Насколько нам известно, это первый случай успешного индуцирования hBSO с темными клетками, такими как меланоциты. Эти клетки происходят из нервного гребня и происходят от границы между средним мозгом плода и задним мозгом. Используя qPCR, IHC, RNA-seq, scRNA-seq и масс-спектрометрию, мы наблюдали профиль экспрессии генов, подобный таковому в стволе мозга человеческого плода в hBSO, которые культивировались в течение 28 дней.Мы построили наш текущий протокол на основе существующих протоколов для органоидов человеческого мозга. В частности, мы были вдохновлены Ланкастером и его коллегами (Lancaster et al., 2013; Lancaster and Knoblich, 2014), которые обнаружили, что их органоиды, полученные с наименьшим использованием факторов роста, состоят из нейроэктодермальных тканей с множественными идентичностями, такими как как кора головного мозга, гиппокамп и сетчатка. В другом ключевом исследовании Муотри и его коллеги сообщили о протоколе, в котором корковые органоиды индуцировались электрофизиологически активными нейронами с глутаматергической и ГАМКергической передачей сигналов (Trujillo et al., 2018). Мы разработали наш протокол на основе этих существующих отчетов и использовали выбранные гормоны, такие как человеческий инсулин, трансферрин и прогестерон, которые, как было установлено, обладают защитным действием или поддерживают выживание и дифференциацию дофаминергических нейронов и клеток линии передачи нервного гребня (Ciarlo et al. др., 2017; Frith, Tsakiridis, 2019). Следует отметить, что наши результаты показывают, что использование орбитального шейкера могло способствовать быстрой индукции hBSO за счет достижения идеального градиента концентрации факторов роста.Учитывая, что наш протокол не содержит sonic hedgehog (SHH) или WNT, необходимых для индукции вентрального среднего мозга (Tang et al., 2010), и что присутствие меланоцитов подразумевает присутствие дорсальных тканей ствола мозга, доказательства наличия нейронов mDA в hBSOs интересно. Вероятно, что эти факторы секретировались соседними клетками в популяции hBSO.

    hBSO и органоиды среднего мозга, о которых ранее сообщалось, содержали характерные темные пятна, имитирующие наличие нейромеланина.Учитывая, что нейромеланин образуется в течение нескольких лет в результате накопления отходов, полученных из катехоламинов, темные пятна, наблюдаемые в ранее описанных протоколах среднего мозга и органоидов, могут иметь меланоциты, такие как те, которые обнаруживаются в hBSOs. Однако, насколько нам известно, ни одно из существующих исследований органоидов среднего мозга не идентифицировало такие производные нервного гребня клетки в их органоидах.

    Наши результаты показывают, что hBSO имитируют широкую область ствола мозга плода и окружающий нервный гребень, поскольку известно, что краниальные меланобласты происходят из нервного гребня вокруг среднего мозга и распространяются на всю краниальную область (Adameyko et al., 2012; Denecker et al., 2014). Наши наблюдения высоких экспрессий Wnt1 в hBSOs, которые характеризуют нервный гребень (Adameyko et al., 2012), согласуются с этой идеей. Наши текущие результаты также обеспечивают основу для будущих исследований наследственных заболеваний, вызванных нарушениями миграции нервного гребня.

    Мы хотели бы предложить два возможных применения на основе наших текущих результатов: (1) использовать hBSO в качестве инструмента для скрининга лекарств и (2) применить hBSO в качестве эффективного инструмента для моделирования заболеваний нервного гребня.Во-первых, быстрая индукция hBSO позволит более эффективно проводить скрининг лекарств и ускорить исследования молекулярных механизмов, вызывающих нейродегенеративные заболевания ствола мозга. Электрофизиологический анализ hBSO в возрасте 1,5 месяцев выявил нейроны, которые проявляли потенциалы действия и гиперполяризационные ответы со скачками напряжения, связанными с активацией активированных гиперполяризацией катионных каналов циклических нуклеотидов (HCN) (Robinson and Siegelbaum, 2003; He et al. ., 2014). Это открытие предполагает, что каналы HCN, а также спайковые каналы Na + и K + экспрессируются на ранней стадии hBSO.Это также предполагает наличие гетерогенной популяции нейронов, которая способна проявлять различные электрофизиологические свойства органоида.

    Второе возможное применение hBSO заключается в их полезности в исследованиях взаимодействия между клетками ствола мозга и нервного гребня. Например, сообщается, что функции ствола мозга нарушаются при типичных нарушениях нервного гребня, синдроме Ди Джорджи и синдроме Ваарденбурга-Шаха (Wang et al., 2017; Nusrat et al., 2018). Тем не менее, модели таких заболеваний еще предстоит установить, а их патологии еще предстоит выяснить. Мы видим потенциал в применении hBSO, разработанных в нашем текущем исследовании, поскольку они содержат клетки нервного гребня и могут быть мощным инструментом для выяснения механизмов, вызывающих такие заболевания нервного гребня.

    Заявление о доступности данных

    Наборы данных, сгенерированные и проанализированные в ходе текущего исследования, доступны под следующими номерами доступа DRA009864 (RNA-seq) в DDBJ (Банк данных ДНК Японии), JPST000707 (масс-спектрометрия) в JPOST (Японский стандартный репозиторий / база данных протеомов) и GSE145306 (scRNA-seq) в GEO (Gene Expression Omnibus).

    Авторские взносы

    NE, TM, JL, JS, KS и EM разработали исследование. NE, TM, JL, MMatsubayashi, HN, TShiota, NI, T.Kiriyama, CZ, TKouno, YL, PK, PW, YMS, RN, TKomeda, NM, FK, MJ, SK, MN, MH, YS, TShiromizu, YN, TKasai, MT, HKobayashi, YI, YT, MMakinodan, TKishimoto, HKuniyasu, SN, JS, KS и EM провели исследование. NE, TM, JL, YS, TShiromizu, YN, TKasai, MT, SN, AM, JS, KS и EM проанализировали данные. NE, TM, JL, KK, YS, TShiromizu, YN, TKasai, MT, SN, JS, KS и EM написали рукопись.Все авторы внесли свой вклад в доработку рукописи, прочитали и одобрили представленную версию.

    Конфликт интересов

    Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

    Финансирование

    Эта работа была поддержана грантами от JSPS KAKENHI (JP20H03199 для EM, JP20K16606 для NE, JP19K16925 для TM, JP19K21306, JP20K16583 для HN, JP19K17043 для TShiota, JP19K23952 для KK, JP19K17044 для NI JP19K23976 — MN), AMED Программа технологических инноваций в регенеративной медицине (JP19bm0704039h — TM), AMED Osaka University Seeds (A) to TM, Takeda Science Foundation — EM и TM, AMED Brain / MINDS Beyond (JP20dm0307032 — EM), Канзава Фонд медицинских исследований — EM, Мемориальный фонд Уэхары — EM, Фонд Накатоми — EM, Научно-технический фонд Konica Minolta — EM, Фонд Naito — EM, Фонд наук о жизни MSD — EM, Мемориальный фонд Mochida для медицинских и фармацевтических исследований — EM, SENSHIN Фонд медицинских исследований для EM, Фонд Terumo для наук о жизни и искусств для EM, Фонд исследования болезней почек Nara для EM, гранты Novartis на исследования для EM, KS и NE, Sumitomo Dainippon Pharma Resea rch Grant TM, Грант Медицинского университета Нары для совместных исследовательских проектов для KS и HKuniyasu, Грант Медицинского университета Нары для молодых ученых в NE и TM, а также за счет неограниченных средств, предоставленных EM от доктораТайчи Нода (KTX Corp., Айти, Япония) и доктор Ясухиро Хори (Косейкай, Нара, Япония). Авторы заявляют, что это исследование получило финансирование от вышеупомянутых сторон. Спонсоры не участвовали в разработке, сборе, анализе, интерпретации данных, написании этой статьи или решении представить ее для публикации. Эта рукопись была выпущена в качестве предварительной печати на сайте bioRxiv (Eura et al., 2019).

    Благодарности

    Авторы благодарят Дженни Хси (Техасский университет в Сан-Антонио), Керен-Хаппуч Э.Фан Фен, Норико Хории (факультет анатомии и клеточной биологии, Медицинский университет Нара) и Йенс Кристиан Швамборн (Люксембургский центр системной биомедицины, Университет Люксембурга) за их критическое прочтение рукописи.

    Дополнительные материалы

    Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fnins.2020.00538/full#supplementary-material

    Сноски

    Список литературы

    Адамейко, И., Лаллеменд, Ф., Фурлан, А., Зинин, Н., Аранда, С., Китамби, С.С. и др. (2012). Перекрестные регуляторные взаимодействия Sox2 и Mitf консолидируют клоны предшественников и меланоцитов в краниальном нервном гребне. Развитие 139, 397–410. DOI: 10.1242 / dev.065581

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Андерегг А., Пулин Дж. Ф. и Аватрамани Р. (2015). Молекулярная гетерогенность дофаминергических нейронов среднего мозга — движение к разрешению одной клетки. FEBS Lett. 589, 3714–3726. DOI: 10.1016 / j.febslet.2015.10.022

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Андерссон, Э., Трюггвасон, У., Дэн, К., Фрилинг, С., Алексеенко, З., Роберт, Б., и др. (2006). Идентификация внутренних детерминант дофаминовых нейронов среднего мозга. Ячейка 124, 393–405. DOI: 10.1016 / j.cell.2005.10.037

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Эйтон, С., Лей, П., Маклин, К., Буш А.И., Финкельштейн Д.И. (2016). Трансферрин защищает от паркинсонической нейротоксичности и недостаточен в черной субстанции Паркинсона. Знак. Transduct Target Ther. 1: 16015. DOI: 10.1038 / sigtrans.2016.15

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Бланк, М. К., Гринберг, И., Арье, Э., Лалиберте, К., Чижиков, В. В., Хенкельман, Р. М. и др. (2011). Множественные программы развития изменяются из-за потери Zic1 и Zic4, что приводит к патогенезу мозжечкового патогенеза мальформации Денди-Уокера. Развитие 138, 1207–1216. DOI: 10.1242 / dev.054114

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ciarlo, C., Kaufman, C. K., Kinikoglu, B., Michael, J., Yang, S., Csaa, D. A., et al. (2017). Химический скрининг эмбриональных клеток рыбок данио устанавливает, что активация Akt необходима для развития нервного гребня. eLife 6: 29145. DOI: 10.7554 / eLife.29145

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Данг, Дж., Тивари, С.К., Личинчи, Г., Цинь, Ю., Патил, В.С., Ерошкин, А.М. и др. (2016). Вирус Зика истощает нейральные предшественники в органоидах головного мозга человека за счет активации рецептора врожденного иммунитета TLR3. Стволовые клетки клетки 19, 258–265. DOI: 10.1016 / j.stem.2016.04.014

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Денекер, Г., Вандамм, Н., Акай, О., Колудрович, Д., Таминау, Дж., Лемейр, К. и др. (2014). Идентификация транскрипционной сети ZEB2-MITF-ZEB1, которая контролирует меланогенез и прогрессирование меланомы. Cell Death Differ. 21, 1250–1261. DOI: 10.1038 / cdd.2014.44

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Диас, Н. Ф., Диас-Мартинес, Н. Э., Веласко, И., и Камачо-Арройо, И. (2009). Прогестерон увеличивает количество дофаминовых нейронов в дифференцирующихся эмбриональных стволовых клетках мыши. J. Neuroendocrinol. 21, 730–736. DOI: 10.1111 / j.1365-2826.2009.01891.x

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Эйраку, М., Таката, Н., Исибаши, Х., Кавада, М., Сакакура, Э., Окуда, С. и др. (2011). Самоорганизующийся морфогенез глазного яблока в трехмерной культуре. Природа 472, 51–56. DOI: 10.1038 / nature09941

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Эура, Н., Мацуи, Т. К., Лугинбюль, Дж., Мацубаяши, М., Нанаура, Х., Шиота, Т. и др. (2019). Органоиды ствола мозга из плюрипотентных стволовых клеток человека содержат популяцию нервного гребня. bioRxiv [Препринт] doi: 10.1101/829275

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Фремо, Р. Т. младший, Фоглмайер, С., Сил, Р. П., и Эдвардс, Р. Х. (2004). VGLUT определяют подмножества возбуждающих нейронов и предполагают новые роли глутамата. Trends Neurosci. 27, 98–103. DOI: 10.1016 / j.tins.2003.11.005

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Фрит, Т. Дж. Р., и Цакиридис, А. (2019). Эффективная генерация ствола нервного гребня и симпатических нейронов из плюрипотентных стволовых клеток человека через промежуточный нейромезодермальный осевой предшественник. Curr. Protoc. Stem Cell Biol. 49: e81. DOI: 10.1002 / cpsc.81

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Gerstein, M. B., Kundaje, A., Hariharan, M., Landt, S. G., Yan, K. K., Cheng, C., et al. (2012). Архитектура регулирующей сети человека, полученная из данных ENCODE. Природа 489, 91–100. DOI: 10.1038 / nature11245

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Годбол, Г., Шетти, А.С., Рой, А., D’souza, L., Chen, B., Miyoshi, G., et al. (2018). Иерархические генетические взаимодействия между FOXG1 и LHX2 регулируют формирование кортикального рубца в развивающемся конечном мозге. Разработка 145: dev154583. DOI: 10.1242 / dev.154583

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Хафемейстер К. и Сатия Р. (2019). Нормализация и стабилизация дисперсии одноклеточных данных последовательности РНК с использованием регуляризованной отрицательной биномиальной регрессии. Genome Biol. 20: 296. DOI: 10.1186 / s13059-019-1874-1

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Хе К., Чен Ф., Ли Б. и Ху З. (2014). Нейрофизиология каналов HCN: от клеточных функций до множественных регуляций. Прог. Neurobiol. 112, 1–23. DOI: 10.1016 / j.pneurobio.2013.10.001

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Жаке, Б.В., Салинас-Мондрагон, Р., Лян, Х., Терит, Б., Буйе, Дж. Д., Дикстра, М., и другие. (2009). FoxJ1-зависимая экспрессия гена необходима для дифференцировки радиальной глии в эпендимные клетки и субпопуляцию астроцитов в постнатальном мозге. Разработка 136, 4021–4031. DOI: 10.1242 / dev.041129

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Янки, Р., Верфейли, А., Имрихова, Х., Ван де Санде, Б., Стандерт, Л., Кристиаенс, В., и др. (2014). iRegulon: от списка генов до сети регуляции генов с использованием больших мотивов и коллекций треков. PLoS Comput. Биол. 10: e1003731. DOI: 10.1371 / journal.pcbi.1003731

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Джо, Дж., Сяо, Ю., Сан, А. X., Чукуроглу, Э., Тран, Х. Д., Гоке, Дж. И др. (2016). Органоиды, подобные среднему мозгу, из плюрипотентных стволовых клеток человека содержат функциональные дофаминергические и нейромеланин-продуцирующие нейроны. Стволовые клетки клетки 19, 248–257. DOI: 10.1016 / j.stem.2016.07.005

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Киттаппа, Р., Чанг, В. В., Аватрамани, Р. Б., и Маккей, Р. Д. (2007). Ген foxa2 контролирует рождение и спонтанную дегенерацию дофаминовых нейронов в пожилом возрасте. PLoS Biol. 5: e325. DOI: 10.1371 / journal.pbio.0050325

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ланкастер, М. А., Реннер, М., Мартин, К. А., Венцель, Д., Бикнелл, Л. С., Херлз, М. Е. и др. (2013). Церебральные органоиды моделируют развитие человеческого мозга и микроцефалию. Природа 501, 373–379.DOI: 10.1038 / nature12517

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ли, Дж. Э., Лим, М. С., Парк, Дж. Х., Парк, К. Х. и Кох, Х. С. (2016). PTEN способствует дифференцировке дофаминергических нейронов посредством регуляции ERK-зависимого ингибирования передачи сигналов S6K в нервных стволовых клетках человека. Стволовые клетки Пер. Med. 5, 1319–1329. DOI: 10.5966 / sctm.2015-0200

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Лин В., Мецакопян Э., Mavromatakis, Y.E., Gao, N., Balaskas, N., Sasaki, H., et al. (2009). Foxa1 и Foxa2 функционируют как выше по течению, так и совместно с Lmx1a и Lmx1b в петле прямого распространения, способствующей развитию мезодиэнцефальных дофаминергических нейронов. Dev. Биол. 333, 386–396. DOI: 10.1016 / j.ydbio.2009.07.006

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Накано Т., Андо С., Таката Н., Кавада М., Мугурума К., Секигучи К. и др. (2012). Самообразование глазных бокалов и хранимой стратифицированной нервной сетчатки из человеческих ESCs. Стволовые клетки клетки 10, 771–785. DOI: 10.1016 / j.stem.2012.05.009

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Нортон В. Х., Манголи М., Леле З., Погода Х. М., Даймонд Б., Меркурио С. и др. (2005). Monorail / Foxa2 регулирует дифференцировку пластин основания и спецификацию олигодендроцитов, серотонинергических нейронов шва и черепных мотонейронов. Развитие 132, 645–658. DOI: 10.1242 / dev.01611

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Нусрат, М., Тарик, М.А., Аслам, С., Зил, Э.А.А., Шахид, М., и Махмуд, С. (2018). Случай синдрома Ваарденбурга-Шаха типа 4, проявляющийся двусторонними гомохроматическими голубыми радужками из Пакистана. Cureus 10: e3143. DOI: 10.7759 / cureus.3143

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Панман Л., Папатану М., Лагуна А., Остервен Т., Волакакис Н., Акампора Д. и др. (2014). Sox6 и Otx2 контролируют спецификацию дофаминовых нейронов черной субстанции и вентральной тегментальной области. Cell Rep. 8, 1018–1025. DOI: 10.1016 / j.celrep.2014.07.016

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Квилтер, К. Р., Багга, М., Мойни, А., Джунаид, Ф., и Сарджент, К. А. (2012). Структура гена и экспрессия серотонинового рецептора HTR2C в образцах гипоталамуса от инфантицидных и контрольных свиноматок. BMC Neurosci. 13:37. DOI: 10.1186 / 1471-2202-13-37

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Рацка, А., Барон, О., Стаховяк, М. К., и Грот, К. (2012). Фактор роста фибробластов 2 регулирует развитие дофаминергических нейронов in vivo. J. Neurochem. 122, 94–105. DOI: 10.1111 / j.1471-4159.2012.07768.x

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Рибес, В., Баласкас, Н., Сасаи, Н., Круз, К., Дессо, Э., Каюсо, Дж. И др. (2010). Отчетливая динамика передачи сигналов Sonic Hedgehog определяет пластинку дна и предшественников вентральных нейронов в нервной трубке позвоночных. Genes Dev. 24, 1186–1200. DOI: 10.1101 / gad.559910

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Робинсон, Р. Б., и Сигельбаум, С. А. (2003). Катионные токи, активируемые гиперполяризацией: от молекул к физиологической функции. Annu. Rev. Physiol. 65, 453–480. DOI: 10.1146 / annurev.physiol.65.092101.142734

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Сасаки Х. и Хоган Б. Л. (1993). Дифференциальная экспрессия нескольких генов, связанных с головкой вилки, во время гаструляции и формирования осевого паттерна у эмбриона мыши. Развитие 118, 47–59.

    Google Scholar

    Сатия Р., Фаррелл Дж. А., Геннерт Д., Шир А. Ф. и Регев А. (2015). Пространственная реконструкция данных экспрессии генов одной клетки. Nat. Biotechnol. 33, 495–502. DOI: 10.1038 / NBT.3192

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Sato, T., Vries, R.G., Snippert, H.J., Van De Wetering, M., Barker, N., Stange, D.E., et al. (2009). Одиночные стволовые клетки Lgr5 строят структуры крипта-ворсинки in vitro без мезенхимальной ниши. Природа 459, 262–265. DOI: 10.1038 / nature07935

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Сауседо-Карденас, О., Кинтана-Хау, Дж. Д., Ле, В. Д., Смидт, М. П., Кокс, Дж. Дж., Де Майо, Ф. и др. (1998). Nurr1 важен для индукции дофаминергического фенотипа и выживания вентральных мезэнцефальных поздних дофаминергических нейронов-предшественников. Proc. Natl. Акад. Sci. США 95, 4013–4018. DOI: 10.1073 / pnas.95.7.4013

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Согомонян, Дж.Дж. И Мартин Д. Л. (1998). Две изоформы глутаматдекарбоксилазы: почему? Trends Pharmacol. Sci. 19, 500–505. DOI: 10.1016 / s0165-6147 (98) 01270-x

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Спокони, Р. Ф., Аоки, Ю., Сен-Жермен, Н., Магнер-Финк, Э., и Сен-Жаннет, Дж. П. (2002). Фактор транскрипции Sox9 необходим для развития краниального нервного гребня у Xenopus. Развитие 129, 421–432.

    Google Scholar

    Сторнетта, Р.Л., Макон, К. Дж., Нгуен, Т. М., Коутс, М. Б., и Гуйен, П. Г. (2013). Холинергические нейроны в ростральном вентролатеральном мозговом веществе мыши нацелены на сенсорные афферентные области. Brain Struct. Функц. 218, 455–475. DOI: 10.1007 / s00429-012-0408-3

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Сан, Дж., Нисияма, Т., Симидзу, К., и Кадота, К. (2013). TCC: пакет R для сравнения данных подсчета тегов с надежными стратегиями нормализации. BMC Bioinformatics 14: 219.DOI: 10.1186 / 1471-2105-14-219

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Суонсон, Л. В., и Хартман, Б. К. (1975). Центральная адренергическая система. Иммунофлуоресцентное исследование расположения тел клеток и их эфферентных связей у крыс с использованием дофамин-бета-гидроксилазы в качестве маркера. J. Comp. Neurol. 163, 467–505. DOI: 10.1002 / cne.0406

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Такасато, М., Er, P.X., Chiu, H. S., Maier, B., Baillie, G.J., Ferguson, C., et al. (2015). Органоиды почек из iPS-клеток человека содержат множество клонов и моделируют нефрогенез человека. Природа 526, 564–568. DOI: 10.1038 / nature15695

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Тан, М., Вильяэскуса, Дж. К., Луо, С. X., Гитарте, К., Лей, С., Миямото, Ю., и др. (2010). Взаимодействие передачи сигналов Wnt / beta-catenin и sonic hedgehog регулирует нейрогенез вентральных дофаминовых нейронов среднего мозга. J. Neurosci. 30, 9280–9291. DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.0860-10.2010

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Thomas, C. A., Tejwani, L., Trujillo, C. A., Negraes, P. D., Herai, R.H., Mesci, P., et al. (2017). Моделирование TREX1-зависимого аутоиммунного заболевания с использованием стволовых клеток человека подчеркивает накопление l1 как источник нейровоспаления. Стволовая клетка 21: 319-331.e8. DOI: 10.1016 / j.stem.2017.07.009

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Тул, П.J., Akesson, L., Wiking, M., Mahdessian, D., Geladaki, A., Ait Blal, H., et al. (2017). Субклеточная карта протеома человека. Наука 356: eaal3321. DOI: 10.1126 / science.aal3321

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Трухильо К. А., Гао Р., Неграс П. Д., Хаим И. А., Домисси А., Ванденберге М. и др. (2018). Вложенная колебательная динамика в корковых органоидах моделирует раннее развитие сети мозга человека. biorxiv [Препринт] doi: 10.1101/358622

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Трухильо, К. А., Гао, Р., Неграс, П. Д., Гу, Дж., Бьюкенен, Дж., Прейссл, С. и др. (2019). Сложные колебательные волны, исходящие от органоидов коры, моделируют раннее развитие сети мозга человека. Стволовая клетка 25: e557. DOI: 10.1016 / j.stem.2019.08.002

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Уэцука, С., Огата, Г., Нагамори, С., Исодзуми, Н., Нин, Ф., Йошида, Т. и др.(2015). Молекулярная архитектура мембранной транспортной системы stria vascularis, которая важна для физиологических функций улитки млекопитающих. Eur. J. Neurosci. 42, 1984–2002. DOI: 10.1111 / ejn.12973

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Улен М., Фагерберг Л., Халльстрем Б. М., Линдског К., Оксволд П., Мардиноглу А. и др. (2015). Протеомика. Тканевая карта протеома человека. Наука 347: 1260419. DOI: 10.1126 / наука.1260419

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Uhlen, M., Zhang, C., Lee, S., Sjostedt, E., Fagerberg, L., Bidkhori, G., et al. (2017). Атлас патологии транскриптома рака человека. Наука 357: eaan2507. DOI: 10.1126 / science.aan2507

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ван Х., Брайан К., Ламантия А. С. и Менделовиц Д. (2017). Измененная нейробиологическая функция нейронов подъязычного ствола мозга у DiGeorge / 22q11.2 Синдром делеции. Неврология 359, 1–7. DOI: 10.1016 / j.neuroscience.2017.06.057

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Wei, Q., Miskimins, W. K., and Miskimins, R. (2003). Клонирование и характеристика промотора гена основного белка миелина крысы. Ген 313, 161–167. DOI: 10.1016 / s0378-1119 (03) 00675-9

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Чжэн, Г. X., Терри, Дж. М., Белградер, П., Рывкин, П., Бент, З.W., Wilson, R. и др. (2017). Массивно-параллельное цифровое транскрипционное профилирование отдельных клеток. Nat. Commun. 8: 14049. DOI: 10.1038 / ncomms14049

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Organoids, UC San Diego Health

    For Media

    Позвоните по телефону 858-249-0456
    Страница 619-290-2688
    Электронная почта

    Для пациентов:

    Это исследование еще не используется в лечении пациентов. Если вы хотите записаться на прием в Калифорнийский университет в Сан-Диего, позвоните по нашей основной линии:
    858-657-7000

    Это не научная фантастика: исследователи Калифорнийского университета в Сан-Диего разрабатывают человеческие органоиды — миниатюрные трехмерные версии органа, произведенного из перепрограммировали стволовые клетки в лаборатории.Эти модели, иногда называемые «мини-мозгами» или «органами на тарелке», позволили ученым более реалистично и более подробно изучать биологические функции, заболевания и методы лечения.

    До сих пор этот подход использовался для получения первого прямого экспериментального доказательства того, что вирус Зика может вызывать серьезные врожденные дефекты, для перепрофилирования существующих лекарств от ВИЧ для лечения редкого неврологического расстройства, для изучения влияние метадона на развитие мозга, и изучить, что отличает нас от наших Предки неандертальцев.

    Теперь исследователи могут даже обнаруживать мозговые волны недоношенного ребенка от органоидов мозга, а крошечные мозги путешествовали на Международную космическую станцию ​​и с нее в рамках исследования развития человека в условиях микрогравитации.

    Пресс-релизы В новостях

    Фотогалерея


    • Поперечный срез органоида, инфицированного вирусом Зика. Клетки-предшественники коры — красные, нейроны — зеленые, ядра клеток — синие.Предоставлено: Алиссон Муотри, Калифорнийский университет в Сан-Диего.

    • Органоиды в чашке Петри. Предоставлено: Алиссон Муотри, Калифорнийский университет в Сан-Диего.

    • Алиссон Муотри, доктор философии

    • Органоидная модель расстройства аутистического спектра. Предоставлено: Алиссон Муотри, Калифорнийский университет в Сан-Диего.

    • Органоид самоорганизующийся. Клетки-предшественники нейронов — зеленого цвета, нейроны коркового слоя — красного цвета, ядра клеток — синего цвета.Предоставлено: Клебер А. Трухильо, Калифорнийский университет в Сан-Диего.

    Эффективное отслеживание ячеек с использованием машинного обучения и ручного исправления ошибок

    Образец цитирования: Kok RNU, Hebert L, Huelsz-Prince G, Goos YJ, Zheng X, Bozek K, et al. (2020) OrganoidTracker: эффективное отслеживание клеток с использованием машинного обучения и ручного исправления ошибок. PLoS ONE 15 (10): e0240802. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0240802

    Редактор: Джозеф Найбауэр, Медицинский факультет Печского университета, ВЕНГРИЯ

    Поступила: 19.05.2020; Одобрена: 5 октября 2020 г .; Опубликовано: 22 октября 2020 г.

    Авторские права: © 2020 Kok et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

    Доступность данных: Программное обеспечение доступно на Github, https://github.com/jvzonlab/OrganoidTracker. Предварительно обученная нейронная сеть доступна в репозитории DANS, https://doi.org/10.17026/dans-274-a78v. Все другие соответствующие данные находятся в документе и его файлах с вспомогательной информацией.

    Финансирование: R.K. и X.Z финансировались грантом NWO Building Blocks of Life от Нидерландского исследовательского совета, номер 737.016.009, https://www.nwo.nl/. G.H.P и J.S.v.Z были поддержаны грантом NWO Vidi Голландского исследовательского совета, номер 680-47-529, https://www.nwo.nl/. K.B., L.H. и G.J.S. были поддержаны в проекте средствами OIST Graduate University, https://oist.jp/. Другие авторы не получали специального финансирования на эту работу. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

    Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

    Введение

    Все чаще ученые изучают развитие и гомеостаз органов на одноклеточном уровне [1–3]. Изобретение органоидов, которые представляют собой мини-органы, выращенные in vitro и имитирующие клеточную структуру и некоторые функции органа [4], сделало возможным изучение тканей на уровне детализации, который ранее был невозможен. В настоящее время органоиды могут имитировать все большее количество органов с улучшенной точностью и сложностью [5, 6].Способность следить за отдельными клетками позволит напрямую выявить исторические генеалогические отношения между клетками, их изменяющуюся пространственную организацию, их клеточные деления и гибели, и может быть объединена с маркерами дифференцировки клеток и других жизненно важных клеточных процессов. Выяснение этой пространственно-временной динамики клеток будет иметь ключевое значение для понимания развития органов и гомеостаза тканей, а также связанных с ними патологий.

    С 1960-х годов исследователи использовали алгоритмы для автоматического обнаружения клеток по изображениям микроскопа [7].Традиционно алгоритмы автоматического отслеживания ячеек основывались на правилах, то есть они полагались на наборы дискретных правил для обнаружения ячеек. Такие подходы успешно применялись для автоматического обнаружения и отслеживания клеток в очень сложных многоклеточных системах, таких как эмбрионы ранних плодовых мух, рыбок данио и мыши [8]. Однако органоиды часто представляют взрослые (эпителиальные) ткани и поэтому создают определенные проблемы для автоматического отслеживания клеток с использованием подходов, основанных на правилах, по сравнению с ранним эмбриогенезом.Во-первых, во время деления клеток в эпителии взрослых клеток ядра быстро перемещаются от базальной к апикальной стороне клетки и обратно после деления [9]. Это быстрое ядерное движение является сложной задачей, поскольку клеточные трекеры обычно полагаются на обнаружение флуоресцентно меченых ядер клеток для отслеживания. Во-вторых, в эпителии ядра плотно упакованы, и микроскопические изображения часто показывают перекрытие сигнала флуоресценции между соседними ядрами из-за ограничений в оптическом разрешении. Наконец, во взрослом эпителии клетки быстро оборачиваются, что делает гибель клеток обычным явлением [10].Полученные в результате клеточные остатки имеют внешний вид, аналогичный ядрам живых клеток, и, следовательно, их следует исключать как ложноположительные. В последние годы систематическое сравнение производительности трекеров ячеек показало, что сверточные нейронные сети превосходят основанные на правилах подходы по точности обнаружения ячеек [11]. Сверточные нейронные сети уже успешно используются для микроскопии изображений клеток в 2D [12–16], а также в 3D [17–19]. Поэтому мы решили использовать сверточные нейронные сети в качестве основы для разработки подхода к отслеживанию большинства, если не всех отдельных клеток в покадровой видеозаписи растущих органоидов.

    Ключевой проблемой при использовании сверточных нейронных сетей является получение достаточного количества аннотированных данных микроскопии для обучения. Тренировочные данные обычно сначала генерируются вручную, а затем часто дополняются вращением, масштабированием и изменением яркости и контрастности изображений [18] или даже с помощью нейронных сетей, которые генерируют синтетические микроскопические изображения в дополнение к обучающим данным [19]. Для обнаружения ядер с флуоресцентной меткой в ​​покадровой видеозаписи появились два разных подхода.В первом подходе нейронные сети обучаются сегментировать отдельные ядра [20]. Это имеет то преимущество, что он предоставляет информацию не только о положении клетки, но также о форме и объеме ядра, которые можно использовать для идентификации того же ядра в последующих кадрах. Однако это имеет тот недостаток, что создание сегментированных вручную данных обучения очень сложно. Во втором подходе нейронные сети обучаются только предсказывать расположение центров каждого ядра [13, 17, 21]. Хотя это дает мало информации о форме ядра, создание обучающих данных значительно проще, поскольку для каждого ядра требуется аннотировать только одну точку.Здесь мы следуем второму подходу, что позволяет нам использовать обширный набор сгенерированных нами вручную аннотированных данных изображений. Мы комбинируем его с техникой предоставления входных координат изображения в нейронную сеть [22], что позволяет оптимизировать обнаружение ячеек для различной глубины в стеке изображений.

    Чтобы связать положения клеток, генерируемые сверточной нейронной сетью, с траекториями клеток и правильно отслеживать идентичность клеток во время делений клеток, мы используем решатель потока с минимальной стоимостью [23], который мы дополнительно оптимизировали для обнаружения делений клеток в органоидах.Отслеживание всех клеток и их делений во всех органоидах повышает возможность прямого измерения клонов клеток, например паттерны деления, с помощью которых взрослые стволовые клетки производят дифференцированные клетки. Чтобы достичь этого, обнаружение клеток и связывание должны происходить с высокой точностью, поскольку один переключатель в идентификаторах клеток может иметь глубокое влияние на результирующую клеточную линию. По этой причине мы следовали подходу в работах [1,2,3]. [24–26] и реализованы инструменты для ручной обработки данных автоматического отслеживания для устранения таких ошибок, при этом программное обеспечение помечает данные отслеживания, которые, вероятно, ошибочны для последующего изучения пользователем.

    Мы проверили способность этого подхода выполнять автоматическое отслеживание всех клеток в органоидах кишечника, которые являются органоидами, моделирующими эпителий тонкой кишки [10]. Кишечный эпителий быстро обновляется; у млекопитающих каждые пять дней стволовые клетки заменяют почти все дифференцированные клетки. Это приводит к потоку клеток из компартмента стволовых клеток (крипты) в компартмент, где полностью дифференцированные клетки умирают (ворсинки). Органоиды кишечника содержат все типы клеток кишечного эпителия [27], что делает их очень ценной модельной системой для биологии кишечника.Используя наш подход, мы могли получить данные отслеживания того же качества, что и данные тренировки, аннотированные вручную, но для целых органоидов и с гораздо большей скоростью. Используя отслеживаемые данные, мы впервые смогли установить сложные клеточные линии до пяти поколений и визуализировать пространственные закономерности клеточного деления и гибели клеток по всему органоиду. Такие данные позволят изучить клеточные деления, движение и смерть на уровне тканей с высоким разрешением по времени и, вероятно, дадут новое понимание того, как и когда клетки принимают решения о своей клеточной судьбе.

    Результаты

    Обзор подхода к отслеживанию ячеек

    Мы заинтересованы в отслеживании клеток в замедленной съемке растущих органоидов кишечника. В видеороликах мы наблюдаем ядра клеток, которые были сделаны флуоресцентными с помощью h3B-mCherry. Видео имеют продолжительность до 65 часов с разрешением по времени, установленным на 12 минут, что дает видео от 84 до 325 временных точек. Каждый пиксель имеет размер 0,32 x 0,32 мкм, а расстояние между двумя z-слоями составляет 2 мкм. Как видно на рис.1, изображения имеют неравномерную интенсивность флуоресценции, которая вызвана не только собственными вариациями флуоресценции ядра, но и расположением клеток: некоторые части органоидов перенасыщены, а части находятся глубже внутри органоидов. ненасыщены.Ядра могут визуально перекрываться, особенно в перенасыщенных частях изображений. Кроме того, органоиды обладают высокой ядерной плотностью с большим изменением формы, ориентации и интенсивности ядер. Более того, требование ограничить фототоксичность приводит к получению низкоконтрастных изображений. Наконец, изображения страдают от низкого разрешения по оси Z. Все эти факторы затрудняют автоматическое распознавание ядер.

    Рис. 1. Пример отслеживаемого органоида.

    Микроскопия срезов изображений в плоскостях xy и xz с использованием h3B-mCherry для визуализации ядер клеток.Синие стрелки указывают, что оба фрагмента изображения на одной панели представляют одни и те же пиксели. Обратите внимание, что разрешение по оси z ниже. Изображения показывают, что есть как изменение интенсивности, так и визуальное перекрытие ядер (обозначено оранжевыми стрелками), особенно в z-направлении. Масштабная линейка 10 мкм.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0240802.g001

    Отображаемая область органоида обычно содержит более 200 клеток, что делает невозможным ручное отслеживание.Вместо этого мы ранее получили (будут отправлены) данные отслеживания вручную для части отображаемой области, а именно области склепа. Для этой области положение центра около 70 ядер было зарегистрировано вручную. Центральное положение каждого ядра измерялось на глаз и, следовательно, могло отличаться на несколько пикселей. Кроме того, были созданы связи между одними и теми же ядрами в разные моменты времени, так что ядра можно было отслеживать с течением времени. В общей сложности ручное отслеживание было выполнено для 2826 временных точек по 17 различным органоидам.

    В нашем подходе к отслеживанию ячеек мы используем сверточную нейронную сеть для обнаружения ячеек, решатель потока с минимальной стоимостью [23] для связывания ячеек с течением времени и небольшой набор правил для обнаружения невероятных данных отслеживания ячеек, которые пользователь должен проверить и верный. Этот полный подход схематически показан на рис. 2. Шаг 1 формируется сверточной нейронной сетью: используя необработанные изображения, она выводит изображения с пиками в центре ядер. Эту сеть необходимо обучить с использованием достоверных данных, которые выполняются с использованием данных отслеживания вручную.Затем на шаге 2 клетки связываются с помощью решателя потока минимальной стоимости, который может обрабатывать деления клеток [23], который оптимизирует наименьшее перемещение клеток между временными точками, для наименьших изменений объема ядра между временными точками и для самые длинные клеточные треки. Наконец, на шаге 3 программа сообщает обо всех треках ячеек, которые она считает подозрительными, на основе небольшого набора правил, которые пользователь должен проверить. Для нас этот рабочий процесс привел к тому, что треки ячеек были того же качества, что и ручное отслеживание, хотя и получались намного быстрее.

    Рис. 2. Обзор программы отслеживания.

    Используя достоверные данные о расположении ядер на микроскопических изображениях (полученных при ручном обнаружении), обучается сверточная нейронная сеть. Эта обученная сеть затем используется для обнаружения (шаг 1) ячеек на новых изображениях. Затем обнаружения связываются во времени (шаг 2), после чего пользователь вручную корректирует вывод с помощью средства проверки ошибок (шаг 3). В принципе, данные, скорректированные вручную, могут использоваться в качестве дополнительных достоверных данных для улучшения обучения сверточной нейронной сети, что приводит к эффективному итеративному повышению производительности сверточной нейронной сети (пунктирная линия).

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0240802.g002

    Шаг 1: Автоматическое обнаружение клеток

    Позиции центров ядра из нашего вручную аннотированного набора данных отслеживания были использованы для обучения полностью сверточной нейронной сети, где вход и выход представляют собой трехмерные изображения одинаковой формы. Мы обучили сеть с использованием изображений трехмерной микроскопии в качестве входных изображений. Здесь каждое изображение представляет одну временную точку. Сетевая архитектура соответствует стандартной архитектуре типа U-Net [20], в которой все сверточные слои заменены слоем CoordConv [22], адаптированным для трехмерных изображений (рис. 3A).Слой CoordConv объединяет абсолютное расположение пикселей для каждого входа свертки. По сравнению с простым сверточным слоем, который эквивалентен трансляции, этот слой полезен в случаях, когда для задачи важно абсолютное положение пикселей.

    Рис. 3. Автоматическое обнаружение ядер клеток сверточной нейронной сетью.

    ( A ) Схематический обзор сети. Сеть представляет собой стандартную сверточную сеть с абсолютными пиксельными координатами, добавленными в качестве входных значений.Это позволяет настроить его сеть обнаружения как для клеток глубоко внутри органоида, так и для клеток вблизи объектива. ( B ) Пример обучающих данных. Слева — срез входного 3D-изображения, справа — гауссовские прогнозы, созданные на основе данных отслеживания вручную. Яркость каждого пикселя представляет собой вероятность того, что этот пиксель является центром ядра. ( C ) Пример сетевого предсказания, который показывает вероятность того, что каждый пиксель является центром ядра, согласно нейронной сети.( D ) Точность нейронной сети с течением времени по сравнению с данными ручного отслеживания, полученными на части одного органоида. Для шести временных точек (отмеченных красными кружками) данные отслеживания сравнивались с данными, аннотированными вручную для всего органоида. В этом случае мы наблюдали более низкую точность. Для этого органоида отзыв составляет 0,97, а точность — 0,98. ( E ) Те же данные, что и на панели d, теперь нанесены по оси z. Точность сети падает в самых глубоких частях изображения, вероятно, потому, что часть каждого ядра выпадает здесь за пределы стека изображений.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0240802.g003

    Для выходных изображений сети нам нужны изображения, в которых яркость каждого пикселя соответствует вероятности того, что этот пиксель является центром ядра. Поскольку несколько пикселей, расположенных близко друг к другу, могут иметь высокую вероятность того, что они являются центром ядра, это приводит в основном к темным выходным изображениям с яркими пятнами в местах расположения центров ядер. Чтобы нейронная сеть создавала такие выходные изображения с учетом микроскопических изображений на входных изображениях, ее нужно было обучить на парах микроскопических изображений и искусственно созданных выходных изображений.Сгенерированные выходные изображения представляют собой черные изображения, которые содержат яркие пятна гауссовой формы со стандартными отклонениями 2 пикселя в местах расположения ядер (рис. 3B). Расположение центров ядер определялось по данным ручного отслеживания. Гауссова форма пятен подтверждает тот факт, что существует неопределенность в точном местонахождении центра ядра. Поскольку разрешение изображений по оси z ниже, чем по осям x и y, гауссианы для помеченных объемов находятся в 2D и не пересекают несколько плоскостей xy.

    Мы обучили сеть на 9 органоидах, содержащих всего 1388 временных точек. Для обучения использовались столбцы размером 64×64 пикселей из случайных мест на изображениях. Это заставило алгоритм обучения использовать меньше памяти по сравнению с использованием полного 512×512 пикселей, а также рандомизировал координаты x и y ядер, но, к сожалению, это не позволяет сети использовать информацию в изображениях, которые расположены дальше от ядра. Чтобы сделать обучение более устойчивым, к обучающим изображениям применялись случайные возмущения [20].Изображения случайным образом переворачивались в направлении x, y и / или z, вращались на случайное количество градусов (0-360), масштабировались до 80% -120% от их исходного размера, делались ярче или темнее с максимум 10% максимальная интенсивность изображения и, наконец, контраст были отрегулированы в соответствии с I новый = ( I — 〈 I 〉) ⋅ c + 〈 I 〉, где I new — результирующая интенсивность пикселя, I — исходная интенсивность этого пикселя, 〈 I 〉 средняя интенсивность всех пикселей в изображении и c коэффициент контрастности, который варьировался от 0.5 к 1,5. Мы используем взвешенную среднеквадратичную ошибку в качестве функции потерь между выходом сети и помеченным объемом. Поскольку помеченные объемы в основном состояли из нулей, мы придавали более важное значение пятнам Гаусса, применяя веса, которые соответствуют проценту ненулевых значений в помеченном объеме.

    После того, как сеть была обучена, она генерировала выходные изображения, которые показывают, где расположены центры ядер (рис. 3C). Каждый пиксель в трехмерном изображении представляет вероятность того, что этот пиксель является центром ядра, что приводит к распределению вероятности с небольшими пиками в местоположении центров ядра.Мы линейно интерполировали пустое пространство между срезами, чтобы полученный объем имел такое же разрешение по оси z, что и по x и y. Это позволяет нам применить алгоритм обнаружения пиков 3D (peak_local_max в scikit-image 1.1.0 [28]) для обнаружения этих локальных максимумов в интерполированных объемах 3D. Полученные трехмерные координаты считаются положениями центров ядер в полном трехмерном объеме. Затем мы сопоставляем эти координаты с ближайшим фрагментом изображения.

    Чтобы оценить производительность сети, нам нужно было знать, сколько обнаружений является истинно положительными или ложными и сколько существует ложных отрицательных результатов.Для этого мы сравнили данные автоматического отслеживания с данными ручного отслеживания 8 органоидов (1438 временных точек), которые не использовались для обучения нейронной сети. Поскольку эти изображения взяты из отдельных органоидов, мы можем использовать эти данные отслеживания для оценки обобщения модели. Одна из проблем при оценке производительности заключалась в том, что трудно измерить количество ложных срабатываний нейронной сети, поскольку отслеживались только от 30% до 40% всех ячеек, видимых на изображениях. Следовательно, в любом месте, где нейронная сеть сообщает о наличии ядра, а ручные аннотации этого не делают, мы не можем априори быть уверены, есть ли ложное срабатывание или эта часть изображения просто не была аннотирована вручную.Для преодоления мы использовали следующий подход.

    Любой центр ядра, обнаруженный нейронной сетью, был отнесен к ближайшему центру ядра из данных отслеживания вручную при условии, что расстояние не превышает 5 мкм. Каждый ядерный центр не может иметь более одного назначения. Каждое успешное задание было настоящим позитивом. Затем любой отслеживаемый вручную центр ядра, который не был назначен, становился ложноотрицательным. Наконец, любой центр ядра из нейронной сети, который не был назначен, считался ложноположительным, если он находился в пределах 5 мкм от центра ядра, отслеживаемого вручную, в противном случае он отклонялся.Это гарантировало, что ошибки в отслеживаемой вручную области по-прежнему будут обнаружены.

    Мы измерили три значения для количественной оценки производительности сети: точность, отзыв и оценка F 1 . Точность — это доля правильных обнаружений ядер, выполненных нейронной сетью. Математически это определяется как (1) где TP — количество истинных срабатываний, а FP — количество ложных срабатываний. Отзыв — это доля обнаруженных ядер в достоверной информации, которая была обнаружена нейронной сетью, и определяется как (2) с FN количество ложноотрицательных результатов.Для нейронной сети важно, чтобы как точность, так и отзывчивость были высокими. В одном крайнем примере, если бы нейронная сеть пометила бы почти каждый пиксель как центр ядра, у нее был бы высокий отзыв, но точность почти нулевая. С другой стороны, если бы нейронная сеть находила бы только наиболее очевидные ядра, она имела бы высокую точность, но низкую отзывчивость. Чтобы выразить качество нейронной сети в виде единого числа, было вычислено среднее гармоническое значение точности и полноты, которое известно как оценка F 1 : (3)

    Точность оказалась равной 0.98 со стандартным отклонением 0,007, что означает, что 98% обнаружений, выполненных нейронной сетью, соответствовали ручным данным. Отзыв оказался в среднем 0,96 со стандартным отклонением 0,02, что означает, что 96% всех отслеживаемых вручную клеток были обнаружены нейронной сетью. Основываясь на этих значениях точности и отзыва, оценка сети по шкале F 1 составляет 0,97.

    Рис. 3D отображает точность во времени, которая показывает, что точность не ухудшалась со временем, когда органоиды выросли в размерах.Как видно на рис. 3Е, точность максимальна вблизи объектива, а затем падает до уровня 20 мкм. В самой глубокой части органоида точность еще больше падает. Это потому, что полное ядро ​​больше не видно; часть ядра теперь выпадает за пределы стека изображений.

    Отслеживаемая вручную область может не быть репрезентативной для всего органоида, поскольку есть также неотслеживаемые области, которые в основном состоят из флуоресцентного материала, поступающего из мертвых клеток. Чтобы проверить производительность сети для органоида в целом, для шести временных точек все ядра были вручную аннотированы во всем стеке изображений.В результате было аннотировано 1318 ядер. Воспроизведение этих изображений по-прежнему составляло 0,96, но точность, показанная на рис. 3D в виде красных точек, снизилась до 0,87. Наблюдая за местоположением ложных срабатываний, мы заметили, что это было главным образом потому, что материал мертвых клеток распознавался нейронной сетью, как если бы это было ядро ​​живой клетки. В совокупности это указывает на то, что отзыв примерно одинаков для всего изображения, но точность ниже в областях с большим количеством мертвого клеточного материала.Чтобы получить правильные данные отслеживания клеток, любые ложные аннотации материала мертвых клеток необходимо будет отфильтровать позже в процессе отслеживания. Это можно сделать либо на этапе автоматического связывания, либо на этапе исправления ошибок вручную.

    Помимо расчета оценки нейронной сети F 1 для наших органоидов, мы также рассчитали оценку точности обнаружения (DET). Оценка DET — еще один показатель точности идентификации клеток [29]. Программное обеспечение, доступное для расчета оценок DET, требует масок сегментации ячеек, а не только положения ячеек, как в случае с нашим трекером ячеек [11].Поэтому мы нарисовали псевдомаску ядер, которая представляла собой сферу размером 5 мкм вокруг каждой обнаруженной позиции. В плотно упакованных областях органоида эта сфера больше ядра. Следовательно, несколько сфер могут перекрываться. Если это произойдет, каждый пиксель в перекрывающейся области нескольких сфер будет назначен ближайшей обнаруженной позиции. Чтобы убедиться, что обнаруженные позиции за пределами отслеживаемой вручную области не рассматривались как ложные срабатывания, мы удалили все позиции за пределами отслеживаемой вручную области.Подход был таким же, как и для оценки F 1 : любой обнаруженный центр ядра на расстоянии более 5 м от центра ядра в данных ручного отслеживания был удален. Оценка DET, рассчитанная таким образом для 8 органоидов, составила 0,93 ± 0,03, с оценкой 1,00, соответствующей безошибочному обнаружению. Эти оценки находятся в высоком диапазоне оценок, полученных другими трекерами для наборов данных о развитии аналогичной сложности [11]. В целом, эти результаты показывают, что наш подход может точно обнаружить большинство ядер клеток в наших органоидах.Следующий шаг — связать вместе обнаружение ядер в разные моменты времени, чтобы за ядрами можно было следить с течением времени.

    Шаг 2: Связывание позиций ячеек

    Чтобы проследить за клетками во времени, местоположения одного и того же клеточного ядра в разные моменты времени должны быть связаны друг с другом. Связь идет от центра обнаруженного ядра в момент времени t к тому же центру ядра, отображенному в момент времени t + 1. Обычно каждое ядро ​​имеет одну ссылку на следующую временную точку и одну ссылку на предыдущую временную точку.Однако в случае деления ядро ​​разделится на два ядра, и, следовательно, ядро ​​также будет иметь две связи с следующей точкой времени. Простой способ создать эти связи — всегда предполагать, что ближайшее обнаруженное ядро ​​в предыдущий момент времени представляет то же самое ядро; это называется связыванием ближайшего соседа. Возвращаясь во времени, теоретически мы получаем обнаружение делений клеток бесплатно: если два ядра в момент времени t + 1 оба имеют одно и то же одно ядро ​​в момент времени t в качестве ближайшего ядра, происходит деление. .

    К сожалению, связывание ближайшего соседа не дает нам точных деревьев происхождения. Мы можем видеть на рис. 4A, что связывание ближайшего соседа создает нереально короткие циклы ячеек. Более того, хотя это бывает редко, ничто не мешает материнской клетке иметь трех или более дочерей. Ясно, что предположение о том, что ближайшее ядро ​​всегда является одним и тем же ядром, неверно. По этой причине необходимо, чтобы алгоритм связывания также учитывал связи с ядрами, находящимися дальше ближайшего соседа.В нашем методе мы рассматриваем все ссылки, которые находятся не более чем в два раза дальше, чем ближайший сосед. Для большинства обнаруженных положений ячеек это приводит к множеству вариантов связывания для создания ссылок (рис. 4C). Каждой из этих опций присваивается оценка (энергия), из которой сумма всех созданных ссылок сводится к минимуму. Эта минимизация осуществляется с помощью решателя минимальной стоимости потока, адаптированного для отслеживания делящихся клеток, разработанного Haubold et al. [23]. Здесь мы использовали следующие правила:

    1. Обычная ссылка получает оценку , с Δ X изменение положения в мкм и Δ V изменение объема ядра в мкм 3 Это гарантирует, что связи с наименьшим изменением положения и объема предпочтительны.
    2. Каждый конец пути получает штраф 1. Это способствует созданию более длинных дорожек вместо нескольких более коротких дорожек, что позволяет время от времени устанавливать связь на большие расстояния.
    3. Каждое начало трека получает штраф 1. Опять же, это способствует созданию более длинных треков.
    4. Каждая позиция ячейки, которая игнорируется алгоритмом связывания, приводит к штрафу в размере 1. Это обеспечивает связывание как можно большего количества данных из нейронной сети.Если бы этого правила не существовало, глобально оптимального результата можно было бы достичь, вообще не создавая никаких ссылок.
    5. Подразделения клеток имеют систему баллов, основанную на изменении объема и интенсивности . Эта система оценки описана в Приложении S1. Оценка ниже 1 означает, что здесь деление клеток маловероятно, и в этом случае деление здесь запрещено.
    6. Если оценка деления клеток составляет не менее 1, оценка по правилу 1 уменьшается вдвое. Ожидается, что во время деления клетки ядра клеток будут быстро перемещаться и изменять свой объем, поэтому целесообразно снизить штраф за изменения положения и объема.

    Рис. 4. Обзор и результаты алгоритма связывания.

    ( A ) Деревья происхождения, полученные путем связывания с использованием метода ближайшего соседа. ( B ) Необработанные деревья происхождения, полученные с помощью нашего алгоритма связывания. ( C ) Пример сети ссылок. Есть много возможностей связать вместе обнаружение ячеек в разные моменты времени. Из всех возможных ссылок (отображаются в виде стрелок) наиболее вероятные (отображаются в виде синих стрелок) выбираются с помощью системы оценок.( D ) Исходное изображение микроскопии, гауссово соответствие и профиль интенсивности обоих. Профиль интенсивности проходит по отмеченному ряду на изображении. Мы выбрали раздел, который подчеркивает тот факт, что наш подход может выбирать ядра и игнорировать клеточный мусор, даже если оба имеют схожий профиль интенсивности флуоресценции. ( E ) Объем ядра трех ядер, извлеченный из гауссовой аппроксимации. Объем ( V = Cov ( x , x ) ⋅ Cov ( y , y ) ⋅ Cov ( z , z )) вычисляется для трех неделящихся клеток.Выбросы вызваны ошибками гауссовой аппроксимации. ( F ) Точность алгоритма связывания, представленного здесь для одного органоида, во времени и по глубине изображения. Обратите внимание, что точность выше, чем для связывания ближайшего соседа.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0240802.g004

    Баллы, полученные по правилам с 1 по 5, умножаются на коэффициент, указанный пользователем программного обеспечения. Здесь эти коэффициенты равны 20, 100, 150, 150 и 30 соответственно.Изменяя эти значения, можно настроить систему подсчета очков. Например, если нейронная сеть случайно обнаруживает мертвый флуоресцентный материал как живые клетки, что приводит к множеству коротких путей, это можно исправить, увеличив штраф за появление и исчезновение клеток. Таким образом, высокие штрафы в начале и в конце трека вместе больше, чем штраф за игнорирование этих обнаруженных положений ядер. В результате трек вообще не создается. В качестве другого примера, если ячейки в системе имеют тенденцию двигаться медленно, штраф за перемещение может быть увеличен, так что вероятность создания междугородных связей снижается.Мы использовали это в нашей системе, чтобы избежать создания связи с соседним ядром, когда правильное ядро ​​не было обнаружено нейронной сетью. Для нас это работает хорошо, потому что трек ячейки, который внезапно заканчивается, будет легко обнаружен, если пользователь перепроверит все концы трека, в то время как переключение идентификатора ячейки в результате ссылки на другую ячейку труднее обнаружить.

    Для оценки правил 1 и 5 необходимо знать объем ядер. Этот объем оценивается с использованием многомерной гауссовской аппроксимации в 3D.Хотя ядра не всегда имеют гауссову форму, их все же можно аппроксимировать гауссовой функцией, чтобы получить оценку их объема [30]. Поскольку мы хотим подогнать функции Гаусса только к живым ядрам, а не к флуоресцентному материалу, исходящему из мертвых клеток, мы не можем подогнать изображение в целом. Вместо этого нам нужно отделить мертвый клеточный материал от живых ядер и подогнать только гауссовские функции к последним. Для этого сначала выполняется сегментация, чтобы разделить изображение на кластеры, каждый из которых содержит ноль, одну или несколько позиций ячеек, обнаруженных нейронной сетью.Сегментация начинается с выполнения адаптивного порога на исходном изображении I image для разделения переднего плана и фона, в результате получается маска с именем I mask . Затем эта маска улучшается, сначала удаляя все пиксели из I маски , которые в исходном изображении I изображение имеют отрицательную изоинтенсивную гауссову кривизну [30], что означает, что все пиксели более низкая интенсивность между двумя местами с более высокой интенсивностью удаляется.Ожидается, что это удалит пиксели между двумя ядрами. Затем все отверстия в маске заполняются, в результате получается маска с именем I маска , заполнена . На этой маске выполняется три цикла эрозии с крестообразным ядром 3x3x1 на маске. Этот шаг уменьшает область переднего плана, в результате чего передний план распадается на отдельные кластеры. По этой причине эта эродированная маска получила название I маска , эродированная .С помощью сверточной нейронной сети мы знаем, сколько клеток находится в каждом кластере и где находятся их центры ядер. Затем выполняется подгонка по Гауссу на I маске , заполнена , которая была маской до нанесения эрозии. Одна функция Гаусса подходит для каждого положения ядра, и каждая функция Гаусса центрируется вокруг положения, заданного нейронной сетью, с использованием интенсивности по умолчанию и ковариационной матрицы по умолчанию. Следующая функция используется для размещения одного ядра: (4) Здесь a — максимальная интенсивность функции, μ, — вектор, представляющий среднее значение, а Σ — ковариационная матрица.Вместе эти три переменные описывают интенсивность, положение и форму ядра клетки соответственно. обозначает, что мы берем поперек, что приводит к вектору-строке. Эти функции приспособлены к размытой версии исходного изображения, так что ядра имеют более гауссову форму. Для всех пикселей в кластере квадратичная разница между этим изображением и результатом функций Гаусса, описывающих ядра, минимизируется: (5)

    На рис. 4D мы можем видеть пример гауссовой аппроксимации.На панели показано, что не только гауссовская аппроксимация правильно следует профилю интенсивности ячеек, но также и то, что при аппроксимации не учитываются остатки мертвых клеток, которые ранее были отфильтрованы нейронной сетью. Чтобы показать согласованность гауссовой аппроксимации во времени, мы построили объем (Cov ( x , x ) ⋅ Cov ( y , y ) ⋅ Cov ( z , z )) с течением времени для трех произвольных ячеек на фиг. 4E. Как видно на этом рисунке, гауссовское приближение предсказывает объем во времени без значительного шума.Однако иногда подгонка предсказывает объем, более чем в два раза превышающий средний объем, а иногда только очень низкий объем. Это может произойти, если совпадение двух ядер приводит к одной большой гауссовой форме, охватывающей оба ядра, и одной очень маленькой гауссовой форме.

    На рис. 4B показаны необработанные деревья происхождения, полученные с помощью алгоритма связывания. Сравнивая как эти деревья родословной, так и деревья родословной, полученные из связывания ближайшего соседа (рис. 4A), с деревьями родословной из данных ручного отслеживания (S1, рис.), Становится ясно, что предложенный здесь метод более точен, чем связывание ближайшего соседа.Чтобы количественно измерить точность нашего метода, нам нужно вычислить точность (уравнение (1)) и вспомнить (уравнение (2)). Для этого необходимо определить истинные срабатывания, ложные срабатывания и ложные отрицания с точки зрения ссылок. Мы рассматривали все обнаруженные ядра на расстоянии не более 5 мкм от места расположения ядра, аннотированного вручную. Если какой-либо из этих ближайших ядерных центров в момент времени t имел связь с любым из ближайших ядерных центров в момент времени t + 1, это считалось такой же связью и, следовательно, истинно положительным.Если между соседними позициями не существовало связи, это считалось ложноотрицательным. Естественно, каждая ссылка в данных ручного отслеживания может быть назначена только одной соответствующей ссылке данных автоматического отслеживания. Следовательно, каждая оставшаяся ссылка в данных автоматического отслеживания без соответствующей ссылки в данных ручного отслеживания в принципе была ложноположительной. Однако, поскольку отслеживался не весь органоид, связи были отвергнуты, если в обоих временных точках они не имели центров ядер в данных ручного отслеживания в пределах 5 мкм.

    Используя этот подход, мы рассчитали точность, отзыв и оценку F 1 для тех же 8 органоидов (1438 временных точек), которые использовались для оценки эффективности обнаружения. Воспроизведение всех органоидов составляет 0,91 со стандартным отклонением 0,04, точность составляет 0,94 со стандартным отклонением 0,02 и, следовательно, оценка F 1 составляет 0,93. Обратите внимание, что оценка отзыва ограничена отзывом нейронной сети: если нейронная сеть не может обнаружить ядро, две связи этого ядра также не будут созданы автоматически.Как видно на рис. 4F, результаты относительно постоянны во времени, но не по глубине: точность хуже вблизи края отображаемой области. Кроме того, мы рассчитали оценку точности отслеживания (TRA), другую меру того, насколько хорошо клетки отслеживаются во времени [11, 29], используя подход, описанный для расчета оценки DET. Мы получили оценку TRA 0,92 ± 0,04, усредненную по 8 различным органоидам, с оценкой 1,00, соответствующей безошибочным трекам. Как и оценка DET, эта оценка TRA находится в высоком диапазоне оценок, полученных другими трекерами для наборов данных о развитии аналогичной сложности [11].В целом, наш анализ показывает, что наш автоматизированный подход к обнаружению и отслеживанию ячеек дает данные отслеживания ячеек высокого качества, хотя и недостаточного для безошибочного отслеживания. Следовательно, для этого требуется следующий шаг ручной корректировки данных.

    Шаг 3. Исправление ошибок вручную

    Хотя деревья клонов, полученные на предыдущем шаге, уже показывают многообещающие результаты, все же деревья клонов неверны: деления пропущены, клетки меняются в идентичности, треки клеток заканчиваются преждевременно и деления клеток создаются там, где их нет.На основе этих результатов требуется ручное исправление ошибок для получения надежных данных отслеживания. С точки зрения времени было бы нецелесообразно пересматривать каждое ядро ​​в каждый момент времени. По этой причине программа помечает все ядра, которые нарушают одно из следующих правил, чтобы пользователь мог вручную внести исправления:

    1. Ячейки должны иметь ссылку на предыдущую и следующую временную точку. Обнаруживает клетки, которые появляются из ниоткуда, и клетки, исчезающие в никуда. Эти случаи обычно указывают на то, что ячейка не была обнаружена в определенный момент времени или что ячейка была обнаружена там, где ее не было.В случае, если клетка действительно умирает или если клетка выходит из поля зрения микроскопа, пользователь может проигнорировать это нарушение правила.
    2. Должно пройти не менее 10 часов, прежде чем клетка снова разделится. Нарушение этого правила указывает на то, что произошло переключение идентификации соты. Точное количество часов можно изменить.
    3. Клетки не должны перемещаться более чем на 10 мкм между двумя временными точками. Такое быстрое движение может указывать на изменение идентичности ячейки. Точное количество микрометров можно изменить.
    4. Объем ядра делящейся клетки должен быть больше, чем объем дочерних клеток вместе взятых. Это правило помогает идентифицировать неправильно обнаруженные подразделения.
    5. Объем ядра не может уменьшаться более чем в 3 раза. Это правило помогает находить переключатели в идентичности клеток и пропущенных делениях клеток.
    6. Две ячейки не могут сливаться вместе, и у ячеек не может быть более двух дочерей. Несмотря на то, что связывание не допускает таких ситуаций, это правило может быть нарушено, если человек допустит ошибку при ручном исправлении данных отслеживания.

    Любые нарушения вышеуказанных правил автоматически помечаются проверкой ошибок, запускаемой на последнем этапе процесса связывания. Программа направляет пользователя по списку ошибок, предлагая пользователю либо подавить их, либо вручную исправить данные отслеживания. При исправлении данных отслеживания программа проверки ошибок немедленно проверяет каждое изменение, сделанное пользователем. В результате, если пользователь случайно создает разделение ячейки с тремя дочерними ячейками, пользователь немедленно увидит крестик на материнской ячейке.Строгость правил может варьироваться: более строгие правила приводят к большему количеству ложных предупреждений, но меньшему риску пропуска ошибок отслеживания. Когда мы настроили параметры таким образом, что мы получили данные отслеживания того же качества, что и данные ручного отслеживания, от 1 до 2% всех обнаруженных ячеек необходимо было проверять вручную.

    Чтобы оценить эффективность и производительность этапа ручной коррекции данных на основе приведенных выше правил, мы сравнили выходные данные нашего трекера клеток до и после ручной коррекции данных с аннотированными вручную данными в нашем наборе обучающих данных для двух органоидов.До корректировки данных отзыв был 0,93 ± 0,02, а точность 0,95 ± 0,01. После исправления данных первый органоид дал идентичные деревья линий по сравнению с данными ручного отслеживания, в то время как другой органоид содержал одну ошибку отслеживания: неправильная клетка была объявлена ​​мертвой. Чтобы оценить, сколько предупреждений было ложным срабатыванием, мы подсчитали, какой процент этих ошибок привел к изменению данных отслеживания. Если аннотированное положение ядра было перемещено или удалено, или если произошло изменение местоположения ядер, с которыми оно было связано, предупреждение считалось истинно положительным.Для обоих органоидов мы обнаружили, что 80% предупреждений были истинно положительными.

    Сравнение с существующими методами

    В настоящее время существуют другие методы, сочетающие автоматическое отслеживание с ручной коррекцией, хотя и без использования нейронных сетей, одним из примеров является TrackMate [25]. Использование такого основанного на правилах подхода к обнаружению ячеек вместо использования нейронных сетей имеет то преимущество, что не требуется большого набора обучающих данных. Поскольку создание таких наборов данных часто является трудоемким и трудоемким процессом, можно задаться вопросом, были ли здесь оправданы наши усилия по созданию такого набора данных для обучения.Насколько хорошо TrackMate будет работать при нанесении на наши изображения?

    Чтобы проверить это, мы использовали так называемый детектор Гаусса с пониженной дискретизацией из TrackMate, который, согласно документации, является единственным детектором, подходящим для пятен размером более 20 пикселей. Детектор имеет три параметра: размер пятна, коэффициент понижающей дискретизации и порог обнаружения. Путем ручной оптимизации мы достигли размера пятна 10 мкм, коэффициента понижающей дискретизации 2 и порогового значения 1. Как и в случае с нашей нейронной сетью, мы измеряли производительность, рассматривая только отслеживаемую вручную область органоида.Отзыв составил в среднем 0,66 со стандартным отклонением 0,04 по органоидам. Это означает, что в наших руках TrackMate пропустил треть всех ячеек изображения. Для сравнения, нейронная сеть пропустила всего 4% всех ячеек. Точность была выше: 0,969 со стандартным отклонением 0,006, что почти так же высоко, как точность нейронной сети (0,98). Это указывает на то, что TrackMate консервативен в распознавании ядер, но когда он распознает ядро, это почти всегда правильно.Однако в целом это дает оценку F 1 всего 0,79, что значительно ниже, чем оценка нейронной сети, которая составляла 0,97.

    Несмотря на то, что треть ядер не была обнаружена, мы все же предприняли попытку связывания с помощью трекера LAP TrackMate, используя его настройки по умолчанию. Для 8 тестируемых органоидов вместе взятый отзыв составил 0,55 со стандартным отклонением 0,04, а точность составила 0,79 со стандартным отклонением 0,04. Это дает 0 баллов по шкале F 1 .65. Этот результат означает, что почти половина правильных ссылок уже отсутствует. Потребуется обширная ручная коррекция, чтобы установить треки ячеек с таким же качеством, как мы получили с нашим подходом. В целом, эти результаты подчеркивают важность эффективного и точного обнаружения клеток, чего мы добились здесь с помощью нейронных сетей.

    Анализ данных отслеживания

    На рис. 5 мы показываем результаты этого подхода к отслеживанию всего органоида. Во-первых, этот подход позволяет связать динамику клонов с пространственным положением клеток в органоиде.На рис. 5А показаны двумерные срезы микроскопических изображений органоида, а его трехмерная реконструкция показана на рис. 5В. В реконструкции клетки были окрашены по происхождению: выбранные клетки были окрашены в зависимости от того, из какой клетки они произошли в первый момент времени. Видео обеих панелей включены как видео S1 и S2. На рис. 5C показаны деревья линий одного и того же органоида и окрашены в одну и ту же окраску. Мы можем видеть, что клетки одного и того же дерева родословной имеют тенденцию оставаться связанными в пространстве, хотя клетки нескольких деревьев родословной действительно смешиваются.Кроме того, мы можем видеть, что самые большие деревья линии преемственности находятся в самом нижнем положении в области склепа, которая является растущей выступающей областью на Рис. 5B.

    Рис. 5. Анализ полностью отслеженного органоида.

    ( A ) Однократная микроскопия срезов кишечного органоида из интервальной видеозаписи продолжительностью 65 часов с шагом 16,25 часа. h3B-mCherry использовался для визуализации ядер. Масштабная линейка составляет 40 мкм. ( B ) Цифровая реконструкция того же органоида, что и на панели a.Клетки одного цвета происходят из одной клетки в начале эксперимента. ( C ) Выбранные деревья родословной. Цвета соответствуют цветам в реконструкции из Панели b. ( D ) Количество клеточных делений в одном органоиде с течением времени. ( E ) Количество раз, когда каждая ячейка делится в течение промежутка времени, интегрированного по времени, от 0 (белый) до 5 (красный). Для серых ячеек мы не могли подсчитать количество делений, потому что ячейка находилась за пределами изображения в более ранний момент времени.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0240802.g005

    Затем мы использовали наши данные отслеживания для изучения динамики делений клеток в пространстве и времени. Мы наблюдали, что почти все деления клеток происходят в крипте (S3 Video), что согласуется с данными литературы [31]. Мы могли видеть, что внизу склепа наибольшее количество отделений. Однако на дне склепа было несколько ячеек, которые, в отличие от своих соседей, не делились или делились только один раз.Скорее всего, это клетки Панета, которые представляют собой дифференцированные клетки, находящиеся в компартменте стволовых клеток [32]. На рис. 5D мы видели, что подразделения изначально были синхронизированы, в то время как позже эта синхронизация была менее очевидной.

    Программное обеспечение

    Исходный код и пакеты программного обеспечения доступны по адресу https://github.com/jvzonlab/OrganoidTracker. Документация, включая учебные пособия, доступна по тому же адресу. Обученная модель, используемая в этой статье, доступна в репозитории данных DANS: https: // doi.org / 10.17026 / dans-274-a78v [33]. Эта модель подходит для трехмерных конфокальных изображений ядер клеток с разрешением приблизительно 0,32 мкм / пикс., Разделением по оси Z 2 мкм и низким фоновым шумом. Другая модель доступна для обучения для более низкого разрешения 0,40 мкм / пиксель, все еще с тем же разделением по оси Z и помехоустойчивостью.

    Выпущенное программное обеспечение способно отслеживать вручную, обучать нейронную сеть, использовать нейронную сеть для обнаружения ядер на микроскопических изображениях, связывать обнаружение ядер в разные моменты времени и помогать в корректировке данных автоматического отслеживания.Чтобы исправить предупреждения, обычно используется интерфейс для перехода от предупреждения к предупреждению. Вместо этого можно также перейти от предупреждения к предупреждению в пределах одного дерева родословной. Доступны дополнительные инструменты для выделения всех ячеек в (под) родословной или для перехода от точки в дереве родословной к данным отслеживания ячеек.

    Программное обеспечение было написано на Python 3.6 с использованием установленных пакетов программного обеспечения Mahotas 1.4.4 [34], matplotlib 2.2.2 [35], numpy 1.15.1 [36], OpenCV 3.4.1 [37], PyQT 5 .9.2 [38] и Tensorflow 1.9.0 [39]. Поддержка загрузки изображений обеспечивается tifffile 2020.2.16 [40] и nd2reader 3.1.0 [41]. Программа сохраняет все данные отслеживания в виде файлов JSON.

    3D визуализация возможна путем экспорта положений ядер в Paraview [42], который может отображать эти точки как сферы. Программное обеспечение также может загружать и сохранять файлы в формате данных Cell Tracking Challenge [11], что позволяет обмениваться данными с большинством других трекеров сот. Программа поддерживает загрузочные скрипты, написанные на Python, которые можно использовать для анализа данных.Эти сценарии можно перезагружать во время работы программы, что избавляет от необходимости перезапускать программу, если вы внесли изменения в сценарий анализа.

    Обсуждение

    Мы разработали программу для отслеживания клеток на основе ядерных маркеров внутри органоидов, в которой используется сверточная нейронная сеть для обнаружения и недорогой решатель потока для связывания положений клеток. Для нашего набора данных было распознано 91% всех ссылок на правду. В основном это связано с тем, что нейронная сеть смогла распознать только 96% ячеек, а одно отсутствие обнаружения уже означает, что алгоритм связывания не может восстановить дорожку ячейки.Однако программное обеспечение облегчает ручное исправление ошибок, поэтому из этих данных можно получить клоны клеток того же качества, что и при ручном отслеживании.

    Сверточная нейронная сеть и решатель потока с минимальной стоимостью, используемые для связывания, являются очень общими: они не делают никаких предположений о микроскопических изображениях, кроме того, что они представляют собой трехмерные изображения в градациях серого. Напротив, метод Гаусса, который используется для оценки объема ядра и распознавания клеточных делений, весьма специфичен для наших изображений: он предполагает наличие ярких ядер на темном фоне с небольшим шумом.В настоящее время исключение гауссовой аппроксимации невозможно, так как от этого зависит распознавание клеточных делений.

    Поскольку этот подход использует контролируемую форму машинного обучения, необходимо иметь доступный разнообразный набор обучающих данных. Хотя сеть уже будет автоматически генерировать вариации ваших обучающих данных, регулируя яркость, масштаб и поворот, все же сеть может иметь неоптимальную производительность для изображений с микроскопа, снятых с другими настройками, например, изображений с другим контрастом или разрешением.Чтобы решить эту проблему, необходимо переобучить сеть на обучающих данных, созданных с этими настройками.

    Можно подумать о дальнейших улучшениях алгоритма. Можно начать обучение нейронной сети с меньшего набора обучающих данных, что приведет к созданию трекера ячеек, вывод которого требует большого количества ручных настроек для получения безошибочных результатов. После завершения этого шага коррекции можно использовать скорректированные вручную данные для повторного обучения нейронной сети. Таким образом создается петля обратной связи, которая улучшает нейронную сеть каждый раз, когда становится доступным больше данных отслеживания (рис. 2).В этой статье такой цикл обратной связи не использовался: поскольку у нас уже был большой объем обучающих данных заранее, для нас было бесполезно переобучать сеть.

    В целом, мы считаем, что путь вперед состоит в том, чтобы сделать нейронную сеть как можно более точной, а затем предоставить алгоритму связывания минимально возможное количество вариантов для создания ссылок. Пока биологически правильный вариант все еще является частью этого меньшего набора вариантов, из которых может выбирать алгоритм связывания, этот подход снизит вероятность того, что алгоритм связывания сделает ошибки.Одним из возможных шагов в этом направлении было бы позволить нейронной сети также классифицировать клетки: если бы сеть могла указывать, где находятся материнская и дочерняя клетки, алгоритм связывания мог бы быть ограничен только созданием подразделений в этих местах.

    В заключение, теперь мы можем наблюдать растущий органоид на клеточном уровне, используя отслеживание клеток в видео с микроскопа. Для этого мы разработали трекер ячеек, использующий сверточную нейронную сеть для обнаружения ячеек, решатель потоков с минимальной стоимостью [23] для связывания позиций ячеек и небольшой набор правил для помощи в курировании данных.Мы надеемся, что отслеживание клеток, с его привязкой к динамике клонального дерева во времени и пространстве, приведет к лучшему пониманию роста и поддержания органоидов.

    .

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *