Затянуло разобрать по составу: «затянуло» — корень слова, разбор по составу (морфемный разбор слова)

«Звонкие и глухие согласные в корне слова»

Диктант

Редкая лошадка .

Пони любят все детишки. Это маленькая лошадка. У пони короткие ножки, маленькая головка. У лошадки гладкая шерсть. А какой добрый взгляд! Малышка бежит по дорожке и тянет тележку. У пони лёгкий бег.

Вот пришла повозка. Туда сели мальчики и девочки. Пони делает круг за кругом. Дети рады. (49слов. )

Слова для справок: кучер, тележка, вожжи.

Задание:

1. Подчеркнуть слова с парными согласными в корне:

1-й вариант:Д и Т

2-й вариант:Ж и Ш.

2. Разобрать слова по составу: ЛОШАДКА, ГЛАДКАЯ.

3. К словам ЛЁГКИЙ, ДОРОЖКА приписать проверочные

Диктант

Дорога

Глеб запряг в телегу лошадку. Мы тронулись в путь. Узкая дорожка шла через поле. Воронок бежал лёгкой рысью. Вокруг раскинулся овёс. За полями начинался низкий кустарник. Проехали редкий лесок. Вот и деревня Редькино. На краю избушка. Тут живёт дедушка Тарас. Огород у деда большой. Созрели морковка, репка, горох. (49 слов.)

Слова для справок: телега, лёгкой.

Задание:

1. В первом предложении подчеркнуть подлежащее и сказуемое.

2. Разобрать по составу слово МОРКОВКА, ЛОШАДКА.

3. Выписать 5 слов со звонкими согласными в корне.

Диктант

Дятел

Часто раздаётся стук в лесу. Это дятел строит гнездо. Дятел долбит своим крепким носом мягкое дерево. Кусочки коры и весь сор дятел выбрасывает вон. Птенцы дятла растут на гладком дне гнезда. От этого у них мозоли на пятках. Молодые дятлы ловко цепляются за стенки своими острыми когтями и вылезают из гнезда. (52 слова)

Задание:

1. Выписать из диктанта два слова с парными согласными. Написать проверочные слова.

2. Разобрать данное предложение по членам предложения: Это дятел строит гнездо.

Тема: «Однокоренные слова»

Диктант

Осень

По календарю ноябрь – последний месяц осени. С каждым днем все крепче утренние морозы. Под ногами уже хрустит тонкий ледок.

Речка у берегов замерзла. На озерах появились широкие полосы льда. И пруд затянуло льдом. Небо часто покрыто серыми тучами. Солнце редко светит и совсем не греет землю. (47 слов).

Задание:

1. Разобрать слова по составу:

1-й вариант:ЛЕДОК — , ПЕРЕХОД—.

2-й вариант:МОРОЗЫ — , ПОЛЕТ — .

2. К слову МОРОЗ, подобрать родственные слова.

Тема: «Непроверяемые гласные и согласные»

Диктант

Дар природы

Леса, рощи, сады — дар природы человеку. Чистый воздух лесов полезен для здоровья. Он придает людям силы. Деревья сохраняют влагу, защищают почву и посевы от ветров.

Пусть каждый школьник посадит дерево у дома или у школы. Оно принесет людям радость и красоту. Охрана природы-нужное дело. (45 слов)

Задание:

1. Выписать из текста словарные слова, подчеркнуть в них непроверяемые гласные и согласные.

2. Данное предложение разобрать по членам предложения: Деревья сохраняют влагу, защищают почву и посевы от ветров.

3. Разобрать по составу слово: ШКОЛЬНИК.

Диктант

Лоси

Закатилось солнышко за горизонт. На краю болота стоит лосиха с лосенком. Досыта наелись они сочной травы. Задремала старая лосиха. Пищат над болотом комары. Спасаясь от комаров, прячутся лоси иногда в воду. Они проходят через болота, овраги, переплывают реки и лесные озера. Их можно увидеть на окраинах селений и городов.

(49слов) (По И, Соколову-Микитову)

Слова для справок: досыта, переплывают.

Задание:

1. Выписать слова с непроверяемыми безударными гласными; подчеркните буквы, правописание которых надо запомнить.

2. Выписать из текста однокоренные слова с корнем ЛОСЬ.

3. Разобрать по составу слово: СОЛНЫШКО.

Тема: «Приставки и предлоги»

Диктант

Синица

Синица влетела в сад. На дереве она нашла большого жука. Синица схватила его с ветки. Вдруг с крыши спрыгнул кот. Синица увидала у дорожки кота. Кот залез под куст и следил за синицей. В сад вбежала собака. Она ‘набросилась на кота.Синица слетела с дерева.

(45слов.)

Задание:

1. Выписать из текста 5 слов с приставками и 5 слов с предлогами.

2. Данное предложение разобрать по членам предложения: Синица увидала у дорожки кота.

Диктант

Воробей

Лёня увидал у старого сарая воробья. Он сильно дрожал от холода. Лёня взял воробья. Он принёс его в школу. Ребята положили воробья в шапку. Он отогрелся. Ребята покормили воробья. Потом воробей вспорхнул. Он сел на окно. Анна Сергеевна открыла окно. Воробей вылетел. Он весело зачирикал. (45 слов)

Задание:

1. Выписать из текста 5 слов с приставками, приставки выделить.

2. Подчеркнуть в тексте предлоги.

3. Данное предложение разобрать по членам предложения: Ребята положили воробья в шапку.

Тема: «Разделительный Ъ»

Диктант

Лосиха

Мы обходили участок. Дорога шла на подъем. Под кустом лежал лосенок. Он был нездоров. Мы взяли лосёнка ни руки, но вдруг услышали рев. К нам бежала разъяренная лосиха. Шерсть стояла дыбом, ноздри от ярости раздулись.

Мы отпустили лосенка. Мелкими шажками он побежал к матери. Семья объединилась. (46 слов)

Слова для справок: нездоров, к нам.

Задание:

1. Выписать из текста слова с Ъ.

2. Выписать из текста 3 слова с безударными гласными в корне.

3. Выписать из текста однокоренные слова с корнем ЛОСЬ.

Диктант

Сказка

В давние времена суслик и ворона были друзьями. Вместе они запасали на зиму колосья и съедобные травы. Раз улетела ворона в гости к сестрам и братьям. А суслик закрыл вход в нору и пошел спать. Стала ворона звать друга. Но суслик крепко спал. Осталась ворона без съестного припаса. И дружба врозь.

(52 слова) (По НСацджиеву)

Слово для справок: врозь

Задание:

1. Подчеркните в тексте предлоги.

2. Выписать из текста 5 слов с приставками.

3. К слову ЗИМА подобрать родственные слова.

Тема: «Части речи»

Диктант

Зимой в лесу

На дворе мороз. Сильный ветер крутит хлопья снега. В лесу затихли голоса птиц. Только пестрый дятел стучит по коре своим крепким клювом.

Холодно и голодно зверям зимой. Медведь залез в берлогу. Лиса скрылась в нору. Бедный заяц дрожит под кустом. Голодные волки рыщут по лесу. (49 слов)

Задание:

1. Разобрать предложение по членам предложения. Указать в нем части речи:

1-й вариант: Бедный заяц дрожит под кустом.

2-й вариант: Голодные волки рыщут по лесу.

2. Выписать из текста по 5 имен существительных и по 5 глаголов.

3. Разобрать по составу слова: ГОЛОДНЫЕ, КРЕПКИМ.

Диктант

Зимний лес

Чудесен русский лес зимой! Белый пушистый снег повис на ветвях деревьев. Смолистые шишки украшают вершины елей. Шустрые синицы пищат в сучьях. На сугробах видны узоры заячьих и лисьих следов.

Вот бежит через дорогу белка. Прыгнула на сосну, махну­ла хвостом. Полетела лёгкая снежная пыль. Постучал молоточком по стволу дятел. (50 слов.)

(По И. Соколову-Микитову.)

Слова для справок: смолистые, чудесен.

Задание:

1. Разобрать предложение по членам предложения. Указать в нем части речи: Шустрые синицы пищат в сучьях.

2. Разобрать по составу слова: СНЕЖНЫЕ, ЗИМНИЙ.

3. К словам «ЗИМОЙ — , СНЕГ — , НА ВЕТВЯХ — , СЛЕДОВ — , ЛЕГКАЯ –» записать проверочные слова.

Диктант

Узнай зверька

В наших лесах живёт робкий зверёк. Летом на нём серенькая лёгкая шубка. К зиме он меняет её на пушистую беленькую. Она спасает зверька от мороза. Жилья у бедняги нет. Что у зверька на обед? Горькая кора осинки или берёзки.

Хорошо служат ему длинные ноги. Большими прыжками убегает трусишка от врагов. (52 слова.)

Слова для справок: на нём, ему.

Задание:

1. 1-е разобрать предложение по членам предложения. Указать в нем части речи:

2. Разобрать по составу слова: БЕРЕЗКИ, ШУБКА, ВРАГОВ.

3. Как назван в тексте зверек? Выписать эти слова ….

Дом под кронами дубов.старый пруд затянуло ряской. спустившись2 сюда из сада, мы спугнули плескавшихся3 здесь диких уток. неожиданно одна из них тяжело плюхнулась в пруд и поплыла, быстро-быстро рассекая зеленую воду. мне хотело пройти к разрушенному кирпичному дому, со всех сторон заросшему липами и дубами4. валентин петрович купил его, чтобы построить дом, напоминавший ему отцовский. пройдя вдоль берега пруда, мы наблюдали за скользящими в тине серебристыми карасями. невдалеке2 проглядывали остатки то ли плотины, то ли водопровода. вскоре наша тропинка устремилась к дому, обрушенные3 стены которого выглядывали сквозь кусты. над полуобвалившимся домом наконец-то загорелось ласковое солнце. среди редких облаков пролетел коршун. он вдруг недоброжелательно, заставив меня вздрогнуть от неожиданности, прикрикнул на нас с высоты. это был удивительный миг. и мне впервые было приятно слышать голоса дикой природы.мы осторожно побродили внутри заброшенного холодного дома по темным разломанным, сгнившим доскам, и петрович поделился планами его обустройства. 2 – разбор по составу3 – морфологический разбор4 – синтаксический разбор — Знания.site

Дом под кронами дубов.

Старый пруд затянуло ряской. Спустившись2 сюда из сада, мы спугнули плескавшихся3 здесь диких уток. Неожиданно одна из них тяжело плюхнулась в пруд и поплыла, быстро-быстро рассекая зеленую воду. Мне хотело пройти к разрушенному кирпичному дому, со всех сторон заросшему липами и дубами4. Валентин Петрович купил его, чтобы построить дом, напоминавший ему отцовский. 

Пройдя вдоль берега пруда, мы наблюдали за скользящими в тине серебристыми карасями. Невдалеке2 проглядывали остатки то ли плотины, то ли водопровода. Вскоре наша тропинка устремилась к дому, обрушенные3 стены которого выглядывали сквозь кусты. 

Над полуобвалившимся домом наконец-то загорелось ласковое солнце. Среди редких облаков пролетел коршун. Он вдруг недоброжелательно, заставив меня вздрогнуть от неожиданности, прикрикнул на нас с высоты. Это был удивительный миг. И мне впервые было приятно слышать голоса дикой природы.

Мы осторожно побродили внутри заброшенного холодного дома по темным разломанным, сгнившим доскам, и Петрович поделился планами его обустройства. 
2 – разбор по составу

3 – морфологический разбор

4 – синтаксический разбор

Мейотическая регуляция состава и функции комплекса Ndc80

Количественный анализ белков Р тельца дрожжей показывает принципы состава и специфичности

[Примечание редактора: далее следует план авторов по внесению исправлений.]

Основные опасения рецензентов можно резюмировать следующим образом:

1. Новизна работы не подчеркнута.Ясно, что он более всеобъемлющий, чем предыдущие работы этих авторов, но требует более перспективного и дополнительного тестирования.

Что касается новизны, мы считаем, что наша работа добавляет важные новые знания о Р-телах и биомолекулярных конденсатах в целом. Во-первых, наша работа — это единственный отчет об абсолютных или относительных концентрациях основных белков в любом конденсате. Такие концентрации являются важными знаниями при рассмотрении природы и биохимических функций тел P (и, в более широком смысле, других конденсатов).Например, модели конденсатов как отсеков для хранения подвергаются сомнению нашими данными на рисунке 3, показывающими, что только небольшая часть большинства белков присутствует в P-тельцах. Кроме того, модели конденсатов как участков высокой биохимической активности должны учитывать тот факт, что большинство неосновных компонентов сконцентрированы только <10 раз относительно окружающей цитоплазмы и что большинство молекул все еще находится в цитоплазме. Таким образом, конденсатные функции с большей вероятностью возникают из основных компонентов или из совокупностей непрофильных компонентов (например,грамм. в каскаде реакций). Это важные концепции для данной области. Во-вторых, наши данные показывают, что лишь небольшая часть из многих белков в P-телец имеет высокую концентрацию в структуре. Эта информация является ключевой для понимания строения конденсатов. Это противоречит большинству преобладающих моделей состава конденсата, которые рассматривают отсеки как трудноразрешимо сложные, с сотнями компонентов, все из которых неявно имеют одинаковый вес с точки зрения функциональной значимости. Наши данные показывают, что компартменты намного проще и предоставляют первые пути к надежному биомиметическому восстановлению.

Наконец, хотя нам предстоит еще поработать, чтобы понять корреляции на рисунке 7, как эмпирический предиктор степени, в которой полноразмерные белки могут быть сконцентрированы в конденсате, они весьма ценны для данной области.

2. Авторам необходимо рассмотреть другие модели для сборки, а не только клиент / скаффолд. Расхождения между данными и их моделью не устранены. Есть несколько подробных экспериментов, которые могли бы сделать больше, чтобы прояснить туманные выводы (см. Ниже).Например, вместо мечения одним флуорофором они могут лучше оценить состав и вариацию с помощью попарного анализа двух флуорофоров.

3. Могут ли они предоставить какие-либо дополнительные данные или идеи, чтобы пролить свет на несоответствие, которое они указывают между их моделью и результатами для DCP2?

Обеспокоенность по поводу модели каркаса / клиента, по-видимому, частично возникает из-за неправильного представления рецензентов о самой модели и о нашем намерении представить корреляции валентностей на рисунке 7.Оглядываясь назад, мы понимаем, как возникли эти неправильные представления, и полагаем, что обширный пересмотр текста в сочетании с дополнительными данными должен привести к гораздо более четкому представлению и более точной модели. Короче говоря, мы не намеревались изобразить модель, в которой валентность взаимодействий является единственным параметром, важным для определения состава конденсата, и где РНК не важна. Скорее, как предполагают составители обзора, мы полагаем, что A) РНК является ключевым каркасом для P-телец, B) важно сродство связывания белков друг с другом и с РНК и C) важна валентность взаимодействий.Мы также ошибочно отождествили «основные» белки с «каркасными» белками, а «неосновные» — с «клиентом» в предложении в начале обсуждения, цитируемом вторым рецензентом, вместо того, чтобы описать их как коррелированные, но не идентичные, что было наше намерение до конца обсуждения. Это вызвало ряд проблем, которые можно решить в пересмотренном введении и обсуждении.

Соответственно, мы не предполагали, что данные на Рисунке 7 представляют тест или валидацию основанной на валентности модели каркаса / клиента или результата, вытекающего из предыдущих данных в рукописи.Скорее, мы задумали это просто как эмпирическую корреляцию, которая потенциально может быть полезна при прогнозировании других конденсатов, где количественные данные изображений получить нелегко. Очевидно, это не было правильно, и в нашей презентации модель была основана исключительно на валентности, что не входило в наши намерения. Это можно исправить в доработке. Тем не менее, мы согласны с авторами обзора в том, что для нас важно понять, почему мутанты Dcp2 не попадают в ту же корреляцию, что и различные полноразмерные белки, и разработали дополнительный набор мутантов, чтобы лучше это понять.

Второй рецензент также обращает внимание на то, что стехиометрия ~ 1: 1 многих ядерных белков предполагает, что они могут формировать стереотипную сборку, которая связывает РНК, а затем рекрутирует другие белки, что приводит к несколько иной модели состава. У нас есть несколько мыслей по этому поводу. Во-первых, мы согласны с тем, что относительная стехиометрия поразительна. Фактически, в более ранней версии рукописи это обсуждалось довольно подробно, как и в комментариях рецензента.Тем не менее, мы в конечном итоге удалили это обсуждение, потому что A) относительная стехиометрия отличается у штаммов дикого типа, лишенных глюкозы, и B) широкий диапазон концентраций P-тел каждого компонента и отсутствие многокомпонентных корреляций в отдельных клетках дрожжей сделали это сложно претендовать на конкретную сборку. Тем не менее, мы согласны с авторами обзора в том, что наше понимание состава тела P было бы значительно укреплено путем сбора данных с двумя цветами, где мы могли бы количественно определить абсолютные концентрации 2 белков одновременно в отдельных клетках.Хотя непрактично собирать такие данные обо всех возможных парах белков P-тел, мы создадим штаммы для изучения ключевых корреляций внутри основной группы и между стержневыми и неосновными белками. Эти данные позволят нам различать разные модели состава тела Р.

[Примечание редакции: авторы отправили на повторное рассмотрение после принятия решения после экспертной оценки. Ниже следует письмо о решении после первого раунда проверки.]

Рецензенты считают, что они не могут поддержать повторное представление этой работы.Причины этого лучше всего резюмирует один из рецензентов, который утверждает:

«Я не сторонник повторного представления. Если я что-то не понял неправильно, авторы не планируют решать проблемы, связанные со значимостью и достоверностью их модели.

Авторы заявляют, что: «Как предполагают обозреватели, мы считаем, что A) РНК является ключевым каркасом для P-телец, B) важно сродство связывания белков друг с другом и с РНК и C) важна валентность взаимодействий» .

Но не предлагаю никаких экспериментов / данных, подтверждающих эти точки.

Мы приносим свои извинения за то, что в нашем первоначальном ответе не было достаточно четко заявлено, что мы намеревались серьезно пересмотреть нашу модель, лучше проиллюстрировать ее значение и проверить ее дальше. Все это мы сделали в ревизии.

Вкратце: мы больше не представляем работу как тестирование модели строительных лесов / клиента для сборки конденсата. Скорее, теперь мы предлагаем гораздо более детальный взгляд на сборку P-телец, подчеркивая роль высокой связности (связанной с валентностью, но отличной от нее) между белками и РНК в производстве конденсата, но также обсуждая важность аффинности связывания и активности. процессы.Мы также обсуждаем несколько других моделей и объясняем, как они несовместимы с данными наших и других лабораторий как в этой статье, так и в литературе. Как было предложено рецензентами и обсуждено с редактором в апреле, теперь мы получили двухцветные данные (изучение корреляции между двумя компонентами Р-тельцов) и данные, исследующие роль высокоаффинных связывающих элементов в управлении рекрутированием Р-тельцов, которые оба оказались полезными при сравнении разных моделей.

Наконец, теперь мы гораздо более подробно описываем новизну наших открытий, которые включают, среди 5 пунктов, подробно описанных в сопроводительном документе: A) открытие, что, несмотря на большое количество молекул, присутствующих в P-телах, только небольшое количество (7) сильно сконцентрированы там с большими коэффициентами разделения и B) открытие, что межмолекулярная связь играет ключевую роль в управлении концентрациями молекул в P-телах.

Они также заявляют, что: «Мы не намеревались, чтобы данные на Рисунке 7 представляли тест или валидацию основанной на валентности модели каркаса / клиента или результата, вытекающего из предыдущих данных в рукописи. Скорее, мы это намеревались просто как эмпирическая корреляция, которая потенциально может быть полезна при прогнозировании других конденсатов, когда количественные данные визуализации получить нелегко ».

Это не похоже на заголовок статьи, обещающей «композиционные принципы».Их предложение изобразить два компонента одновременно, не добавит ничего, кроме подтверждения того, что они уже показали?

Мы удалили количественные корреляции между валентностью и физическими характеристиками P-тел (исходный рисунок 7), что было проблематично по ряду причин. Наши двухцветные эксперименты предоставили важные проверки потенциальных моделей образования конденсата. Кроме того, как указано выше, мы значительно пересмотрели нашу модель.

Мы полагаем, что в рукописи изложены несколько принципов, касающихся состава P-тел.Они описаны в пересмотренном разделе «Обсуждение» статьи, который полностью переписан. К ним относятся: A) концепция (подтвержденная доказательствами), что биологические конденсаты, которые кажутся довольно сложными при качественном анализе их компонентов, на самом деле могут иметь гораздо более простую первичную сложность и организацию при количественном рассмотрении; Б) идея о том, что различия между высококонцентрированными и слабоконцентрированными белками Р-телец, вероятно, тесно связаны с их паттернами межмолекулярной связи внутри Р-телец; C) идея о том, что взаимодействия, которые производят конденсаты, распределяются по их высоко валентным компонентам, они действуют с разной степенью кооперативности, способствуя формированию более крупной сборки; и D) предсказание того, что термодинамика образования конденсата и состав получающейся в результате структуры должны быть связаны, на основе моделей связности в сети взаимодействия; я.е. Удаление сильно связанной молекулы должно влиять как на концентрации других факторов, необходимых для образования конденсата, так и на относительные концентрации компонентов в конденсате.

Наконец, утверждение о том, что «наши данные показывают, что лишь небольшая часть многих белков в Р-тельцах сильно сконцентрирована в структуре. Эта информация является ключевой для концептуализации строения конденсатов. Это говорит против большинства преобладающих моделей состава конденсата, которые Отобразить отсеки как непреодолимо сложные, с сотнями компонентов, все неявно взвешенные и одинаково функционально.Наши данные показывают, что компартменты намного проще и предоставляют первые пути к надежному биомиметическому восстановлению «.

Биомиметическое восстановление гранул РНК уже началось, и уже было показано, что нескольких компонентов может быть достаточно для имитации структуры конденсата (Feric et al., 2016, Putnam et al., 2019). Утверждение также, кажется, подразумевает, что знание концентрации каждого фактора поможет идентифицировать такие ключевые компоненты, концепция, которая остается непроверенной ».

Хотя работа, процитированная Feric и Putnam, элегантна, обе используют только два компонента в ядрышках и гранулах P соответственно.Таким образом, степень, в которой они захватывают свойства клеточных структур, неизвестна. Более того, насколько нам известно, не было установлено, что компоненты, используемые в этих реконструкциях, в количественном отношении являются доминирующими компонентами клеточных структур, или что другие компоненты имеют одинаковую концентрацию. Таким образом, опять же, степень, в которой эти воссозданные структуры воспроизводят биологические структуры, является неопределенной. На наш взгляд, важным достижением в биохимическом восстановлении конденсатов, которые очень похожи на клеточные конденсаты, является знание доминирующего (т.е. наиболее концентрированные) компоненты и их динамические свойства in vivo. Обладая этой информацией, можно комбинировать соответствующие молекулы in vitro при их общих клеточных концентрациях и узнать, образуют ли они конденсаты соответствующих концентраций компонентов (как относительных, так и абсолютных) и динамики. Если они соответствуют этим критериям для нескольких компонентов, то можно быть уверенным в том, что биохимия действительно является биомиметической. Без этой предварительной информации человек делает обоснованное предположение о том, какие белки следует комбинировать биохимически и насколько хорошо воссозданная структура имитирует клеточную структуру.

Резюме рецензента: В этой рукописи сообщается о количественном анализе состава тела P в дрожжах. Авторы характеризуют концентрацию, обогащение относительно цитоплазматического пула и динамику 31 зарегистрированного белка P-тельца, меченного GFP. Они идентифицируют 19 белков, которые были достаточно сконцентрированы в P-тельцах в тестируемых условиях, и делят их на два класса: «основная группа», состоящая из 7 белков с высоким обогащением и низкой динамикой, а остальные 12 белков с низким обогащением и высокой динамикой.Авторы утверждают, что эти наблюдения поддерживают модель каркаса / клиента для сборки конденсата, где количество партнеров по взаимодействию для данного белка (валентность) может быть использовано для прогнозирования его обогащения конденсатами / P тел.

Мы тщательно пересмотрели текст и больше не представляем работу как тестирование модели строительных лесов / клиента для сборки конденсата. Фактически, на основе наших данных мы теперь представляем новый, более детальный взгляд на номенклатуру строительных лесов / клиентов, который лучше отражает поведение природных конденсатов и будет более полезным для полевых работ.Мы также удалили анализы, описывающие количественные отношения между обогащением тел P и валентностью взаимодействий. Однако мы утверждаем, что существует значимая качественная взаимосвязь между связностью в сети взаимодействия P-тела и молекулярным поведением, с множеством оговорок, которые теперь подробно описаны в разделе «Обсуждение». Подробнее о каждом из этих вопросов мы расскажем ниже.

Основные опасения рецензентов можно резюмировать следующим образом:

1) Новизна работы не подчеркнута.Ясно, что он более всеобъемлющий, чем предыдущие работы этих авторов, но требует более перспективного и дополнительного тестирования.

Мы тщательно пересмотрели обсуждение, чтобы выделить новые принципы, которые, по нашему мнению, вытекают из наших данных. Во-первых, наша работа — это первый всесторонний количественный анализ состава и динамики любого природного биомолекулярного конденсата. Во-вторых, это количественное определение показало, что, несмотря на большое количество молекул, присутствующих в P-телах, только небольшое количество (7) сильно сконцентрировано там с большими коэффициентами разделения.Это значительно упрощает процесс формирования, регуляции и функции P-телец. В-третьих, количественный анализ показал, что только небольшая часть большинства белков присутствует в P-тельцах, что имеет важное значение для функций конденсатов. В-четвертых, большинство (6 из 7) высококонцентрированных белков / комплексов сильно связаны в сети взаимодействия P-тельцов, и ни один из слабо концентрированных белков сильно связан. Эти корреляции предполагают, что связность играет важную роль в управлении составом структур.Однако важно отметить, что другие факторы, включая сродство связывания и активные процессы, также вносят вклад в молекулярное поведение, и теперь мы объясним такие сложности в нашем обсуждении. Наконец, основываясь на наших данных и других данных в литературе, мы пересмотрели понятие каркасов и клиентов в биомолекулярных конденсатах. Мы утверждаем, что эти термины следует использовать не для классификации молекул на бинарные группы, как мы делали раньше, а скорее как качественные дескрипторы степени, в которой молекула способствует образованию и составу конденсата.Таким образом, молекула должна быть описана как более подобная каркасу или более подобная клиенту, в зависимости от того, имеет ли она больший или меньший эффект соответственно. Такое использование терминов лучше отражает экспериментальные данные, но при этом отражает идею о том, что одни молекулы вносят больший вклад, чем другие, в образование и состав конденсата.

2) Авторам необходимо рассмотреть другие модели для сборки, а не только клиент / скаффолд. Расхождения между данными и их моделью не устранены.Есть несколько подробных экспериментов, которые могли бы сделать больше, чтобы прояснить туманные выводы (см. Ниже). Например, вместо мечения одним флуорофором они могут лучше оценить состав и вариацию с помощью попарного анализа двух флуорофоров.

Теперь мы предлагаем гораздо более детальный взгляд на сборку P-телец, подчеркивая роль сильно связанных молекул (как белков, так и РНК) в производстве конденсата, но также обсуждая важность сродства связывания и других параметров.По просьбе обозревателей мы также выполнили двухцветную визуализацию, чтобы изучить корреляции между обогащением между различными молекулярными парами (новый рисунок 3). Эти данные выявили значительную корреляцию (коэффициент Пирсона 0,6-0,7) между обогащением Dcp2 и Edc3, Pat1 и Xrn1. Корреляция Dcp2-Xrn1 особенно интересна, поскольку неизвестно, как эти два белка связываются друг с другом напрямую, что указывает на корреляции, опосредованные непрямой связностью в конденсате (вероятно, через РНК или другие компоненты ядра P-тельца).Однако корреляции не столь сильны, чтобы предполагать, что стехиометрически определенный комплекс лежит в основе образования Р-телец (модель, предложенная одним из рецензентов). Более того, как мы приводим ниже, существующие данные говорят против модели, в которой РНК является единственной подобной каркасу молекулой в P-тельцах (вторая модель, предложенная в обзоре), так как ряд белков, как было показано генетически, играют важную роль в образование конденсата. Эти вопросы — кооперативность в рекрутинге, возможность стехиометрического комплекса, роли взаимодействий РНК-РНК и РНК-белок и другие факторы — теперь довольно подробно рассматриваются в разделе «Обсуждение» рукописи.Мы надеемся, что этот более подробный взгляд на образование конденсата понравится рецензентам.

3) Могут ли они предоставить какие-либо дополнительные данные или идеи, чтобы пролить свет на несоответствие, которое они указывают между их моделью и результатами для DCP2?

Мы решили эту проблему двумя способами. Во-первых, мы создали дополнительные мутанты Dcp2, чтобы лучше понять, как его связывание с Edc3 контролирует его обогащение P-тельцами (новый рисунок 6). Это приводит к важному выводу, что когда сродство между двумя конденсатными белками низкое, увеличение сродства может увеличить обогащение, но когда сродство уже высокое, его дальнейшее увеличение не увеличивает обогащение.Таким образом, настройка обогащения, вероятно, происходит за счет изменений в режиме низкого / умеренного сродства. Кроме того, как описано выше, новое обсуждение дает более детальное представление о найме, поскольку происходит из комбинации возможности подключения, аффинности и активных процессов. Вместе они объясняют поведение наших мутантов Dcp2. По существу, не все регионы Dcp2 в равной степени способствуют обогащению; удаление элемента связывания с высоким сродством (либо к РНК, либо к Edc3) имеет гораздо более выраженный эффект на обогащение, чем удаление элемента с низким сродством.

Рецензент № 1:

[…] Для дальнейшего улучшения новинки предлагаем дополнительные вопросы, на которые можно было бы ответить:

1) Основным достижением этого исследования является точное измерение концентрации GFP-слитых белков, которое выполняется путем сравнения интенсивности клеточного GFP со стандартными кривыми. Все выводы зависят от этих стандартов и вычитания фона. Несмотря на то, что лаборатория Розена ранее опубликовала статью, в которой использовался аналогичный подход (Banani et al., 2016), подробности этих калибровок и вычитания фона следует указывать в дополнительных материалах.

Мы добавили подробное описание процедуры получения изображения (показано на рисунке 1 — рисунок в приложении 2) и процедур анализа в раздел «Материалы и методы».

2) Чтобы оценить концентрацию белка в Р-тельцах, авторы сделали фундаментальное предположение: все Р-тельца имеют одинаковый и постоянный состав. Однако на Рисунке 1 авторы показали, что основные компоненты Р-телец, которые также являются наиболее распространенными белками, имеют сильную (4-5-кратную) изменчивость по концентрации и коэффициенту распределения.Неясно, как эта изменчивость влияет на относительные количественные характеристики, представленные в этой рукописи (рис. 3). Контрольный эксперимент, который мог бы ответить на этот вопрос, заключался бы в том, чтобы пометить несколько компонентов Р-телец спектрально различными флуоресцентными белками (2 или 3 одновременно) и убедиться, что ожидаемые относительные соотношения повторяются.

Отметим, что при измерении абсолютных концентраций различных видов мы не делали никаких предположений о том, имеют ли P-тела постоянный или переменный состав.Предполагая, что GFP-тегирование не изменяет концентрации данного белка (что подтверждают наши данные на рисунке 1 — рисунок в приложении 3), наши данные охватывают диапазон значений концентрации, взятых для каждого компонента в популяции клеток. Эти данные показывают, что составы имеют существенную изменчивость, как отмечает рецензент.

При интерпретации данных становится важным вопрос относительной изменчивости. Здесь мы благодарим рецензента за предложение многоцветных экспериментов. На новом рисунке 3 мы использовали двухцветную визуализацию для одновременной количественной оценки концентраций трех пар белков в отдельных клетках: Dcp2 / Edc3, Dcp2 / Pat1 и Dcp2 / Xrn1.Мы обнаружили, что во всех случаях концентрации тел P в парах значимо коррелированы (R Пирсона 0,6–0,7). Таким образом, концентрации этих компонентов колеблются вместе (хотя и с некоторой остающейся вариабельностью, поскольку значения R не равны 1). Учитывая высокую взаимосвязь взаимодействий между белками Р-тельцов, мы полагаем, что многие компоненты, вероятно, демонстрируют сходные корреляции, но более обширный анализ этого момента выходит за рамки этого и без того длительного исследования.

Могут ли быть в популяции клеток несколько типов Р-телец с разными композиционными профилями — это сложный вопрос.Мы не видим убедительных доказательств мультимодального распределения в профилях концентрации, что говорит против такой возможности. Но опять же, для всестороннего рассмотрения этой возможности потребуется гораздо больше данных, чтобы оценить, может ли распределение концентраций лучше соответствовать одной или нескольким популяциям.

3) В том же направлении неясно, экспрессировались ли белки, меченные GFP, которые использовались для количественной оценки компонентов Р-телец в фоне dcp1∆, из эндогенного локуса (Таблица 1: YRP1936, yRP2254, yRP2237, yRP2246, yRP2230, yRP1840, yRP1736, yRP2269, yRP1844, yRP1916, yRP1842).Авторы должны указать это, поскольку это будет иметь значительные последствия для количественной оценки, если будет смешанная популяция меченых и немаркированных белков.

Все меченные GFP и mCherry белки, использованные для создания рисунков 1-4, экспрессировались из своего эндогенного локуса. Об этом говорится в основном тексте и в Материалах и методах.

4) На рисунке 2 авторы обнаружили отрицательную корреляцию между скоростью восстановления фракции и концентрацией P-тел.Однако молекулярный механизм этой корреляции не обсуждается. Авторам следует расширить обсуждение и связать его с валентностью взаимодействия.

Как было предложено рецензентом, в Обсуждении мы теперь связываем связность в сети (количество различных молекулярных типов, с которыми взаимодействует данный белок, что связано с валентностью взаимодействия, количество различных молекул, с которыми взаимодействует данная молекула) с Поведение FRAP. Мы заявляем: «За исключением Xrn1 (см. Ниже), все основные белки обладают высокой валентностью взаимодействия (количество взаимодействующих молекул) и высокой связностью с другими белками Р-тельцов и РНК (≥ 4 непосредственно взаимодействующих молекул).[…] Эти функции обычно должны обеспечивать более низкую концентрацию тел P и более быстрый и полный обмен ».

5) На рисунках 4 и 5 авторы измерили коэффициенты разделения нескольких мутантов Dcp2. Было бы важно продемонстрировать, что эти мутации существенно не влияют на стабильность и экспрессию белка, с помощью вестерн-блоттинга этих мутантов.

На рис. 5 — приложение к рисунку 1B и 1C и на рисунке 7 — приложение к рисунку 1A и 1B, теперь мы показываем вестерн-блоттинг почти всех мутантов Dcp2, исследованных под микроскопом.Эти данные показывают, что белки, сравниваемые на одном рисунке, экспрессируются примерно на одном уровне. Мутанты, не исследованные вестерн-блоттингом, исследовали с помощью флуоресцентной визуализации для сравнения общего уровня экспрессии в проанализированных клетках (фигура 6 — рисунок в приложении 1). Мутанты Dcp2, сравниваемые на рисунке 6, действительно экспрессируются на несколько разных уровнях, так что Dcp2C∆5H, который слабо делится на P-тельца, экспрессируется на ~ 30% выше, чем Dcp2C∆5H-h2, который делит намного сильнее (рисунок 6 и рисунок 6 — приложение к рисунку 1).Однако направление этой разницы фактически усиливает наш вывод о том, что нижнее разделение Dcp2C∆5H происходит не из-за пониженной экспрессии.

6) На рисунке 5 авторы предполагают, что декапирующая активность Dcp2 влияет на коэффициент разделения и скорость восстановления. Однако, как авторы упоминают в тексте, неясно, связано ли это с увеличением цитоплазматической мРНК или прямым результатом каталитической активности Dcp2. Эта проблема может быть решена путем экспрессии вариантов Dcp2 в клетках дикого типа и индукции Р-телец с голоданием.

Благодарим рецензента за это предложение. Мы выполнили этот эксперимент, и результаты суммированы на новом рисунке 7. Вкратце, в условиях голодания динамика и распределение количества Р-телец одинаковы для двух мутантов, что позволяет предположить, что эти параметры в основном отвечают на мРНК. уровни при нарушении катализа. Однако общая доля материала в P-тельцах у каталитического мутанта во время голодания все же выше. Таким образом, этот параметр P-телец, по-видимому, является ответом на потерю каталитической активности.Из этих данных мы заключаем, что как увеличение уровней мРНК, так и потеря каталитической активности объясняют поведение мутанта WD.

7) На рис. 7 авторы обнаружили корреляцию между разделением Р-телец и валентностью взаимодействия белков. Это открытие было бы более убедительным, если бы авторы смогли продемонстрировать, что когда валентность взаимодействия белка увеличивается, этот белок становится более концентрированным в Р-телец. Например, это можно сделать путем слияния клиентского белка с доменом каркасного белка, такого как Dcp2C ∆5H.Слитый белок должен обладать большей валентностью взаимодействия, и можно ожидать, что слитый белок будет больше концентрироваться в Р-тельцах. Этот эксперимент также усилит вывод, сделанный на рисунке 6.

Мы удалили рисунок 7 из статьи и больше не обсуждаем количественные отношения между валентностью и разделением. Проблема с вызовом одной только валентности состоит в том, что она игнорирует сродство (проблема, о которой мы упоминали в предыдущем тексте, но не особо подчеркивали), а сродство играет важную роль в разделении Dcp2.В исправленной рукописи мы рассмотрели это двумя способами. Во-первых, мы прямо заявляем, что данные здесь и в литературе показывают, что связывание РНК N-концевым доменом и связывание Edc3 с помощью HLM1 происходит с высокой аффинностью и сильно способствует разделению Dcp2, в то время как C-концевые элементы HLM имеют меньшее сродство и вносят меньший вклад (рис. 5). Во-вторых, мы провели эксперименты, аналогичные предложенным рецензентом. Мы добавили высокоаффинный Edc3-связывающий мотив, HLM1, как к Dcp2 ∆5H, который слабо разделяет, так и к Dcp2 дикого типа, который сильно разделяет.Мы обнаружили, что добавление HLM1 только увеличивает разделение первого белка (рис. 6D). Из этих данных мы заключаем, что когда сродство к Edc3 низкое (Dcp2 ∆5H), добавление дополнительного сайта связывания с высоким сродством может увеличивать разделение Dcp2. Но когда аффинность уже высока (дикий тип Dcp2), дальнейшее ее увеличение не имеет никакого эффекта. Этот результат, вероятно, является общим при рассмотрении рекрутирования белков в конденсаты.

Рецензент № 2:

[…]

Эта модель была получена группой Розена в предыдущем исследовании, в котором изучались свойства разделения фаз in vitro искусственного набора белков с различным количеством низкоаффинных связывающих мотивов (валентность).Модель предсказывает, что «каркасы» (белки, необходимые для сборки конденсата) демонстрируют высокое обогащение и высокую валентность, тогда как «клиенты» демонстрируют низкое обогащение и низкую валентность. В соответствии с моделью авторы отмечают грубую корреляцию между валентностью и обогащением среди исследованных белков тела 19 P (но см. Ниже). Чтобы проверить модель напрямую, они удалили связывающие мотивы в одном предсказанном «высокомалентном» белке Р-телец (Dcp2). Удивительно, но они не обнаружили сильной корреляции между валентностью и обогащением (многие мутанты Dcp2 не лежат в корреляциях на Рисунке 7.Нам непонятно, как разрешить это несоответствие). Они также обнаружили, что некоторые известные клиенты (белки, не необходимые для сборки P-телец) демонстрируют сильное обогащение, вопреки модели. Несмотря на эти несоответствия, авторы продолжают утверждать, что их результаты подтверждают модель каркаса / клиента.

Мы тщательно пересмотрели текст и наш анализ наших данных, чтобы отреагировать на эту критику. Наиболее важно то, что мы удалили рисунок 7 и устранили все обсуждения, связанные с количественной корреляцией между валентностью и концентрацией P-тел.Как утверждает рецензент, одна только валентность не может объяснить наши данные о мутантах Dcp2. Теперь мы представляем гораздо более детальное представление о том, как, по-видимому, определяются концентрация и динамические свойства компонентов P-тела. Мы считаем, что связность взаимодействий (количество типов молекул, с которыми контактирует конкретная молекула) играет важную роль, поскольку большинство (6 из 7) высококонцентрированных белков также сильно связаны (≥4 партнеров по взаимодействию), и все слабоконцентрированные белки имеют низкую связность (≤2 партнеров по взаимодействию).Кроме того, было показано, что большинство (те же 6 из 7) сильно связанных молекул вносят вклад в сборку тел P, и ни одна из молекул с низкой связностью не делает этого. Тем не менее, связность — не единственный фактор, и сродство связывания и активные процессы также могут быть очень важны. В этом свете мы теперь обсуждаем, как взаимодействия N-концевого домена Dcp2 с РНК и элемента HLM1 с Edc3 имеют более высокое сродство, чем другие взаимодействия Dcp2, и, таким образом, играют более важную роль в определении концентрации белка в P-тельцах. (объясняя данные об удалении).Точно так же Xrn1 связывает РНК с высоким сродством. Таким образом, хотя его связность невысока, он сильно сконцентрирован в P-телах и показывает умеренную динамику. Что касается активных процессов, гидролиз АТФ с помощью Dcp2 также вносит вклад в динамику белка. Таким образом, связь важна, но не вся история в определении поведения молекул конденсата. Эти вопросы обсуждаются в новом Обсуждении.

Благодаря этим соображениям мы пришли к другому взгляду на то, как следует использовать понятия «эшафот» и «клиент».Вместо того, чтобы классифицировать молекулы как каркас или клиент, мы теперь считаем, что эти термины следует использовать как дескрипторы. Молекула более подобна каркасу, если она играет большую роль в сборке Р-телец, и более подобна клиенту, если играет меньшую роль. Таким образом, мы можем объяснить тот факт, что разные молекулы по-разному влияют на делецию. Например. РНК, по-видимому, является наиболее подобным каркасу компонентом P-телец, поскольку ее удаление РНКазой разрушает конденсаты (что согласуется с тем фактом, что все 19 компонентов P-телец, количественно определяемые здесь, связывают РНК), в то время как Edc3 и Pat1 менее подобны каркасу, поскольку их делеционные штаммы сохраняют некоторые Р-тельца, хотя и меньшего размера, чем штаммы дикого типа.Напротив, все 12 изученных нами неосновных белков являются клиентоподобными, поскольку ни один из них не продемонстрировал значительного уменьшения сборки P-телец при удалении. Мы отмечаем, что связность (и, вероятно, центральность сети), по-видимому, играет роль в определении того, является ли молекула более похожей на каркас или более похожей на клиента, поскольку все наиболее связанные молекулы подобны каркасу (и более центральны в теле P. сеть взаимодействия) и молекулы с небольшим количеством подключений все похожи на клиентов (и более периферийны в сети).Эти вопросы обсуждаются в новом Обсуждении в новом разделе под названием «Общие принципы строительных лесов и клиентов в природных конденсатах».

Очень удивительно, что авторы не рассматривают другие модели, которые могли бы лучше соответствовать их данным. Одна возможность состоит в том, что РНК функционирует как истинный каркас для Р-телец и что белки рекрутируются в Р-тельца в силу их сродства к РНК или другим белкам, которые связывают РНК. В этом отношении интересно, что компоненты мультибелковых комплексов обнаруживаются в примерно стехиометрических количествах в P-тельцах, что позволяет предположить, что комплексы сохраняются в конденсатах.В этой альтернативной модели высокого сродства к РНК одного белка в комплексе было бы достаточно для обогащения всего комплекса, даже если ни одна из других субъединиц в комплексе не связывается с другими компонентами P-тельца.

Насколько мы понимаем этот комментарий, рецензент предполагает, что Р-тельца образуются посредством взаимодействий между мРНК, а затем эти мРНК рекрутируют коровые белки Р-тельца за счет связывания РНК с высоким сродством. Однако несколько наблюдений в литературе опровергают эту модель.Например, как мы указываем в рукописи, формирование Р-телец явно требует белок-белковых взаимодействий, поскольку генетически показано, что Dcp2, Edc3, Dhh2, комплекс Lsm1-7 и Pat1 способствуют образованию Р-телец (например, Decker et al. , 2007; Sheth, Parker, 2006; Hondele et al., 2019; Rao, Parker, 2017). Более того, механизмы, с помощью которых белки способствуют образованию P-телец, могут быть напрямую связаны со специфическими белок-белковыми взаимодействиями, такими как димеризация Edc3 (Ling et al., 2008).Кроме того, некоторые белки нуждаются в других компонентах Р-телец для их повторного превращения в Р-тела. Напр., Dcp1 требует, чтобы Dcp2 рекрутировался в P-тела, а комплекс Lsm1-7 требует Pat1 (Teixeira and Parker, 2007). Таким образом, образование Р-телец и привлечение основных компонентов Р-телец к Р-тельцам требует взаимодействия белков.

Мы согласны с рецензентом в том, что РНК способствует образованию Р-телец. Явные данные свидетельствуют о том, что для образования Р-телец необходим пул нетранслирующих мРНК (Teixeira et al., 2005). Одна очевидная роль РНК состоит в обеспечении сайтов связывания для взаимодействующих белков, тем самым обеспечивая сборку Р-телец. В этой роли мы согласны с тем, что РНК функционирует подобно каркасу. Способствует ли РНК также образованию Р-телец посредством межмолекулярных взаимодействий РНК-РНК, еще предстоит установить. Тем не менее, модель, в которой РНК является единственным каркасом, который просто связывает белковые компоненты P-телец, маловероятна. Чтобы прояснить этот вопрос в рукописи, мы добавили этот аргумент в новое Обсуждение.

Более того, как описано выше, мы теперь представляем гораздо более подробный и детализированный вид сборки P-тела, который не зависит от простой бинарной классификации молекул как каркасов, так и клиентов. В пересмотренном Обсуждении также рассматривается вторая модель, предложенная здесь рецензентом, согласно которой высококонцентрированные белки образуют стехиометрический комплекс, который затем собирается на РНК с образованием более крупной структуры. Стехиометрический комплекс будет демонстрировать чрезвычайно высокую кооперативность при рекрутировании в P-тела, поскольку все элементы будут входить или выходить вместе.Хотя новый рисунок 3 действительно показывает корреляции между концентрациями Dcp2 в теле P с Edc3, Pat1 и Xrn1, корреляции недостаточно высоки (значения R Пирсона 0,6-0,7), чтобы предполагать стехиометрически определенную сборку, даже если белки имеют примерно равные значения. средние концентрации в конденсате. Кроме того, концентрации P-телец Pat1 и комплекса Lsm1-7 снижаются примерно в два раза в штаммах дикого типа в условиях голодания по глюкозе по сравнению со штаммами dcp1Δ , что снова говорит против дискретной сборки.Эти аргументы представлены в новом абзаце Обсуждения.

Авторы также утверждают, что их анализ показывает, что относительно небольшое количество основных белков (7) составляет большую часть содержания белка в P-тельцах. Однако, поскольку другие компоненты P-тела, возможно, еще не обнаружены, это утверждение может быть только приближенным в настоящее время. Более того, даже если это правда, значение этой гипотезы неясно — белки, присутствующие в низких концентрациях в P-тельцах, могут играть важную роль.

Мы удалили это утверждение из текста.

В заключение, хотя в этом обзоре документируются концентрации и динамика значительного количества белков P-тела, оно, по-видимому, не дает существенного понимания «правил», которые регулируют состав P-тела. Модель, предложенная авторами, не согласуется с данными, и другие более правдоподобные модели не рассматриваются.

Как описано в нашем ответе на первый сводный комментарий в верхней части этого обзора, мы чувствуем, что наша работа выявила ряд новых и важных принципов, касающихся формирования и состава P-тел.В новом тексте представлено гораздо более подробное описание сборки P-тела, которое теперь согласуется со всеми нашими данными, и рассматривает множество различных механистических проблем и возможностей.

Рецензент № 3:

[…]

— Предел новизны. Уже было известно, что эти 9 белков являются основными белками P-тельца, которые также играют некоторую роль в функции P-тельца. Эти более ранние исследования также уже показали, что некоторые из этих белков содержат несколько доменов взаимодействия, через которые взаимодействуют компоненты P-тельца.

Как описано в ответе на Сводный пункт 1 в верхней части этого письма, мы считаем, что наша работа является новой во многих отношениях, включая то, что она является первым всеобъемлющим количественным анализом любого биомолекулярного конденсата. С помощью этого количественного анализа мы выявили два различных класса молекул на основе концентрации в структурах, чего нельзя было вывести из предыдущей работы, а также важную идею о том, что почти для всех компонентов только небольшая часть молекул присутствует в P тела.Анализ этих данных в свете известных молекулярных взаимодействий также выявил корреляции между физическим поведением компонентов P-тел и их молекулярной связностью, аффинностью связывания и активностью гидролиза АТФ. Опять же, это не могло быть выведено из предыдущих данных, поскольку они по своей сути зависят от нашего количественного анализа. Если рецензент сможет указать нам на соответствующую литературу, в которой документируется, что основные белки Р-телец, которые мы определяем как высокообогащенные, имеют более высокие коэффициенты разделения, чем другие идентифицированные компоненты Р-телец, мы были бы счастливы соответствующим образом отредактировать нашу рукопись.

— Пределы количественного анализа. Конфокальный анализ имеет четкие пределы пространственного разрешения, а количественные измерения основаны на интенсивности флуоресценции, а не на измерениях отдельных молекул. Поскольку все компоненты помечены одним и тем же флуорофором (GFP), нельзя использовать парный анализ или анализ более высокого порядка для определения различий между гранулами, занятости белков, корреляции между белками, чтобы, например, проверить, все ли компоненты находятся в грануле одновременно. , и с аналогичной концентрацией.

Как подробно описано выше, мы выполнили двухцветную визуализацию нескольких пар белков P-телец и обнаружили существенную кооперативность между их обогащением. Это привело нас к более детальному рассмотрению сборки P body, которая описана в практически полностью переписанном разделе «Обсуждение» рукописи.

— Неясная актуальность анализа DCP2. Анализ DCP2, похоже, не сильно улучшает выводы статьи. Вместо того, чтобы показывать, что этот белок поливалентен, как было показано в прошлом путем разделения доменов других белков «каркаса», было бы информативно, если бы авторы предоставили, действительно ли «клиентские» белки имеют меньше доменов взаимодействия.

Наш анализ Dcp2 проанализировал механизмы, с помощью которых он обогащается внутри P тел. Хотя понятие многовалентности было продемонстрировано и для др. Белков, это рассмотрение предоставляет полезную информацию о Dcp2. Кроме того, в исследованиях Dcp2 мы обнаружили два ранее неизвестных свойства, которые, вероятно, имеют отношение к компонентам других конденсатов. Во-первых, мы обнаруживаем, что два фрагмента белка, которые только слабо разделяются на P-тельца по отдельности, при слиянии вместе сильно и совместно разделяются.Это происходит, даже если фрагменты связываются с разными компонентами P-тел, и, таким образом, не то же самое, что простая авидность. Когда мы приступили к работе, этот результат был для нас далеко не очевиден. Во-вторых, в новых данных, представленных на новом рисунке 6, мы обнаруживаем, что добавление элемента, связывающего Edc3 с высоким сродством к белку Dcp2, только увеличивает разделение на P тельца, когда Dcp2 имеет низкое сродство к Edc3. Когда сродство уже высокое, добавление дополнительных элементов привязки не имеет никакого эффекта. Таким образом, разделение компонента конденсата может быть насыщенным, вероятно, из-за ограниченных концентраций партнеров по связыванию.Опять же, это не был очевидный результат, когда мы начали эти эксперименты.

Что касается белков с поведением, подобным клиентскому (см. Ответ на пункт 1 сводки для нашего нового способа использования этого термина), как подробно описано выше, мы показываем в таблице 3 и на рисунке 2 — добавлении к рисунку 3, что все молекулы, которые слабо сконцентрированы в P Тельца имеют низкую связь с другими белками Р-телец и, как известно, не вносят значительный вклад в сборку Р-телец. Итак, действительно, поведение, подобное клиенту, коррелирует с ограниченным взаимодействием с другими компонентами тела Р.Корреляция не всегда верна в противоположном направлении. То есть существует небольшое количество белков, которые имеют лишь несколько связей с другими компонентами P-телец, но при этом сильно сконцентрированы в конденсате (Xrn1, Dcp1 и Pby1). Эти белки, как известно, обладают высоким сродством к другому высококонцентрированному компоненту P-тельца, который их рекрутирует. Эти вопросы теперь подробно рассматриваются в нашем обновленном Обсуждении.

[Примечание редакции: до принятия были предложены дальнейшие исправления, как описано ниже.]

Редакций:

Рецензенты сочли, что рукопись и работа вносят вклад в эту область, но необходимы некоторые исправления, чтобы учесть оговорки при интерпретации данных. Например, рецензент 2 считает, что термин «кооперативность» надлежащим образом не подтверждается данными и что мРНК не рассматривается как компонент P-телец.

Мы изменили описание данных на рисунке 5F, источника этого утверждения, на «синергетический», в котором говорится, что эффект объединения двух компонентов вместе приводит к большему эффекту, чем сумма компонентов по отдельности.В случае Dcp2 конструкция Dcp2 300Δh2 имеет ПК, равное 2,5, а конструкция Dcp2C Δ5H имеет ПК, равное 3,5, в то время как конструкция Dcp2Δh2 Δ5H, которая объединяет Dcp2 300Δh2 и Dcp2C Δ5H, имеет ПК 31, что> 2,5 *. 3.5. Таким образом, система соответствует определению синергии. Теперь отметим, что этот эффект может быть результатом кооперативного связывания с молекулами в теле P.

В рукописи РНК упоминается как важный компонент P-тельца. Мы считаем, что этого достаточно, особенно с учетом того, что статья сосредоточена на описании белков Р-тел, а не РНК.

Reviewer 3 считает, что функциональные свойства недостаточно изучены, особенно с учетом специфичности (почему исключены некоторые мРНК и RBP?).

Наше исследование не пытается рассмотреть функцию P-тел. Это сложный вопрос, который потребует гораздо больше и других данных, чем мы реально можем поместить в рукопись. Наша работа действительно затрагивает специфичность рекрутирования белков в значительной степени посредством идеи синергетического рекрутирования Dcp2 в P тельца.То есть, резидентные белки часто содержат несколько слабых элементов рекрутирования, и, следовательно, белки, которые содержат мало таких элементов, рекрутируются плохо, если вообще рекрутируются. Рекрутирование РНК может следовать схожим принципам, и теперь мы прямо упоминаем эту идею.

Рецензент № 2:

В этой в значительной степени отредактированной рукописи авторы сообщают о всесторонней количественной оценке составляющих белков биологического конденсата, обедненных Dcp1 Р-телец дрожжей. Благодаря этому они идентифицировали семь белков «ядра» P-тельцов, которые существенно разделены, имеют высокую концентрацию и медленную подвижность при обогащении P-тельцами (рис. 1 и 2).Концентрация этих семи белков в тельцах P положительно коррелирует, что согласуется с предыдущими данными, показывающими, что эти белки взаимодействуют биохимически (рис. 3). Сообщенные параметры обогащения кажутся похожими, когда обедненные Dcp1 P-тельца сравниваются с P-тельцами дикого типа в условиях глюкозного голодания, однако Dcp1 и его партнер по связыванию Pby1 отсутствуют, и деградация РНК дефектна в модели P-тельцов, используемой на протяжении всего анализа. Таким образом, хотя на уровне их биофизического анализа P-тела, обедненные Dcp1, кажутся похожими на P-тела в физиологических условиях, функционально эти «P-тела» различны.Это снижает актуальность данного исследования.

Автор обзора прав в том, что мы изучали Р-тельца в 2 различных условиях, только одно из которых является диким типом. Отметим, что это не полностью отличается от большинства исследований в этой области. Например, большинство анализов стрессовых гранул индуцируют в них мышьяк, токсин, который редко встречается в естественной биологии. Многие другие исследования связаны с избыточной экспрессией отдельных компонентов, что также является нефизиологической ситуацией.Тем не менее, такой анализ имеет существенное значение для понимания принципов, по которым собирается конденсат, и мы чувствуем, что наше исследование проводится в том же ключе. В то время как Dcp1 — / — P тельца и P тельца дикого типа, лишенные глюкозы, могут иметь разные функции, что поразительно, так это то, что их составы тесно связаны. Кроме того, сохраняются ключевые паттерны состава — небольшое количество высококонцентрированных белков и большее количество слабоконцентрированных белков — что является важной особенностью этих клеточных структур, которая, насколько нам известно, не была исследована в других местах (даже 3 недавно опубликованных Cell в статьях о стрессовых гранулах указаны только коэффициенты распределения, в которых отсутствует информация относительно абсолютных концентраций, указанных здесь).

На рис. 4 авторы наблюдают, что концентрации корового белка в Р-теле в значительной степени не зависят от стрессовых условий, однако авторы рассматривали только белковые компоненты, в то время как регулируемым субъектом стрессовых Р-телец являются мРНК, а не белки.

Мы заявляем, что наши данные не касаются изменений в содержании мРНК во время голодания: «… они также не говорят о секвестрации / хранении РНК…». Мы также отмечаем, что основной смысл рисунка 4 состоит в том, чтобы показать, что для большинства белков Р тельца существенно не истощают количество молекул из цитоплазмы, не сравнивая Dcp1 — / — и Р тельца дикого типа, лишенные глюкозы.Если обозреватель заинтересован, недавние результаты, полученные на клетках млекопитающих, предполагают, что состав мРНК P-тельца, по-видимому, в значительной степени регулируется скоростью их трансляции, возможно, с дополнительным вкладом от длины поли (A) хвоста (Matheny et al., 2019) .

Затем авторы анализируют локализацию P-тельца DCP2 в двойном нуль-мутанте Dcp1, Dcp2, который все еще образует некоторые P-тела (хотя на рис. S1A показано только присутствие небольших структур, подобных «P-тельцам», но без количественного сравнения с контрольными P-тельцами, в дикого типа при голодании по глюкозе и истощении Dcp1).

Мы не совсем уверены, о чем здесь спрашивает рецензент, поскольку мы количественно оценили PC и динамику для различных повторно экспрессируемых мутантов Dcp2. Теперь мы количественно оценили распределение по размеру точки Edc3 в двойном нулевом мутанте Dcp1, Dcp2, показанном на рисунке S5A (рисунок S1A не имеет отношения к этим экспериментам; мы предполагаем опечатку от автора обзора), и сообщаем, что на рисунке 5 — дополнение 1А.

В исследованиях делеций авт. Обнаруживают, что различные домены Dcp2 вносят вклад в разделение P тел и демонстрируют некоторую избыточность между доменом h2 и др. Спиральными доменами в CTP.Авторы приходят к выводу, что элементы в Dcp2 действуют «кооперативно». Однако их данные показывают аддитивность или, в лучшем случае, синергию, но не кооперативность. Чтобы использовать термин кооперативность, авторам необходимо продемонстрировать, что начальное событие связывания увеличивает сродство связывания последующих событий связывания.

Как указано выше, мы изменили наше описание данных на рисунке 5F, источника этого утверждения, на «синергетический», в котором говорится, что эффект объединения двух компонентов вместе приводит к большему эффекту, чем сумма компонентов по отдельности.В случае Dcp2 конструкция Dcp2 300Δh2 имеет ПК, равное 2,5, а конструкция Dcp2C Δ5H имеет ПК, равное 3,5, в то время как конструкция Dcp2Δh2 Δ5H, которая объединяет Dcp2 300Δh2 и Dcp2C Δ5H, имеет ПК 31, что> 2,5 *. 3.5. Таким образом, система соответствует определению синергии. Теперь отметим, что этот эффект может быть результатом кооперативного связывания с молекулами в теле P.

Авт. Используют исследование структуры-функции DCP2, чтобы доказать, что связность, аффинность и каталитическая активность являются тремя основными факторами для рекрутирования DCP2 P телец и размера и количества P телец.Однако необходимо провести более конкретные эксперименты, чтобы укрепить этот аргумент или обобщить открытие для других компонентов P-телец или других типов RNP-телец: 1) проведение исследования делеции домена / сайта связывания на Edc3 или других основных белках; 2) добавление валентного или высокоаффинного сайта связывания к клиентоподобному белку, чтобы превратить его в каркас (достаточность). 3) Тестирование модели с белками каркаса стрессовых гранул.

Мы согласны с тем, что наши аргументы будут подкреплены дополнительными экспериментами, которые запланированы для дополнительных проектов и публикаций в будущем.

В целом, это исследование технически выполнено хорошо, но довольно ограничено по своему содержанию или новизне. Истинное функциональное считывание отсутствует, поскольку экспериментальная установка не связана с функцией P-тельца (например, уровнем РНК в различных гранулах и активностью по удалению колпачков). Рукопись можно легко сжать до четырех рисунков, каждая из которых представляет собой одну точку для характеристики конкретного типа конденсата: Рисунок 1 и 2: обогащение определенных факторов в P-телах, Рисунки 3 и 4 соотношение концентраций между компонентами и в различных условиях. и рисунки 5 и 6, структурный анализ одного компонента, предполагающий частичную избыточность между CTD-спиралями, и рисунок 7 с исследованиями, касающимися связывания РНК.

Мы согласны с тем, что мы не пытались рассматривать функцию тела P в этой работе. Мы считаем, что такой анализ потребует отдельной публикации. Учитывая отсутствие ограничений по цифрам в eLife , мы не сжимали данные в меньшее количество цифр, так как мы опасаемся, что это затруднит чтение и понимание статьи (например, рисунок 4 не предназначен для сравнения различных условий, но скорее, чтобы подчеркнуть, что большинство молекул не присутствует в P-тельцах для большинства видов.Отсюда его название: «Р-тельца не сильно изолируют свои резидентные белки».

Рецензент № 3:

В этой отредактированной рукописи Xing et al. проанализировать обогащение и динамические свойства белков тельца ~ 20 P в дрожжах. Описательная часть исследования достаточно обширна (31 белок включен в первоначальный обзор, 19, численность которых была определена количественно) и предполагает существование двух групп: белки, сильно обогащенные P-тельцами, некоторые из которых также необходимы для сборки P-телец — и менее обогащенные белки — меньшее количество которых влияет на сборку P-телец.Исходя из этого, авторы предполагают, что P-тельца «биохимически проще, чем предполагает протеомика». В лучшем случае это предположение, а в худшем — грубое упрощение, поскольку изобилие не обязательно является предиктором функции — особенно для ферментов.

Для ясности мы изменили вывод на «композиционно проще, чем предполагает протеомика». Это должно устранить основную озабоченность рецензента. Однако мы отмечаем, что наши данные на рисунке 4 противоречат утверждению рецензента о том, что численность не предсказывает функцию.Этот рисунок показывает, что для почти всех белков, обогащенных P-тельцами, подавляющее большинство молекулярных видов составляют , а не в организме, а скорее присутствуют в цитоплазме. Для всех молекул, кроме 6 верхних, менее 20% находится в теле, даже при консервативной поправке на ненаблюдаемые субдифракционные Р-тела (без этой поправки значение падает до 8%). Таким образом, трудно утверждать, что количество P-тельца имеет большое значение для общей активности этого вида в клетке.Есть способы обойти эту проблему, включая, например, огромное увеличение удельной активности (активности на молекулу) внутри P-тельца по сравнению с цитоплазмой или совместную концентрацию нескольких молекул в каскаде. Но это требует дополнительных предположений, и, по нашему мнению, точка зрения первого порядка состоит в том, что изобилие действительно играет важную роль в определении биохимических функций, возникающих из конденсатов, и, поскольку только небольшое количество молекул является высококонцентрированным, компартменты фактически являются , вероятно, будет биохимически проще, чем можно представить из исследования протеомики, которое не определяет концентрации и, таким образом, по существу взвешивает все компоненты одинаково.

Во второй части исследования авторы исследуют домены в DCP2, необходимые для локализации P тела, и идентифицируют множественные домены, которые, по-видимому, функционируют частично избыточно. Они пришли к выводу, что совокупность синергических взаимодействий управляет сборкой P-телец, что было сделано несколькими другими исследованиями (рассмотренными в Lu Na and Slavoff, 2018), включая анализы in vitro (Shutz et al., 2017).

В целом, у нас осталось исследование, которое будет полезным справочным материалом для будущих исследований тела P, но оно не соответствует обещанию «принципов состава и специфичности».В частности, вопрос специфичности (почему не все РНК-связывающие белки локализуются в P-тельцах?) Напрямую не рассматривается. Авторы проводят исследования структуры-функции только одного белка Р-тельца и никогда не рассматривают, что исключает другие РНК-связывающие белки из Р-тельцов.

Как указано выше, мы считаем, что наша работа действительно затрагивает специфичность рекрутирования белков в значительной степени посредством идеи синергетического рекрутирования Dcp2 в P тельца. То есть, резидентные белки часто содержат несколько слабых элементов рекрутирования, и, следовательно, белки, которые содержат мало таких элементов, рекрутируются плохо, если вообще рекрутируются.Рекрутирование РНК может следовать схожим принципам, и теперь мы прямо упоминаем эту идею.

Наша работа также предполагает, что другие связывающие РНК белки действительно накапливаются в Р-тельцах, но их уровень просто отражает количество доступных сайтов связывания в мРНК Р-тельцов. В частности, хотя РНК-связывающий белок MS2 обычно не накапливается в Р-тельцах, добавление множества сайтов связывания для этого белка в мРНК, резидентную в Р-тельцах, может привести к накоплению MS2 в Р-тельцах.Во-вторых, мы действительно наблюдаем другие РНК-связывающие белки в Р-тельцах, просто они менее эффективно делятся на Р-тельца, чем основные компоненты (рис. 1).

Отметим, что исключение молекул из конденсата (PC <1) будет очень сложно наблюдать и значимо количественно оценить в клетках, учитывая небольшой размер структур. Более того, более вероятно, что большинство молекул просто не будет задействовано (PC ~ 1), чем будет открыто исключено; мы не знаем о молекулах, исключенных из P-тел.В общем, физические механизмы, которые позволяют исключить образование конденсатов in vivo, вообще не поняты и выходят далеко за рамки настоящего исследования.

Мы также отмечаем, что, насколько нам известно, это первый раз, когда синергизм был количественно продемонстрирован для рекрутирования белка в конденсат in vivo. Упомянутая выше работа Sprangers интересна, но проводится исключительно in vitro. В клетках, чтобы заявить о синергии, необходимо удалить белок, а затем количественно оценить коэффициенты разделения для различных фрагментов при повторном введении индивидуально и вместе, как мы это сделали.Нам неизвестно, чтобы такой уровень количественного анализа проводился где-либо еще.

Дополнительные комментарии:

1) Авторы не последовательны в описании CTD. Во-первых, они предполагают, что «N-концевой домен, HLM1 и C-концевой домен все необходимы для эффективного разделения и поддержания характерной медленной динамики Dcp2». Однако позже они говорят, что «удаление CTD не влияет на ПК с полноразмерным Dcp2». Представленные данные предполагают, что C-концевой домен не требуется (300-конец), но может компенсировать отсутствие HLM1.

Благодарим рецензента за обнаружение этого несоответствия. Мы изменили первое утверждение на «Поскольку N-концевой домен и HLM1 необходимы для эффективного разделения и поддержания характерной медленной динамики Dcp2, а C-концевой домен может компенсировать отсутствие HLM1, мы заключаем, что элементы, управляющие разделением и динамика распределяется по белку ».

2) Неповрежденный C-концевой домен никогда не тестируется; вместо этого авторы использовали CTD с 5 мутированными доменами HLM.Хотя авторы подразумевают, что эта версия CTD имеет более слабую связь с телами P, данные не показаны, и из текста неясно, почему была использована эта версия CTD.

У нас были эти данные, и теперь мы показываем их на рисунке 5 — рисунок в приложении 1С.

3) Для данных на фиг. 7 авторы используют конструкции DCP2 с пониженным связыванием с Edc3, чтобы исследовать роль связывания РНК и активности снятия колпачков в ассоциации P-телец. Однако неясно, почему связывание РНК изучали с использованием мутанта Dcp2 300, а декапирование изучали на мутанте Dcp2Δh2.

По сути, это были исторические особенности работы, связанные с тем, когда мы получали различные конструкции. Мы не считаем, что различия здесь влияют на наши выводы.

4) Рисунок, сравнивающий концентрацию / коэффициент распределения тел P и скорости обмена для различных мутантов DCP2 (аналогично рисункам 2A и B), может быть более интуитивным способом сравнения всех различных мутантов DCP2, использованных в этом исследовании.

Мы считаем, что, хотя такой сюжет в некоторых отношениях может помочь, в других он отвлекает внимание, и не включает его.Принципиальный недостаток состоит в том, что на рисунке 2 мы специально подчеркиваем корреляцию между концентрацией тел P и обменными курсами. Но точки на рисунках 5 и 6 отличаются, и они сосредоточены на понимании различных аспектов рекрутирования Dcp2.

5) Исследования структурной функции DCP2 идентифицируют домены в DCP2, которые способствуют локализации P-телец. Достаточно ли этих доменов, чтобы направить белок, не являющийся P-телом, в P-тельца, не решается. Без таких «достаточных» экспериментов остается неясным, можно ли обобщить результаты для DCP2 для других белков.Например, они предполагают, что Xrn1 стабильно рекрутируется из-за его высокой аффинности связывания РНК, однако эта гипотеза не объясняет, почему другие высокоаффинные связывающие РНК белки исключаются из P тельцов.

В этом комментарии рассматриваются два момента. Во-первых, могут ли домены внутри Dcp2, которые способствуют локализации P-телец, действовать доминирующим образом. По сути, мы продемонстрировали этот феномен с GFP как чужеродным белком. Связанный с этим вопрос, но один выходит за рамки этой рукописи: может ли нацеливающий домен P-тельца Dcp2 перекрывать свойства других связывающих РНК белков, которые либо исключают их из P-тельцов, либо нацеливают эти связывающие РНК белки на другие конденсаты.Мы согласны с тем, что это будет интересный вопрос, и рассмотрим его в будущей работе.

Второй момент, который поднимает рецензент, заключается в том, что мы не понимаем, почему другие связывающие РНК белки, которые могут связывать РНК с высокой аффинностью, не сильно разделяются на Р-тельца. Два наблюдения предполагают, что другие связывающие РНК белки действительно накапливаются в Р-тельцах, но их уровень просто отражает количество доступных сайтов связывания в мРНК Р-тельцов. В частности, хотя РНК-связывающий белок MS2 обычно не накапливается в Р-тельцах, добавление множества сайтов связывания для этого белка в мРНК, резидентную в Р-тельцах, может привести к накоплению MS2 в Р-тельцах.Во-вторых, мы действительно наблюдаем другие РНК-связывающие белки в Р-тельцах, просто они менее эффективно делятся на Р-тельца, чем основные компоненты (рис. 1).

6) В конце обсуждения авторы вводят концепцию авидности, когда множественные взаимодействия приводят к сильному связыванию. Возможно, будет полезно познакомить вас с этой концепцией раньше.

Теперь мы представили идею жадности в разделе результатов на рисунке 5.

Механизмы разборки реплисом эукариот | Сделки Биохимического Общества

Клетки почкующихся дрожжей, лишенные Dia2 ( dia2 Δ клеток), сохраняют реплисомы на хроматине через митоз и в G1 следующего клеточного цикла [18], указывая тем самым, что разборка CMG у почкующихся дрожжей контролируется только одним путем. Однако это не относится к высшим эукариотам, где недавние работы показали существование Cullin2 ^LRR1 -независимых путей для разборки CMG.Было показано, что в отсутствие активности Cullin2 ^LRR1 терминированные реплисомы остаются на хроматине во время S-фазы, но вступление в митоз приводит к быстрой разборке реплисом, что указывает на активацию митотического специфического пути (Рисунок 4A) [19,39 , 40]. На этом пути убиквитинлигаза TRAIP отвечает за убиквитилирование Mcm7 и разборку CMG [39,40]. В отличие от S фазы, убиквитиновые связи, необходимые для митотического пути разборки реплисом, включают lysine 6 (K6) и lysine 63 (K63), и в целом паттерн убиквитилирования отличается, согласуясь с более длинными цепями, собираемыми на Mcm7 в митозе [40].В настоящее время мы не знаем, требует ли этот путь убиквитилирования других компонентов CMG. В отличие от Cullin2 ^LRR1 , TRAIP конститутивно связан с реплисомой [20,41] и его активация во время митоза, по-видимому, регулируется механизмом, который не включает его рекрутирование de novo в реплисому. Этот митотический путь разборки реплисом также требует активности p97 [39,40] и других факторов, которые были идентифицированы у эмбрионов C. elegans , включая кофакторы p97 UFD-1-NPL-4 и UBXN-3 (гомолог червя супрессор опухолей позвоночных Faf1), а также протеазу SUMO ULP-4 (червь, гомолог протеазы SUMO SENP6 / 7 позвоночных) [19].Точные роли UBXN-3 и ULP-4 в разборке митотических реплисом еще предстоит выяснить. Однако неудивительно, если будет обнаружено, что для этого митотического пути требуется еще больше кофакторов p97, поскольку кажется вероятным, что разные кофакторы будут способствовать распознаванию различных связей убиквитина. Было бы интересно исследовать, играет ли Faf1, как в C. elegans , какую-либо роль в разборке митотических реплисом у др. Многоклеточных животных. Роль пути SUMO во время разборки митотической реплисомы была изучена в экстракте яиц Xenopus , и было показано, что на последний не влияет усиленная конъюгация SUMO или ингибирование деконъюгации SUMO.Более того, ингибирование конъюгации SUMO также не влияет на разборку митотических реплисом, указывая тем самым, что активность пути SUMO не важна для разборки реплисом во время митоза в этой модельной системе [40]. Следовательно, участие ULP-4 во время разборки митотической реплисомы в C. elegans может быть ограничено этим организмом, или не повторяться в яичном экстракте Xenopus , или его ферментативная активность просто не требуется для разборки митотической реплисомы; вместо этого он может опосредовать белок-белковые взаимодействия.

Состав кинетохор и их функции: уроки дрожжей | Обзоры FEMS Microbiology

Аннотация

Правильная сегрегация хромосом во время деления клеток важна для пролиферации, и этому способствуют кинетохоры, большие белковые комплексы, собранные в центромерной области хромосом. Хотя последовательности центромерной ДНК полностью различаются у разных организмов, многие компоненты кинетохор, собранные на центромерах, очень хорошо законсервированы среди эукариот.Чтобы определить идентичность центромер, центромерный белок A (CENP-A), который гомологичен каноническому гистону h4, действует как ориентир для сборки кинетохор. Кинетохоры обеспечивают прикрепление веретена к микротрубочкам и контролируют движение хромосом во время митоза и мейоза. Чтобы провести точную сегрегацию хромосом, сборка кинетохор и прикрепление микротрубочек тщательно регулируются. Здесь мы рассматриваем текущее понимание состава, сборки, функций и регуляции кинетохор, выявленное в основном в результате исследований делящихся и почкующихся дрожжей.Более того, поскольку недавние кумулятивные доказательства подтверждают важность регуляции ориентации прикрепления кинетохор к микротрубочкам, которая отчетливо различается между митозом и мейозом, мы уделяем особое внимание молекулярным механизмам, лежащим в основе этой регуляции.

Введение

Для передачи генетической информации дочерним клеткам реплицированные хромосомы, называемые сестринскими хроматидами, должны быть точно разделены. Динамический процесс сегрегации хромосом обеспечивается взаимодействием хромосома-микротрубочка через кинетохоры, сформированные на центромерной ДНК.Недавние исследования выявили молекулярные детали компонентов и функций кинетохор. Почкующиеся дрожжи Saccharomyces cerevisiae и делящиеся дрожжи Schizosaccharomyces pombe могут быть лучшими модельными организмами в этой области из-за их относительной простоты. Однако у этих двух дрожжей очень разные центромерные структуры. У почкующихся дрожжей есть точечная центромера, определяемая последовательностью 125 пар оснований CEN (Clarke & Carbon, 1980), тогда как у делящихся дрожжей центромерная ДНК охватывает более 40 т.п.н. ДНК (Chikashige et al ., 1989), собирая региональную центромеру, которая больше похожа на таковую у высших эукариот (Cleveland et al ., 2003; Black & Bassett, 2008). Хотя особенности центромерной ДНК совершенно разные, многие компоненты кинетохор, собранные на центромерах, очень хорошо сохраняются во всех организмах. В этом обзоре мы обрисовываем текущее состояние исследований кинетохор дрожжей.

Определение местоположения кинетохоры

Хотя последовательность центромерных ДНК сильно различается у разных видов, центромерные нуклеосомы обычно содержат вариант гистона h4 Cse4 / Cnp1 / CENP-A (рис.1) (обзор, в частности, Kitagawa & Hieter, 2001; Henikoff & Dalal, 2005; Black & Bassett, 2008; Wang et al. ., 2008). Нуклеосомы CENP-A функционируют как каркас, на котором собираются другие кинетохорные белки. Точечная центромера почкующихся дрожжей предоставляет отличную модель для изучения того, как определяется центромерная область (Meluh et al ., 1998). В ДНК CEN почкующихся дрожжей есть три консервативных элемента: CDE (центрерный элемент ДНК) I , CDEII и CDEIII (Kiermaier et al ., 2009). Предыдущие исследования выявили несколько факторов, которые напрямую связаны с этими регионами. CBF1 (фактор связывания центромеры 1), спираль-петля-спираль, связывается с CDEI , тогда как CBF3, который включает четыре белка, Ndc10, Ctf13, Cep3 и Skp1, связывается с областью CDEIII (Connelly, 1996; Cam et al ., 2008; Sarkar et al ., 2013). Важно, что CBF3 необходим для ассоциации CENP-A с центромерной ДНК, возможно, посредством прямого взаимодействия между Ndc10 и шапероном CENP-A Scm3 (Cho & Harrison, 2012).В отличие от точечных центромер, региональные центромеры, наблюдаемые у делящихся дрожжей и высших эукариот, определяются эпигенетическими механизмами, а не самой последовательностью ДНК. В соответствии с этим функциональная неоцентромера (центромера, сформированная в нецентромерном сайте на хромосоме) может формироваться, если эндогенная центромерная ДНК теряется (Ishii et al ., 2008). Центромеры делящихся дрожжей, как и у большинства высших эукариот, состоят из центральной области ядра ( cnt и imr ), где существуют Cnp1-содержащие нуклеосомы, и фланкирующих повторяющихся последовательностей ( или ), которые собирают гетерохроматин (рис.1) (Оллшир, 1995). Центромера человека намного длиннее ( c . 0.5-4.0 Mb) и содержит альтернативные блоки нуклеосом CENP-A и нуклеосомы канонического гистона h4 (Рис. 1) (Wevrick & Willard, 1989; Willard, 1990).

Рисунок 1

Разнообразие центромерной структуры и распределение нуклеосом CENP-A среди эукариот. Схематическое изображение центромер у почкующихся дрожжей ( Saccharomyces cerevisiae ), делящихся дрожжей ( Schizosaccharomyces pombe ) и человека.У почкующихся дрожжей есть точечная центромера, которая определяется последовательностью 125 пар оснований и занята единственной нуклеосомой CENP-A (CSe4). Schizosaccharomyces pombe и человек имеют региональные центромеры, фланкированные перицентромерным гетерохроматином. В Schizosaccharomyces pombe множество нуклеосом, содержащих CENP-A (Cnp1), собраны в уникальные последовательности ( cnt и imr ). Центромеры человека состоят из α-сателлитной ДНК, упорядоченной в тандеме в повторы более высокого порядка (каждая стрелка), а некоторые α-сателлитные ДНК содержат сайты связывания CENP-B (CENP-B box).CENP-A локализуется в части этих массивов. Количество мест прикрепления микротрубочек также варьируется у разных организмов. CENP-B является высококонсервативным центромерным белком у млекопитающих и связывается с мотивом из 17 пар оснований в блоке CENP-B. Было показано, что α-сателлитная ДНК с CENP-B-боксом ответственна за сборку de novo центромер в соматических клетках человека (Masumoto et al. ., 2004), хотя мыши, лишенные CENP-B, жизнеспособны (Hudson ). et al ., 1998). Делящиеся дрожжи также имеют гомологи CENP-B, Abp1, Cbh2 и Cbh3.Регуляторные роли этих гомологов в спецификации центромер остаются неуловимыми; однако они регулируют стабильность генома посредством репликации, целостности гетерохроматина и подавления ретротранспозонов (Murakami et al ., 1996; Halverson et al ., 1997; Irelan et al ., 2001; Cam et al ., 2008. ).

Рисунок 1

Разнообразие центромерной структуры и распределение нуклеосом CENP-A среди эукариот. Схематическое изображение центромер у почкующихся дрожжей ( Saccharomyces cerevisiae ), делящихся дрожжей ( Schizosaccharomyces pombe ) и человека.У почкующихся дрожжей есть точечная центромера, которая определяется последовательностью 125 пар оснований и занята единственной нуклеосомой CENP-A (CSe4). Schizosaccharomyces pombe и человек имеют региональные центромеры, фланкированные перицентромерным гетерохроматином. В Schizosaccharomyces pombe множество нуклеосом, содержащих CENP-A (Cnp1), собраны в уникальные последовательности ( cnt и imr ). Центромеры человека состоят из α-сателлитной ДНК, упорядоченной в тандеме в повторы более высокого порядка (каждая стрелка), а некоторые α-сателлитные ДНК содержат сайты связывания CENP-B (CENP-B box).CENP-A локализуется в части этих массивов. Количество мест прикрепления микротрубочек также варьируется у разных организмов. CENP-B является высококонсервативным центромерным белком у млекопитающих и связывается с мотивом из 17 пар оснований в блоке CENP-B. Было показано, что α-сателлитная ДНК с CENP-B-боксом ответственна за сборку de novo центромер в соматических клетках человека (Masumoto et al. ., 2004), хотя мыши, лишенные CENP-B, жизнеспособны (Hudson ). et al ., 1998). Делящиеся дрожжи также имеют гомологи CENP-B, Abp1, Cbh2 и Cbh3.Регуляторные роли этих гомологов в спецификации центромер остаются неуловимыми; однако они регулируют стабильность генома посредством репликации, целостности гетерохроматина и подавления ретротранспозонов (Murakami et al ., 1996; Halverson et al ., 1997; Irelan et al ., 2001; Cam et al ., 2008. ).

Механизм отложения Cnp1 / CENP-A на центромерах широко изучался на делящихся дрожжах. Напр., Комплекс Mis6 / Sim4 локализуется на центромерах и необходим для центромерной ассоциации Cnp1 (Takahashi et al ., 2000; Pidoux и др. ., 2003). Др. Фактором, необходимым для отложения Cnp1, является комплекс Mis16-Mis18, который может удерживать центромерные гистоны деацетилированными (Hayashi et al ., 2004). Комплексы Mis6 и Mis16 необходимы для центромерной локализации Scm3, что также необходимо для отложения Cnp1 в центромерах делящихся дрожжей (Pidoux et al. ., 2009; Hinshaw & Harrison, 2013). Следовательно, как и у почкующихся дрожжей, центромерная локализация CENP-A шаперона Scm3 может быть центральным регуляторным признаком центромерного отложения Cnp1, который формирует основу для сборки кинетохор.Многие из факторов, необходимых для отложения Cnp1 на центромере у делящихся дрожжей, эволюционно законсервированы и, как известно, важны для центромерной локализации CENP-A в клетках человека (Stellfox et al ., 2013).

Кинетохор в сборе

Благодаря недавнему прогрессу в идентификации белковых компонентов кинетохор мы теперь знаем более 50 белков, которые собираются на кинетохорах (Obuse et al ., 2004; Cheeseman et al ., 2006, 2008; Foltz и др. ., 2006; Изута, и др., , 2006; Окада и др. , 2006; Westermann & Schleiffer, 2013). Кинетохора примерно делится на две части: внутреннюю кинетохору и внешнюю кинетохору. Белки, которые образуют внутреннюю кинетохору, взаимодействуют с центромерным хроматином, в то время как белки внешней кинетохоры вносят вклад в интерфейс связывания микротрубочек. В этом разделе и на рис. 2 мы кратко суммируем известные функции нескольких важных кинетохорных белков.Более подробную информацию о составе кинетохорных факторов и их сохранении можно найти, обратившись к следующим превосходным обзорам (Ogiyama & Ishii, 2012; Funabiki & Wynne, 2013; Roy et al. ., 2013; Westermann & Schleiffer, 2013).

Рисунок 2

Схематическое изображение кинетохорной структуры. Внутренний KT (кинетохора) состоит из белков CCAN (конститутивная сеть, связанная с центромерой), включая CENP-A, CENP-C и CENP-T.CENP-C напрямую взаимодействует с нуклеосомой CENP-A. CENP-C также связывается с Nnf1, субъединицей комплекса Mis12, предполагая, что CENP-C может действовать как медиатор CCAN и внешних белков KT (сеть KMN). CENP-T также связывает комплекс Ndc80. Это взаимодействие необходимо для локализации комплекса Ndc80 в кинетохорах, это указывает на то, что CENP-T, подобно CENP-C, также может опосредовать взаимодействие между центромерным хроматином и внешними белками KT. Обратите внимание, что CENP-T и комплекс Mis12 являются конкурирующими партнерами по связыванию для комплекса Ndc80 (показано красным прямоугольником) (Bock et al ., 2012; Schleiffer et al ., 2012). Комплекс Ndc80 и N-концевые основные остатки Knl1 обладают активностью связывания микротрубочек и, таким образом, действуют как интерфейсы для взаимодействия кинетохора-микротрубочка. Считается, что комплекс Dam1 как у почкующихся дрожжей, так и у делящихся дрожжей поддерживает эти взаимодействия. У человека комплекс Ska может быть функциональным гомологом комплекса Dam1.

Рисунок 2

Схематическое изображение кинетохорной структуры. Внутренний KT (кинетохора) состоит из белков CCAN (конститутивная сеть, связанная с центромерой), включая CENP-A, CENP-C и CENP-T.CENP-C напрямую взаимодействует с нуклеосомой CENP-A. CENP-C также связывается с Nnf1, субъединицей комплекса Mis12, предполагая, что CENP-C может действовать как медиатор CCAN и внешних белков KT (сеть KMN). CENP-T также связывает комплекс Ndc80. Это взаимодействие необходимо для локализации комплекса Ndc80 в кинетохорах, это указывает на то, что CENP-T, подобно CENP-C, также может опосредовать взаимодействие между центромерным хроматином и внешними белками KT. Обратите внимание, что CENP-T и комплекс Mis12 являются конкурирующими партнерами по связыванию для комплекса Ndc80 (показано красным прямоугольником) (Bock et al ., 2012; Schleiffer et al ., 2012). Комплекс Ndc80 и N-концевые основные остатки Knl1 обладают активностью связывания микротрубочек и, таким образом, действуют как интерфейсы для взаимодействия кинетохора-микротрубочка. Считается, что комплекс Dam1 как у почкующихся дрожжей, так и у делящихся дрожжей поддерживает эти взаимодействия. У человека комплекс Ska может быть функциональным гомологом комплекса Dam1.

Белки внутренней кинетохоры

Cse4 / Cnp1 / CENP-A

Центрер-специфический вариант гистона h4 Cse4 / Cnp1 / CENP-A, как полагают, является ориентиром для сборки кинетохор.Фактически, CENP-A необходим для локализации почти всех кинетохорных белков. Недавний отчет показал, что если CENP-A или шаперон CENP-A HJURP, который считается гомологом Scm3, искусственно привязан к нецентромерным областям через систему LacO — LacI , сборка кинетохор индуцируется на этом noncentromere локус в культивируемых клетках млекопитающих и Drosophila (Barnhart et al ., 2011; Mendiburo et al ., 2011).Кроме того, в экстрактах яиц Xenopus кинетохорные белки собираются на CENP-A-содержащих полинуклеосомах, но не на h4-содержащих полинуклеосомах in vitro (Guse et al ., 2011). Эти результаты также предполагают, что CENP-A действует как эпигенетический маркер сборки кинетохор.

Cnn1 / Cnp20 / CENP-T

CENP-T был первоначально идентифицирован с помощью MS-анализа в полинуклеосомах, содержащих CENP-A (Foltz et al. ., 2006).CENP-T обладает гистоновым доменом и образует комплекс с CENP-S, X и W (Amano et al. ., 2009; Nishino et al. ., 2012). Предполагается, что этот комплекс образует нуклеосомоподобную структуру для взаимодействия с ДНК (Nishino et al. ., 2012; Yang et al. ., 2012). Предполагается, что образование тетрамера CENP-T, W, S и X необходимо для установления центромерного хроматина с образованием интактной кинетохоры (Gascoigne et al ., 2011; Nishino et al ., 2012).

CENP-T млекопитающих, как было показано, взаимодействует напрямую с комплексом Ndc80, состоящим из Ndc80, Nuf2, Spc24 и Spc25, через его удлиненный N-конец и необходим для связывания кинетохор комплекса Ndc80 (Nishino et al ., 2013. ). Cnn1, недавно описанный у почкующихся дрожжей CENP-T, также напрямую взаимодействует с комплексом Ndc80 (Bock et al. ., 2012; Schleiffer et al. ., 2012). Искусственное связывание Cnn1 позволяет сегрегацию минихромосом, лишенных центромер (Schleiffer et al ., 2012). Этот результат указывает на то, что Cnn1 / CENP-T рекрутирует комплекс Ndc80, который играет центральную роль в формировании сайтов прикрепления микротрубочек. Cnn1 ингибирует взаимодействие между сетью KMN (комплекс KNL1 / Mis12 / комплекс Ndc80) (см. Ниже) путем конкурентного связывания с комплексом Ndc80, особенно во время анафазы (Bock et al ., 2012; Schleiffer et al ., 2012. ).

Mif2 / Cnp3 / CENP-C

Внутренний белок кинетохоры Mif2 / Cnp3 / CENP-C служит структурным центром для сборки кинетохор (Przewloka et al ., 2011; Screpanti et al ., 2011). Как у почкующихся, так и у делящихся дрожжей локализация CENP-C зависит от CENP-A (Westermann et al. ., 2003; Tanaka et al. ., 2009). У почкующихся дрожжей комплекс CBF3 также необходим для локализации кинетохор CENP-C (Meluh & Koshland, 1997), а затем Mif2 / CENP-C взаимодействует с Cse4 / CENP-A (Pinsky et al ., 2003). . Как у почкующихся, так и у делящихся дрожжей Mif2 / Cnp3 / CENP-C рекрутирует Iml3 / Fta1 / CENP-L на кинетохоры посредством прямого взаимодействия (Tanaka et al ., 2009; Хиншоу и Харрисон, 2013 г.). Сверхэкспрессия Fta1 в значительной степени подавляет дефекты сегрегации хромосом в клетках cnp3∆ , подтверждая, что основная функция Cnp3 состоит в рекрутировании Fta1 на кинетохоры, которые играют центральную роль в прикреплении микротрубочек (Tanaka et al ., 2009). Cnp3 делящихся дрожжей выполняет дополнительную роль в рекрутировании комплекса Pcs1-Mde4 и Moa1 на кинетохоры (Tanaka et al ., 2009) (см. Также рис. 6). Комплекс Pcs1-Mde4 рекрутирует комплексы конденсина в центральной области ядра центромер (Tada et al ., 2011). Этот конденсиновый комплекс играет ключевую роль в предотвращении ошибочного прикрепления кинетохор, такого как прикрепление меротелии, возможно, за счет зажима сайтов прикрепления микротрубочек. Moa1 — это специфичный для мейоза кинетохорный белок, который играет важную роль в регуляции редукционной сегрегации в мейозе I (см. Ниже).

Белки внешней кинетохоры

Ndc80 комплекс

Комплекс Ndc80, который, как было показано, способствует прикреплению несущих нагрузку микротрубочек (Powers et al ., 2009), состоит из димеров Ndc80 / Hec1-Nuf2 и Spc24-Spc25. И Ndc80-Nuf2, и Spc24-Spc25 имеют шаровидную головку и длинный домен спиральной спирали (Wigge & Kilmartin, 2001; Bharadwaj et al ., 2004; McCleland et al ., 2004) и вместе образуют тупой Тетрамер в форме колокольчика через их домены coiled-coil (Wei et al ., 2005). Глобулярные головки Ndc80 и Nuf2 содержат пару тесно взаимодействующих доменов гомологии кальпонина (CH) (Wei et al ., 2007; Alushin et al. ., 2010), которые могут представлять поверхность связывания микротрубочек. Помимо домена CH, положительно заряженная область в N-концевом хвосте Ndc80 также важна для связывания микротрубочек (Guimaraes et al. ., 2008; Miller et al. ., 2008). В соответствии с этим, мутации в домене CH или делеция положительно заряженной области в N-концевом хвосте нарушают активность связывания микротрубочек комплекса Ndc80 in vitro (Cheeseman et al ., 2006; Ciferri и др. ., 2008).

Взаимодействие комплекса Ndc80 с микротрубочками, по-видимому, регулируется посредством фосфорилирования N-концевого хвоста Ndc80 с помощью консервативной киназы Ipl1 / Ark1 / Aurora B (see below). Aurora B фосфорилирует Ndc80 для отделения микротрубочек от кинетохор, что важно для коррекции ошибочного прикрепления (Cheeseman et al ., 2006; DeLuca et al ., 2006; Akiyoshi et al ., 2009). Сайты фосфорилирования Aurora B располагаются в N-конце Ndc80, и их фосфорилирование вызывает отслоение микротрубочек, возможно, за счет изменения электрических свойств положительно заряженной области.Структурный анализ показывает, что N-концевой хвост Ndc80 содержит уникальную короткую петлю, состоящую из c . 100 аминокислот, окруженных спиральными спиралями (Ciferri et al. ., 2008; Wang et al. ., 2008). Эта область внутренней петли Ndc80 в N-концевом хвосте также способствует прикреплению кинетохоры к микротрубочкам, рекрутируя регуляторы прикрепления к кинетохоре, такие как комплекс Dam1 у почкующихся дрожжей, сверхэкспрессируемые опухоли гены у делящихся дрожжей и Ska1 или Cdt1 в человек (Hsu & Toda, 2011; Maure et al ., 2011; Варма и др. ., 2012; Чжан и др. , 2012; Tang et al ., 2013).

Глобулярный домен димера Spc24-Spc25 соединяет комплекс Ndc80 с внутренним кинетохорным комплексом посредством прямого взаимодействия с CENP-T или комплексом Mis12 (Petrovic et al ., 2010; Gascoigne et al ., 2011; Мальвецци и др. ., 2013; Нишино и др. ., 2013).

Комплекс Mis12

Комплекс Mis12 содержит четыре субъединицы, включая Mtw1 / Mis12, Dsn1 / Mis13, Nsl1 / Mis14 и Nnf1.У почкующихся дрожжей Cse4 и Ndc10 играют роль в рекрутировании кинетохор комплекса Mis12 (Pinsky et al. ., 2003). У делящихся дрожжей, но не у почкующихся дрожжей, Spc105 / Spc7 / KNL1 необходим для локализации кинетохор Mis12 (Kerres et al ., 2007). Хотя точная функция комплекса Mis12 полностью не изучена, он действует как платформа для образования сетевого комплекса KMN (Cheeseman et al ., 2006) и связывает другие компоненты внешней кинетохоры с внутренней кинетохорой посредством прямого связывание с CENP-C (Screpanti et al ., 2011). Наряду с KNL1, Nsl1 взаимодействует с комплексом Spc24-Spc25 в клетках млекопитающих (Petrovic et al ., 2010), тогда как Dsn1 почкующихся дрожжей иммунопреципитирует с Mif2 и Cse4 (Pinsky et al ., 2003). Dsn1 выполняет вспомогательную роль в прикреплении кинетохор к микротрубочкам посредством фосфорилирования Dsn1 с помощью Aurora B (Welburn et al ., 2010).

Spc105 / Spc7 / KNL1

Spc105 / Spc7 / KNL1 имеет консервативный домен связывания микротрубочек на своем N-конце, связывающая способность которого регулируется его фосфорилированием с помощью Aurora B (Cheeseman et al ., 2006; Welburn и др. ., 2010). KNL1 также имеет сайт связывания для протеинфосфатазы PP1 на своем N-конце (Liu et al. ., 2010). PP1 требует KNL1 для его локализации в кинетохорах. В клетках человека PP1 противодействует Aurora B-зависимому фосфорилированию некоторых кинетохорных белков, таких как Ndc80, что приводит к стабилизации прикрепления кинетохор к микротрубочкам (Liu et al ., 2010). Т.о., KNL1 вносит вклад в регуляцию прикрепления кинетохор к микротрубочкам путем рекрутирования PP1 на кинетохоры.Более того, у дрожжей и Caenorhabditis elegans PP1, расположенный в кинетохорах, также играет роль в подавлении контрольной точки веретена путем дефосфорилирования компонентов контрольной точки сборки веретена (SAC) (Meadows et al ., 2011; Rosenberg et al ., 2011; Espeut et al ., 2012). SAC является защитной системой, предотвращающей разделение сестринских хроматид до тех пор, пока каждая кинетохора не будет должным образом прикреплена к веретену, исходящему от обоих полюсов, чтобы создать напряжение между сестринскими кинетохорами.Помимо рекрутирования PP1, KNL1 также играет ключевую роль в SAC, рекрутируя Bub1 и Mad3 / BubR1 (см. Раздел «Кинетохора как платформа для активации SAC»).

Комплекс Dam1 / DASH

Комплекс Dam1 состоит из 10 субъединиц, все из которых необходимы для роста клеток почкующихся дрожжей (Cheeseman et al. ., 2001; Janke et al. ., 2002; Li et al. ., 2005). Электронно-микроскопические исследования показали, что комплекс Dam1 образует кольцевую структуру вокруг микротрубочек (Westermann et al ., 2005). Считается, что основная функция комплекса Dam1 связана с перемещением хромосом с деполимеризацией микротрубочек. Бусинки, покрытые комплексом Dam1, следуют за растущими или сокращающимися концами микротрубочек in vitro (Asbury et al ., 2006). Важно, что искусственного связывания комплекса Dam1 с ДНК достаточно для разделения ДНК у почкующихся дрожжей (Kiermaier et al ., 2009; Lacefield et al ., 2009). Локализация кинетохор комплекса Dam1 зависит от его прямого связывания с внутренней петлей Ndc80 (Maure et al ., 2011), что согласуется с мнением, что комплекс Dam1 связывает движение груза с деполимеризующимися микротрубочками.

В отличие от почкующихся дрожжей, гомолог комплекса Dam1 у делящихся дрожжей (комплекс DASH) не важен для жизнеспособности (Sanchez-Perez et al ., 2005). Это различие может быть связано с количеством сайтов прикрепления микротрубочек на кинетохору (Burrack et al. ., 2011). Хотя прямой гомолог комплекса Dam1 не был идентифицирован у высших эукариот, предполагается, что комплекс Ska является функциональным гомологом комплекса Dam1 у людей (Welburn et al ., 2009; Джеяпракаш и др. ., 2012).

Присоединение кинетохор к микротрубочкам и ориентация кинетохор

Присоединение микротрубочек к кинетохорам необходимо для выравнивания и сегрегации хромосом. Решающее различие между почкующимися дрожжами и делящимися дрожжами в прикреплении кинетохор к микротрубочкам заключается в количестве микротрубочек, прикрепляющихся к одной кинетохоре. Электронно-микроскопический анализ показал, что одна кинетохора прикреплена одной микротрубочкой у почкующихся дрожжей (Peterson & Ris, 1976; King et al ., 1982), тогда как одна кинетохора прикреплена несколькими микротрубочками у делящихся дрожжей (Ding et al ., 1993), как и в случае высших эукариот (Rieder, 1982; McEwen et al ., 1997).

Точная сегрегация сестринских хроматид достигается с помощью микротрубочек, захватывающих сестринские кинетохоры с противоположных полюсов веретена, процесс, называемый амфитарным прикреплением (сестринские хроматиды двуориентированы). Однако во время ранних стадий выравнивания хромосом микротрубочки из одного полюса веретена временно прикрепляются к одной или обеим сестринским кинетохорам.Эти способы привязанности называются монотелической или синтетической привязкой соответственно. В обоих случаях к одному полюсу прикрепляются сестринские хроматиды. Кроме того, у делящихся дрожжей другой способ прикрепления, известный как merotelic прикрепление, происходит во время выравнивания, при котором одна сестринская кинетохора одновременно прикрепляется с помощью микротрубочек, исходящих из обоих полюсов (Fig. 3). В следующих разделах мы рассмотрим текущее понимание того, как би-ориентация сестринских кинетохор устанавливается посредством коррекции ошибочных прикреплений.

Рисунок 3

Типы прикрепления кинетохоры к микротрубочкам. В митозе (или мейозе II) сестринские кинетохоры разделены и ориентированы в конфигурации спина к спине. В результате сестринские кинетохоры захватываются микротрубочками, исходящими из противоположных полюсов, и это приводит к амфителическому прикреплению: хромосомы становятся двуориентированными. Однако моноориентация может происходить, если одна или обе сестринские кинетохоры захватываются микротрубочками, исходящими из одного полюса, что приводит к монотелическому или синтелическому прикреплению, соответственно.Если кинетохора связана микротрубочками с обоих полюсов (меротелическое прикрепление), хромосомы будут би-ориентированными, но это может привести к неправильной сегрегации и анеуплоидии. Подобные ошибочные присоединения в основном исправляются киназой Aurora B.

Рисунок 3

Типы прикрепления кинетохор к микротрубочкам. В митозе (или мейозе II) сестринские кинетохоры разделены и ориентированы в конфигурации спина к спине. В результате сестринские кинетохоры захватываются микротрубочками, исходящими из противоположных полюсов, и это приводит к амфителическому прикреплению: хромосомы становятся двуориентированными.Однако моноориентация может происходить, если одна или обе сестринские кинетохоры захватываются микротрубочками, исходящими из одного полюса, что приводит к монотелическому или синтелическому прикреплению, соответственно. Если кинетохора связана микротрубочками с обоих полюсов (меротелическое прикрепление), хромосомы будут би-ориентированными, но это может привести к неправильной сегрегации и анеуплоидии. Подобные ошибочные присоединения в основном исправляются киназой Aurora B.

Коррекция ошибочного прикрепления кинетохоры к микротрубочкам

Во время митоза нежелательные прикрепления, такие как синтетические или меротелические прикрепления, обычно корректируются в амфителиальные прикрепления с наступлением анафазы.Киназа Aurora B играет центральную роль в этом механизме коррекции. Гомолог Aurora B дрожжей, Ipl1, был идентифицирован при скрининге мутантов, демонстрирующих фенотип увеличения плоидности ( ipl1 ) (Chan & Botstein, 1993). Впоследствии было показано, что Ipl1 способствует обороту прикрепления кинетохор к микротрубочкам, пока сестринские кинетохоры не установят амфителическое прикрепление (би-ориентацию) (Tanaka et al ., 2002). Ipl1 выполняет эту функцию путем фосфорилирования субстратов, которые играют роли в прикреплении кинетохор и микротрубочек, включая Ndc80, Knl1 и Dam1, все из которых важны для прикрепления кинетохор к микротрубочкам и точной сегрегации хромосом (Cheeseman et al ., 2002; ДеЛука, и др., , 2006; Welburn и др. ., 2010).

Современная модель, объясняющая, как Aurora B распознает ошибочные прикрепления, предполагает, что этот процесс опосредуется напряжением между сестринскими кинетохорами, которое генерируется за счет сцепления между сестринскими хроматидами, противодействующими силам притяжения микротрубочек с противоположных полюсов (Tanaka, 2010). Aurora B локализуется между сестринскими кинетохорами в сайтах, соответствующих перицентромерной области гетерохроматина у делящихся дрожжей и внутренней центромере в клетках млекопитающих.Aurora B локализуется в этой области как компонент хромосомного комплекса-пассажира (CPC), который включает Ipl1 / Ark1 / Aurora B, Bir1 / Survivin, Sli15 / Pic1 / INCENP и Nbl1 / Borealin (Ruchaud et al ., 2007). , где он генерирует градиент фосфорилирования с центром во внутренних центромерах (Wang et al ., 2011). В неправильных прикреплениях, где напряжение между сестринскими кинетохорами недостаточно, ошибочные места прикрепления становятся ближе к внутренним центромерам. Следовательно, субстраты Aurora B в сайтах прикрепления кинетохор к микротрубочкам фосфорилируются, что приводит к дестабилизации прикрепления кинетохор к микротрубочкам (рис.4; Лю и др. ., 2009). Как только амфителическое прикрепление установлено, расстояние между Aurora B и его субстратами увеличивается из-за тянущих сил микротрубочек. Субстраты кинетохор дефосфорилируются фосфатазой PP1, которая локализуется на кинетохорах за счет связывания с Knl1, что приводит к дальнейшей стабилизации прикрепления (Liu et al ., 2010). Фосфатаза PP2A, которая рекрутируется в кинетохоры через BubR1, также стабилизирует прикрепление путем дефосфорилирования субстратов кинетохор (рис.4; Фоли и др. , 2011; Suijkerbuijk et al ., 2012). Однако недавнее исследование показало, что у зарождающегося мутанта дрожжей sl15 / INCENP, который имеет дефект во взаимодействии с Bir1 / Survivin, Ipl1 / Aurora B не может локализоваться на центромерах, но дефект роста отсутствует (Campbell & Desai, 2013). У этого мутанта slo15 CPC обнаруживает преждевременную локализацию на веретене, ведущую к активации Ipl1 на веретене, а не на центромере, указывая тем самым, что локализация центромеры CPC может не быть существенной для исправления ошибок (Campbell & Desai, 2013).Т.о., молекулярные детали механизма сбора ошибок, зависимого от Aurora B, все еще обсуждаются, особенно у почкующихся дрожжей.

Рисунок 4

Зависимая от напряжения коррекция неправильного прикрепления с помощью Aurora B. Аврора B локализуется на внутренних центромерах в митотических хромосомах, где она производит градиент фосфорилирования (темные и светло-серые области), таким образом фосфорилируя кинетохорные белки, включая сеть KMN. Во время прометафазы кинетохоры захватываются микротрубочками, часто ошибочным образом (монотелическое прикрепление, синтетическое прикрепление или меротелическое прикрепление; рис.3). В этих случаях места прикрепления находятся в непосредственной близости от активности Aurora B, пик которой приходится на внутренние центромеры, поэтому прикрепление становится нестабильным. Однако, как только две кинетохоры захватываются веретенами, исходящими из противоположных полюсов, напряжение, создаваемое через центромеры, перемещает места прикрепления от Aurora B. Одновременно это движение способствует ассоциации протеинфосфатазы 1 (PP1) с компонентом KMN KNL1. . Напряжение также действует для перераспределения PP2A от внутренней центромеры к стороне кинетохор.Таким образом, увеличенное расстояние от Aurora B и повышение активности фосфатазы (пурпурная область) могут действовать кумулятивно, дефосфорилируя сеть KMN, тем самым стабилизируя только правильное прикрепление.

Рисунок 4

Зависимая от напряжения коррекция неправильного прикрепления с помощью Aurora B. Аврора B локализуется на внутренних центромерах в митотических хромосомах, где она производит градиент фосфорилирования (темные и светло-серые области), таким образом фосфорилируя кинетохорные белки, включая сеть KMN.Во время прометафазы кинетохоры захватываются микротрубочками, часто ошибочным образом (монотелическое прикрепление, синтетическое прикрепление или меротелическое прикрепление; Рис. 3). В этих случаях места прикрепления находятся в непосредственной близости от активности Aurora B, пик которой приходится на внутренние центромеры, поэтому прикрепление становится нестабильным. Однако, как только две кинетохоры захватываются веретенами, исходящими из противоположных полюсов, напряжение, создаваемое через центромеры, перемещает места прикрепления от Aurora B.Одновременно это движение способствует ассоциации протеинфосфатазы 1 (PP1) с компонентом KMN KNL1. Напряжение также действует для перераспределения PP2A от внутренней центромеры к стороне кинетохор. Таким образом, увеличенное расстояние от Aurora B и повышение активности фосфатазы (пурпурная область) могут действовать кумулятивно, дефосфорилируя сеть KMN, тем самым стабилизируя только правильное прикрепление.

Молекулярные механизмы, лежащие в основе центромерной локализации CPC

За исключением почкующихся дрожжей, локализация CPC на внутренней центромере, i.е. между сестринскими кинетохорами, важен для правильной коррекции ошибочного прикрепления кинетохор к микротрубочкам. Молекулярные детали, лежащие в основе центромерной локализации CPC, хорошо охарактеризованы у делящихся дрожжей, а основные механизмы законсервированы в клетках позвоночных.

Hrk1 / Haspin представляет собой эволюционно консервативную киназу, которая фосфорилирует гистон h4 по треонину 3 во время митоза (рис. 5). Фосфорилированный h4-T3 взаимодействует напрямую с Bir1 / Survivin, одной из субъединиц CPC, через консервативный домен BIR (Kelly et al ., 2010; Ван и др. , 2010; Ямагиши и др. , 2010; Джеяпракаш и др. , 2011). Hrk1 / Haspin локализуется на хроматине за счет непосредственного взаимодействия с cohesin-ассоциированным белком Pds5 (Fig. 5; Yamagishi et al. ., 2010) и, таким образом, накапливается вдоль хроматина, где существуют комплексы cohesin. Также было показано, что Hrk1 / Haspin фосфорилирует h4 в гетерохроматических регионах, включая центромеры у делящихся дрожжей, и что это фосфорилирование зависит от накопления cohesin в гетерохроматических регионах (Yamagishi et al ., 2010). Причина, по которой Hrk1 / Haspin фосфорилирует h4 в гетерохроматических регионах, но не в др. Областях, обогащенных cohesin, в настоящее время неизвестна, но сам гетерохроматин может вносить вклад в активацию Hrk / Haspin.

Рисунок 5

Регуляция внутренней локализации центромеры Aurora B. Bub1 фосфорилирует гистон h3A вокруг центромер, где белки семейства шугошинов (SGO), как известно, связываются через свои мотивы SGO. Делящиеся дрожжи и человеческий Sgo1 связываются через свои мотивы P-V-I с Swi6 / HP1 (гетерохроматиновый белок 1), и локализация Sgo1 на перицентромерном гетерохроматине частично зависит от этого взаимодействия.В дополнение к Bub1, Hrk1 / Haspin kinase, которая локализуется в хроматине за счет связывания с cohesin, также, как было показано, имеет решающее значение для локализации Aurora B (CPC) за счет фосфорилирования гистона h4 по Thr3 только в M-фазе. Фосфорилированный h4-T3 взаимодействует непосредственно с консервативным BIR доменом Survivin / Bir1, субъединицы CPC, и это взаимодействие важно для нацеливания Aurora B на центромерные нуклеосомы. Кроме того, фосфорилирование с помощью CDK в N-концевой области Bir1 у делящихся дрожжей или бореалина у человека также может способствовать его связыванию с областью спиральной спирали белков семейства шугошин.В клетках человека CDK также фосфорилирует Sgo1, чтобы облегчить его связывание с cohesin (Liu et al. ., 2013a, b). Взаимодействие между человеческим Sgo1 и cohesin, как полагают, необходимо для связывания Sgo1 с хроматином (Liu et al. ., 2013a, b). PP2A, рекрутируемый белками Shugoshin на внутренней центромере, отменяет состояние фосфорилирования cohesins, приводя к защите от расщепления сепаразой в мейозе и от удаления с помощью пути профазы при митозе позвоночных (Sakuno & Watanabe, 2009).

Рисунок 5

Регуляция внутренней локализации центромеры Aurora B. Bub1 фосфорилирует гистон h3A вокруг центромер, где белки семейства шугошинов (SGO), как известно, связываются через свои мотивы SGO. Делящиеся дрожжи и человеческий Sgo1 связываются через свои мотивы P-V-I с Swi6 / HP1 (гетерохроматиновый белок 1), и локализация Sgo1 на перицентромерном гетерохроматине частично зависит от этого взаимодействия. В дополнение к Bub1, Hrk1 / Haspin kinase, которая локализуется в хроматине за счет связывания с cohesin, также, как было показано, имеет решающее значение для локализации Aurora B (CPC) за счет фосфорилирования гистона h4 по Thr3 только в M-фазе.Фосфорилированный h4-T3 взаимодействует непосредственно с консервативным BIR доменом Survivin / Bir1, субъединицы CPC, и это взаимодействие важно для нацеливания Aurora B на центромерные нуклеосомы. Кроме того, фосфорилирование с помощью CDK в N-концевой области Bir1 у делящихся дрожжей или бореалина у человека также может способствовать его связыванию с областью спиральной спирали белков семейства шугошин. В клетках человека CDK также фосфорилирует Sgo1, облегчая его связывание с когезином (Liu et al. ., 2013а, б). Взаимодействие между человеческим Sgo1 и cohesin, как полагают, необходимо для связывания Sgo1 с хроматином (Liu et al. ., 2013a, b). PP2A, рекрутируемый белками Shugoshin на внутренней центромере, отменяет состояние фосфорилирования cohesins, приводя к защите от расщепления сепаразой в мейозе и от удаления с помощью пути профазы при митозе позвоночных (Sakuno & Watanabe, 2009).

Bub1 представляет собой консервативную многофункциональную киназу, которая локализуется на кинетохорах в митозе и играет важную роль в сборке компонентов SAC на кинетохорах.Другая функция Bub1 — это рекрутирование центромер shugoshin, белка, необходимого для сцепления сестринских хроматид и локализации CPC на центромерах. Bub1 фосфорилирует гистон h3A по серину 121 (треонин 120 у человека) у делящихся дрожжей (рис. 5; Kawashima et al ., 2010). Белки Shugoshin связываются с нуклеосомами, содержащими фосфорилированный h3A-S121 через его консервативный C-концевой мотив SGO, и это взаимодействие необходимо для центромерной локализации белков shugoshin.Делящиеся дрожжи shugoshin Sgo2 взаимодействуют непосредственно с CPC субъединицей Bir1 и рекрутируют ее на центромеры (Tsukahara et al ., 2010). Поскольку это взаимодействие зависит от фосфорилирования Bir1 с помощью CDK1, локализация CPC на центромерах ограничена M-фазой клеточного цикла (Fig. 5).

Генетический анализ делящихся дрожжей показал, что эти два пути, обеспечиваемые с помощью Bub1 и Hrk1 / Haspin, являются избыточными в локализации CPC на центромерах (Yamagishi et al ., 2010).Если оба пути нарушены, локализация CPC снижается на центромерах, что приводит к серьезным дефектам сегрегации хромосом, которые включают отставание хромосом, признак меротелического прикрепления, указывающий на то, что исправление ошибочных прикреплений в этих клетках является дефектным. Эти два пути хорошо сохраняются в клетках позвоночных; однако механизм сохранения у почкующихся дрожжей остается неясным.

Ориентация кинетохор в мейозе

В митозе сестринские кинетохоры двуориентированы, вызывая сегрегацию сестринских хроматид на противоположных полюсах, процесс, называемый эквациональной сегрегацией.В этом процессе весь cohesin, связанный с хроматином, расщепляется сепаразой в начале анафазы (Uhlmann, 2009; Nasmyth, 2011).

В мейозе за одним раундом репликации ДНК следуют два раунда последовательных сегрегаций хромосом, называемых мейозом I и мейозом II. В мейозе I гомологи (пара сестринских хроматид), соединенные хиазмами, сегрегированы на противоположных полюсах, в то время как сестринские хроматиды сегрегированы на одном полюсе. Этот тип сегрегации называется редукционной сегрегацией.Для достижения этого сестринские кинетохоры должны всегда захватываться микротрубочками, исходящими из одних и тех же полюсов, что называется моноориентацией сестринских кинетохор. Анафаза в мейозе I запускается расщеплением когезина, как в митозе. Однако в анафазе I когезин вдоль плеча хромосомы, но не в перицентромерных регионах, расщепляется сепаразой (Buonomo et al. ., 2000; Kitajima et al. ., 2003). Мейотический шугошин Sgo1 (Sgo2 у позвоночных) защищает когезин от расщепления, рекрутируя протеинфосфатазу PP2A в перицентромерные области (рис.5; Kitajima et al ., 2006; Ридель и др. , 2006; Ли и др. ., 2008). Cohesin, сохраняющийся в перицентромерной области, важен для установления би-ориентации сестринских кинетохор в мейозе II. Во время следующей анафазы II, поскольку белок Sgo1 разрушается после анафазы I (Kitajima et al ., 2004), сестринские хроматиды могут разделяться на противоположные полюса, как они это делают в митозе, при расщеплении сохраняющегося cohesin одновременно с реактивацией сепаразы.

В следующих разделах мы рассмотрим механизмы, которые регулируют моноориентацию кинетохор в мейозе I, как выяснено в основном у почкующихся и делящихся дрожжей.

Регуляция моноориентации сестринских кинетохор у почкующихся дрожжей

У почкующихся дрожжей рекрутирование комплекса монополина на кинетохоры требуется для моно-ориентации сестринских кинетохор в мейозе I. Монополин был впервые идентифицирован в ходе функционального геномного поиска как фактор, необходимый для правильной сегрегации хромосом в мейозе (Toth et al. ., 2000). Монополиновый комплекс состоит из Mam1, Csm1 и Lrs4 и локализуется в кинетохорах во время мейоза I (Rabitsch et al ., 2003) за счет прямого связывания Csm1 с кинетохорным белком Dsn1 (Sarkar et al ., 2013). . Кроме того, у почкующихся дрожжей CK1 δ / ε Hrr25, как было установлено, связывается с Mam1 (Petronczki et al ., 2006). Hrr25 рекрутируется на кинетохоры с помощью Mam1, и его киназная активность играет важную роль в моноориентации сестринских кинетохор (рис.6; Petronczki et al ., 2006). Субстрат (ы) Hrr25, необходимый для моноориентации сестринских кинетохор, остается неуловимым; однако было обнаружено, что поло-подобные киназы Cdc5 и Cdc7 киназы необходимы для правильной локализации кинетохор монополина и, следовательно, необходимы для моноориентации в мейозе I (рис. 6b; Katis et al ., 2004. ; Ли и др. ., 2004; Матос и др. ., 2008).

Рисунок 6

Четкая регуляция моноориентации кинетохор в мейозе I у дрожжей.(a) У почкующихся дрожжей моноориентация достигается за счет действия монополинового комплекса, который состоит из Csm1, Lrs4, Mam1 и Hrr25 (см. также b). Считается, что этот комплекс действует как молекулярный зажим сестринских кинетохор. Напротив, сцепление в ядре центромеры с помощью комплекса cohesin Rec8 является необходимым для моноориентации у делящихся дрожжей. Кроме того, Moa1, специфичный для мейоза кинетохорный белок, также играет существенную роль в слипчивости центральных центромер посредством Rec8, хотя механизм, с помощью которого Moa1 регулирует Rec8, неизвестен.(b) Moa1 может локализоваться в области кинетохор посредством связывания с CENP-C, тогда как комплекс Monopolin может локализоваться в кинетохорах посредством связывания с Csm1 и Dsn1 (субъединица комплекса Mis12). Гомологи Csm1 и Lrs4 у делящихся дрожжей (Pcs1 и Mde4, соответственно) необязательны для моноориентации сестринских кинетохор в мейозе I; вместо этого они необходимы для накопления конденсина в области кинетохор во время митоза. Обратите внимание, что никаких очевидных гомологов субъединиц монополинового комплекса (кроме Hrr25, консервативного гомолога казеинкиназы I) и Moa1 у высших эукариот пока не обнаружено.

Рисунок 6

Четкая регуляция моноориентации кинетохор в мейозе I у дрожжей. (a) У почкующихся дрожжей моноориентация достигается за счет действия монополинового комплекса, который состоит из Csm1, Lrs4, Mam1 и Hrr25 (см. также b). Считается, что этот комплекс действует как молекулярный зажим сестринских кинетохор. Напротив, сцепление в ядре центромеры с помощью комплекса cohesin Rec8 является необходимым для моноориентации у делящихся дрожжей. Кроме того, Moa1, специфичный для мейоза кинетохорный белок, также играет существенную роль в слипчивости центральных центромер посредством Rec8, хотя механизм, с помощью которого Moa1 регулирует Rec8, неизвестен.(b) Moa1 может локализоваться в области кинетохор посредством связывания с CENP-C, тогда как комплекс Monopolin может локализоваться в кинетохорах посредством связывания с Csm1 и Dsn1 (субъединица комплекса Mis12). Гомологи Csm1 и Lrs4 у делящихся дрожжей (Pcs1 и Mde4, соответственно) необязательны для моноориентации сестринских кинетохор в мейозе I; вместо этого они необходимы для накопления конденсина в области кинетохор во время митоза. Обратите внимание, что никаких очевидных гомологов субъединиц монополинового комплекса (кроме Hrr25, консервативного гомолога казеинкиназы I) и Moa1 у высших эукариот пока не обнаружено.

Недавнее структурное исследование показало, что монополин имеет V-образную форму, включающую Csm1 и Lrs4 (Corbett et al ., 2010), и что каждое плечо V-образной формы образовано спиральной спиралью. димер Csm1. Было высказано предположение, что Mam1 и Hrr25 связываются с каждым концом этой «V-образной формы» (Corbett & Harrison, 2012). Из этих исследований предполагается, что V-образный комплекс монополина зажимает две сестринские кинетохоры, тем самым способствуя их моноориентации. Однако у делящихся дрожжей гомолог монополина (включающий Psc1 и Mde4), по-видимому, не требуется для моноориентации кинетохор в мейозе I (рис.6b; Gregan и др. ., 2007). Скорее, это необходимо для предотвращения меротельного прикрепления путем рекрутирования конденсинового комплекса (Tada et al. ., 2011). Таким образом, модель V-образного сгустка остается дискуссионной.

Регуляция моноориентации сестринских кинетохор у делящихся дрожжей

У делящихся дрожжей одним из наиболее важных регуляторов моноориентации кинетохор является специфичный для мейоза когезин Rec8. Комплекс cohesin состоит из двух субъединиц Smc, Smc1 и Smc3, субъединицы клейзина, Scc1, и дополнительной субъединицы, Scc3 (Nasmyth & Haering, 2009).В митозе субъединица клейзина когезина — это Rad21, которая заменяется другой субъединицей клейзина, Rec8, в мейозе. В нуль-мутанте rec8- cohesin Rad21 используется вместо cohesin Rec8, способствуя эквациональной, а не редукционной сегрегации во время анафазы I (Watanabe & Nurse, 1999; Yokobayashi et al. ., 2003). Это открытие указывает на то, что когезин Rec8 важен для моноориентации кинетохор. Важное различие между когезинами Rad21 и Rec8 заключается в их паттернах локализации вокруг центромер.В митозе когезин Rad21 накапливается специфически в перицентромерном гетерохроматине, как описано выше. Напротив, Rec8 накапливается не только в перицентромерном гетерохроматине, но также и в центральной области ядра, где собираются кинетохоры (Watanabe et al ., 2001). Соответственно, специфическое удаление Rec8 из центральной центромеры ведет к биориентации кинетохор в мейозе I (Yokobayashi & Watanabe, 2005), указывая на существенную роль Rec8 для моноориентации кинетохор.

Др. Мейоз-специфический фактор, необходимый для моноориентации кинетохор, — это Moa1, который был идентифицирован во время генетического скрининга на фактор, необходимый для редукционной сегрегации в мейозе I (Fig. 6a; Yokobayashi & Watanabe, 2005). Moa1 локализуется на кинетохорах путем связывания непосредственно с Cnp3 / CENP-C (Fig. 6b; Tanaka et al ., 2009). Важно, что сцепление в центральной центромере теряется у мутантов moa1 и rec8 , вызывая дефекты моноориентации сестринских кинетохор.Более того, искусственное связывание в центральной центромере восстанавливает моноориентацию сестринских кинетохор и редукционную сегрегацию у мутантов moa1 и rec8 в мейозе I (Sakuno et al ., 2009). Таким образом, можно сделать вывод, что моноориентация кинетохор устанавливается путем соединения дуплексов ДНК вместе в центральных центромерах (Fig. 6). Как Moa1 регулирует когезию центральной центромеры — важный вопрос для будущих исследований.

Кинетохор как платформа для активации SAC

Помимо обеспечения прикрепления хромосомы к микротрубочкам, кинетохора играет решающую роль в качестве платформы для активации SAC.SAC — это система наблюдения за клеточным циклом, которая задерживает наступление анафазы за счет ингибирования комплекса, способствующего анафазе (APC) (Rudner & Murray, 1996; Musacchio & Salmon, 2007). APC активирует сепаразу путем разложения секурина, ингибитора сепаразы (Cohen-Fix et al ., 1996; Funabiki et al ., 1996). SAC обнаруживает неприсоединенные кинетохоры и активируется за счет накопления на кинетохорах основных компонентов SAC Mps1 / Mph2, Bub1, Bub3, Mad1, Mad2 и Mad3 / BubR1, которые были первоначально идентифицированы во время генетического скрининга у почкующихся дрожжей (Hoyt et al. ., 1991; Ли и Мюррей, 1991; Вайс и Вайни, 1996; Тейлор и др. , 1998; Abrieu и др. ., 2001). Эти белки SAC задерживают наступление анафазы за счет инактивации Cdc20, белка-активатора APC (Hwang et al. ., 1998; Kim et al. ., 1998). Недавние исследования выявили механизмы, лежащие в основе локализации белков SAC на кинетохорах (London et al ., 2012; Shepperd et al ., 2012; Yamagishi et al ., 2012).

Нацеливание белков SAC на кинетохоры

Среди белков SAC киназа Mps1 / Mph2, как было установлено, необходима для рекрутирования почти всех др. Компонентов SAC на кинетохоры (Heinrich et al ., 2012). Mps1 представляет собой широко консервативную протеинкиназу, которая локализуется на неприсоединенных кинетохорах в раннем митозе. Определение важнейшего субстрата Mps1 заняло много времени, но совсем недавно три независимые группы показали, что кинетохорный белок KNL1 / Spc105 / Spc7 является консервативным субстратом Mps1 в почкующихся дрожжах, делящихся дрожжах и клетках человека (рис.7; Лондон, и др., , 2012; Шепперд и др. , 2012; Ямагиши и др. , 2012). Mps1 фосфорилирует KNL1 по множеству сайтов, в основном по консервативным повторам MELT, и это фосфорилирование рекрутирует комплекс Bub1-Bub3 на кинетохоры. Bub1 и Bub3 также являются консервативными белками SAC и образуют плотный комплекс на протяжении всего клеточного цикла. Связанный с кинетохорами Bub1-Bub3 необходим для локализации др. Белков SAC, Mad1 и BubR1 / Mad3. Mad3 взаимодействует с комплексом Bub1 – Bub3 и тем самым локализуется в кинетохорах (рис.7). Напротив, лежащий в основе молекулярный механизм локализации кинетохор Mad1 остается неясным. Связанный с кинетохорами Bub1-Bub3 необходим, но недостаточен для локализации Mad1 на кинетохорах, и эта локализация нуждается в Mps1 (Yamagishi et al ., 2012). Выяснение того, как Mad1 нацелен на кинетохоры, является важным следующим шагом к полному пониманию механизмов активации SAC.

Рисунок 7

Путь Mph2 – Spc7 – Bub1, необходимый для активации SAC.В присутствии неприсоединенных кинетохор в раннем митозе Mph2 / Mps1 локализуется на кинетохорах способом, зависящим от Aurora B, и фосфорилирует Spc7 / Knl1 / Spc105. Это облегчает рекрутирование комплекса Bub1-Bub3-Mad3 / BubRI на кинетохоры. Впоследствии комплекс Bub1 может рекрутировать Mad1 и Mad2, и эти комплексы затем активируют SAC. Mph2 также необходим для локализации кинетохор Mad1 независимо от комплекса Bub1. Белки каркаса Mph2 и Mad1 на несвязанных кинетохорах остаются неизвестными.

Рисунок 7

Путь Mph2 – Spc7 – Bub1, необходимый для активации SAC. В присутствии неприсоединенных кинетохор в раннем митозе Mph2 / Mps1 локализуется на кинетохорах способом, зависящим от Aurora B, и фосфорилирует Spc7 / Knl1 / Spc105. Это облегчает рекрутирование комплекса Bub1-Bub3-Mad3 / BubRI на кинетохоры. Впоследствии комплекс Bub1 может рекрутировать Mad1 и Mad2, и эти комплексы затем активируют SAC. Mph2 также необходим для локализации кинетохор Mad1 независимо от комплекса Bub1.Белки каркаса Mph2 и Mad1 на несвязанных кинетохорах остаются неизвестными.

Хотя рекрутирование Mps1 на неприсоединенные кинетохоры может быть самым вышестоящим событием в активации SAC, неизвестно, как Mps1 обнаруживает неприсоединенные кинетохоры. Недавнее исследование на делящихся дрожжах показало, что киназная активность Aurora B гомолога Ark1 необходима для локализации кинетохор Mph2 и для активации SAC (Fig. 7; Heinrich et al ., 2012). Привлекательной моделью является то, что Aurora B фосфорилирует субстраты в сайтах связывания микротрубочек, чтобы дестабилизировать прикрепление кинетохор к микротрубочкам, и что фосфорилированные субстраты одновременно становятся сайтами стыковки для Mps1.В поддержку этой схемы, домен связывания микротрубочек Ndc80, который фосфорилируется Aurora B, необходим для локализации кинетохор Mps1 в клетках человека (Martin-Lluesma et al ., 2002; Saurin et al . , 2011; Nijenhuis et al ., 2013). Хотя недавнее исследование показало, что известные сайты фосфорилирования на N-конце Ndc80 не вносят вклад в нацеливание на кинетохоры Mps1 (Nijenhuis et al ., 2013), фосфорилирование на других сайтах в Ndc80 или других кинетохорных белках может быть важным для нацеливания Mps1 .

Заключительные замечания

Недавний прогресс в исследованиях кинетохор идентифицировал почти полный список компонентов кинетохор и выявил многие аспекты функции и регуляции кинетохор. Однако остается много безответных вопросов. Как регулируется сборка кинетохор во время репликации ДНК? Как сплоченность центральной центромеры устанавливается специфически в мейозе I? Каким образом SAC различает прикрепленные и неприсоединенные кинетохоры? Распространено мнение, что почкующиеся дрожжи и делящиеся дрожжи внесли совместный вклад в изучение кинетохор.В частности, недавнее исследование почкующихся дрожжей преуспело в очистке кинетохорных частиц, которые содержат все основные кинетохорные белки и сохраняют ключевые функции нативных кинетохор (Akiyoshi et al ., 2010). В настоящее время дрожжи могут оставаться основными модельными организмами, используемыми для ответа на фундаментальные вопросы о кинетохоре.

Список литературы

и др. . (

2001

Mps1 представляет собой кинетохор-ассоциированную киназу, необходимую для контрольной точки митоза позвоночных

Ячейка

106

83

93

& (

2009

Анализ Ipl1-опосредованного фосфорилирования кинетохорного белка Ndc80 в Saccharomyces cerevisiae

Генетика

183

1591

1595

и др. . (

2010

Натяжение напрямую стабилизирует воссозданные прикрепления кинетохор и микротрубочек

Природа

468

576

579

(

1995

Элементы структуры и функции хромосом у делящихся дрожжей

Semin Cell Biol

6

55

64

& (

2010

Кинетохорный комплекс Ndc80 формирует олигомерные массивы вдоль микротрубочек

Природа

467

805

810

& (

2009

Комплекс CENP-S необходим для стабильной сборки внешней кинетохорной структуры

J Cell Biol

186

173

182

& (

2006

Кинетохорный комплекс Dam1 использует динамику микротрубочек для создания силы и движения

P Natl Acad Sci USA

103

9873

9878

& (

2011

HJURP представляет собой фактор сборки хроматина CENP-A, достаточный для образования функциональной кинетохоры de novo

J Cell Biol

194

229

243

& (

2004

Идентификация двух новых компонентов кинетохорного комплекса NDC80 человека

J Biol Chem

279

13076

13085

& (

2008

Вариант гистона CENP-A и спецификация центромеры

Curr Opin Cell Biol

20

91

100

и др. . (

2012

Cnn1 ингибирует взаимодействия между комплексами KMN кинетохоры дрожжей

Nat Cell Biol

14

614

624

& (

2000

Разъединение гомологичных хромосом в мейозе I зависит от протеолитического расщепления мейотического когезина Rec8 сепарином

Ячейка

103

387

398

& (

2011

Потребность в комплексе Dam1 зависит от количества кинетохорных белков и микротрубочек

Curr Biol

21

889

896

& (

2008

Наблюдение за геномом хозяина на наличие ретротранспозонов с помощью белков, полученных из транспозонов

Природа

451

431

436

& (

2013

Восприятие напряжения с помощью киназы Aurora B не зависит от локализации центромеры на основе сурвивина

Природа

497

118

121

& (

1993

Выделение и характеристика мутантов по увеличению хромосом и увеличению плоидности у дрожжей

Генетика

135

677

691

и др. . (

2001

Влияние нового мультипротеинового комплекса Dam1p на функцию внешней кинетохоры

J Cell Biol

155

1137

1145

и др. . (

2002

Фосфорегуляция прикрепления кинетохор к микротрубочкам с помощью киназы Aurora Ipl1p

Ячейка

111

163

172

& (

2006

Консервированная сеть KMN составляет основной сайт связывания микротрубочек кинетохоры

Ячейка

127

983

997

& (

2008

KNL1 и комплекс CENP-H / I / K координированно направляют сборку кинетохор у позвоночных

Mol Biol Cell

19

587

594

& (

1989

Составные мотивы и повторяющаяся синметрия в S. pombe центромер

Ячейка

57

739

751

& (

2012

Ndc10 представляет собой платформу для сборки внутренней кинетохор у почкующихся дрожжей

Нат Структ Мол Биол

19

48

55

и др. .(

2008

Влияние на прикрепление кинетохор к микротрубочкам из структуры сконструированного комплекса Ndc80

Ячейка

133

427

439

& (

1980

Выделение центромеры дрожжей и построение функциональных малых кольцевых хромосом

Nuture

287

504

509

& (

2003

Центромеры и кинетохоры.От эпигенетики к передаче сигналов митотических контрольных точек

Ячейка

112

407

421

& (

1996

Инициирование анафазы в Saccharomyces cerevisiae контролируется APC-зависимой деградацией ингибитора анафазы Pds1p

Genes Dev

10

3081

3093

(

1996

SKP1 почкующихся дрожжей кодирует эволюционно консервативный кинетохорный белок, необходимый для развития клеточного цикла

Ячейка

86

275

285

& (

2012

Молекулярная архитектура дрожжевого монополинового комплекса

Cell Rep

1

583

589

& (

2010

Монополиновый комплекс сшивает компоненты кинетохор, чтобы регулировать прикрепление хромосомы к микротрубочкам

Ячейка

142

556

567

& (

2006

Динамика микротрубочек кинетохор и стабильность прикрепления регулируются Hec1

Ячейка

127

969

982

& (

1993

Трехмерная реконструкция и анализ митотических веретен дрожжей, Schizosaccharomyces pombe

J Cell Biol

120

141

151

& (

2012

Связывание микротрубочек с помощью KNL-1 вносит вклад в молчание контрольных точек веретена на кинетохоре

J Cell Biol

196

469

482

& (

2011

Формирование стабильных связей между кинетохорами и микротрубочками зависит от фосфатазы B56-PP2A

Nat Cell Biol

13

1265

1271

& (

2006

Комплекс, связанный с центромерной нуклеосомой CENP-A человека

Nat Cell Biol

8

458

469

& (

2013

Создание эффективного переключения кинетохоры путем фосфорилирования и дефосфорилирования

Хромосома

122

135

158

& (

1996

Протеолиз Cut2, необходимый для разделения сестринских хроматид у делящихся дрожжей

Природа

381

438

441

& (

2011

Индуцированная эктопическая сборка кинетохор обходит потребность в нуклеосомах CENP-A

Ячейка

145

410

422

и др. . (

2007

Кинетохорные белки Pcs1 и Mde4 и гетерохроматин необходимы для предотвращения меротельной ориентации

Curr Biol

17

1190

1200

& (

2008

Присоединение кинетохор к микротрубочкам основывается на неупорядоченном N-концевом хвостовом домене Hec1

Curr Biol

18

1778

1784

& (

2011

Сборка центромер и кинетохор in vitro на определенных шаблонах хроматина

Природа

477

354

358

& (

1997

Центромерный ДНК-связывающий белок из делящихся дрожжей влияет на сегрегацию хромосом и имеет гомологию с CENP-B

J Cell Biol

136

487

500

& (

2004

Mis16 и Mis18 необходимы для загрузки CENP-A и деацетилирования гистонов на центромерах

Ячейка

118

715

729

& (

2012

Локализация кинетохор Mph2 является критической и вышестоящей в иерархии рекрутирования белка контрольной точки сборки веретена на кинетохоры

J Cell Sci

125

4720

4727

& (

2005

Центромерный хроматин: что делает его уникальным?

Curr Opin Genet Dev

15

177

184

& (

2013

Гетеродимер Iml3-Chl4 связывает центральную центромеру с факторами, необходимыми для точной сегрегации хромосом

Cell Rep

5

29

36

& (

1991

S. cerevisiae гены, необходимые для остановки клеточного цикла в ответ на потерю функции микротрубочек

Ячейка

66

507

517

& (

2011

Внутренняя петля Ndc80 взаимодействует с Dis1 / TOG для обеспечения правильного прикрепления кинетохора к веретену у делящихся дрожжей

Curr Biol

21

214

220

и др. . (

1998

Мыши с нулевым центромерным белком B митотически и мейотически нормальны, но имеют вес нижней части тела и семенников

J Cell Biol

141

309

319

и др. . (

1998

Бутылочные дрожжи Cdc20: мишень для контрольной точки веретена [см. Комментарии]

Наука

279

1041

1044

& (

2001

Функциональная избыточность, различные локализации и взаимодействия между тремя гомологами центромерного белка B

Генетика

157

1191

1203

и др. . (

2008

Целостность гетерохроматина влияет на реорганизацию хромосом после дисфункции центромеры

Наука

321

1088

1091

и др. . (

2006

Комплексный анализ компонентов ICEN (Interphase Centromere Complex), обогащенных CENP-A хроматином клеток человека

Гены Клетки

11

673

684

& (

2002

Четыре новых субъединицы комплекса Dam1-Duo1 обнаруживают новые функции в биориентации сестринских кинетохор

EMBO J

21

181

193

& (

2011

Структурная основа распознавания фосфорилированного гистона h4 субъединицей сурвивина хромосомного пассажирского комплекса

Структура

19

1625

1634

& (

2012

Структурная и функциональная организация комплекса Ska, ключевого компонента интерфейса кинетохора-микротрубочка

Mol Cell

46

274

286

& (

2004

Spo13 облегчает рекрутирование монополинов на кинетохоры и регулирует поддержание центромерной когезии во время дрожжевого мейоза

Curr Biol

14

2183

2196

& (

2010

Фосфорилирование h3A с помощью Bub1 предотвращает хромосомную нестабильность за счет локализации шугошина

Наука

327

172

177

& (

2010

Сурвивин считывает фосфорилированный гистон h4 треонин 3 для активации митотической киназы Aurora B

Наука

330

235

239

& (

2007

Консервативный белок Spc7 необходим для целостности веретена и связывает кинетохорные комплексы у делящихся дрожжей

Mol Biol Cell

18

2441

2454

& (

2009

Искусственной кинетохоры на основе Dam1 достаточно, чтобы способствовать сегрегации хромосом у почкующихся дрожжей

Nat Cell Biol

11

1109

1115

& (

1998

Делящиеся дрожжи Slp1: эффектор Mad2-зависимой контрольной точки веретена

Наука

279

1045

1047

& (

1982

Ультраструктура митотических веретен, выделенных из мутанта дрожжевого цикла клеточного деления, Saccharomyces cerevisiae

евро J Cell Biol

28

98

102

& (

2001

Эволюционная консервация между почкующимися дрожжами и кинетохорами человека

Nat Rev Mol Cell Biol

2

678

687

& (

2003

Расщепление Rec8 сепаразой необходимо для мейотических ядерных делений у делящихся дрожжей

EMBO J

22

5643

5653

& (

2004

Консервативный кинетохорный белок шугошин защищает центромерную когезию во время мейоза

Природа

427

510

517

& (

2006

Шугошин сотрудничает с протеинфосфатазой 2A для защиты когезина

Природа

441

46

52

& (

2009

Рекрутирование комплекса связывания микротрубочек с ДНК направляет сегрегацию хромосом у почкующихся дрожжей

Nat Cell Biol

11

1116

1120

& (

2004

Spo13 поддерживает центромерную когезию и коориентацию кинетохор во время мейоза I

Curr Biol

14

2168

2182

и др. . (

2008

Единый режим центромерной защиты шугошином в ооцитах и ​​соматических клетках млекопитающих

Nat Cell Biol

10

42

52

& (

1991

Контроль митоза с обратной связью у почкующихся дрожжей

Ячейка

66

519

531

& (

2005

Генетический анализ кинетохорного комплекса DASH показывает антагонистические отношения с путем ras / протеинкиназы A и новой субъединицей, необходимой для ассоциации Ask1

Mol Cell Biol

25

767

778

& (

2009

Определение би-ориентации хромосом путем пространственного отделения киназы Aurora B от кинетохорных субстратов

Наука

323

1350

1353

& (

2010

Регулируемое нацеливание протеинфосфатазы 1 на внешнюю кинетохору с помощью KNL1 противостоит киназе Aurora B

J Cell Biol

188

809

820

& (

2013a

Phospho-h3A и cohesin определяют отдельные регулируемые натяжением пулы Sgo1 на кинетохорах и внутренних центромерах

Curr Biol

23

1927

1933

& (

2013b

Связывание SGO1-PP2A с cohesin с помощью фосфорилирования защищает когезию сорорина и центромеров во время митоза

Nat Cell Biol

15

40

49

& (

2012

Фосфорегуляция Spc105 с помощью Mps1 и PP1 регулирует локализацию Bub1 в кинетохорах

Curr Biol

22

900

906

& (

2013

Структурная основа рекрутирования кинетохор комплекса Ndc80 посредством двух различных рецепторов центромер

EMBO J

32

409

423

& (

2002

Роль Hec1 в передаче сигналов контрольной точки веретена и рекрутировании кинетохор Mad1 / Mad2

Наука

297

2267

2270

& (

2004

Роль CENP-B и альфа-сателлитной ДНК: de novo сборка и эпигенетическое поддержание центромер человека

Chromosome Res

12

543

556

и др. . (

2008

Dbf4-зависимая киназа CDC7 связывает репликацию ДНК с сегрегацией гомологичных хромосом в мейозе I

Ячейка

135

662

678

и др. . (

2011

Область петли Ndc80 способствует образованию прикрепления кинетохор к динамической микротрубочке плюс конец

Curr Biol

21

207

213

и др. . (

2004

Комплекс Ndc80 позвоночных содержит гомологи Spc24 и Spc25, которые необходимы для установления и поддержания прикрепления кинетохор к микротрубочкам

Curr Biol

14

131

137

& (

1997

Созревание кинетохор в клетках PtK1 и его значение для механизмов хромосомной конгрессии и начала анафазы

J Cell Biol

137

1567

1580

и др. . (

2011

Для отключения контрольной точки шпинделя требуется связь PP1 с двигателями Spc7 и kinesin-8

Dev Cell

20

739

750

& (

1997

Состав и сборка центромер почкующихся дрожжей, выявленные с помощью in vivo сшивания

Genes Dev

11

3401

3412

& (

1998

Cse4p является компонентом центральной центромеры Saccharomyces cerevisiae

Ячейка

94

607

613

& (

2011

Drosophila CENh4 достаточно для образования центромеры

Наука

334

686

690

& (

2008

Присоединения кинетохор требуют взаимодействия между неструктурированными хвостами на микротрубочках и Ndc80 (Hec1)

Curr Biol

18

1785

1791

& (

1996

Идентификация, очистка и молекулярное клонирование автономно реплицирующегося связывающего последовательность белка 1 из делящихся дрожжей Schizosaccharomyces pombe

P Natl Acad Sci USA

93

502

507

& (

2007

Контрольная точка сборки шпинделя в пространстве и времени

Nat Rev Mol Cell Biol

8

379

393

(

2011

Cohesin: цепочка с отдельными входными и выходными воротами?

Nat Cell Biol

13

1170

1177

& (

2009

Cohesin: его роли и механизмы

Annu Rev Genet

43

525

558

и др. . (

2013

N-концевой модуль MPS1, содержащий TPR домен, необходим для локализации его кинетохор с помощью Aurora B

J Cell Biol

201

217

231

и др. .(

2012

CENP-T-W-S-X формирует уникальную центромерную структуру хроматина с гистоноподобной складкой

Ячейка

148

487

501

& (

2013

CENP-T обеспечивает структурную платформу для сборки внешней кинетохоры

EMBO J

32

424

436

& (

2004

Консервативный комплекс центромеры Mis12 связан с гетерохроматическим HP1 и белком внешней кинетохоры Zwint-1

Nat Cell Biol

6

1135

1141

& (

2012

Плавная и стабильная работа центромер

Гены Genet Syst

87

63

73

и др. . (

2006

Комплекс CENP-H-I необходим для эффективного включения вновь синтезированного CENP-A в центромеры

Nat Cell Biol

8

446

457

& (

1976

Электронно-микроскопическое исследование веретена и движения хромосом у дрожжей Saccharomyces cerevisiae

J Cell Sci

22

219

242

и др. . (

2006

Для монополярного прикрепления сестринских кинетохоров в мейозе I требуется казеинкиназа 1

Ячейка

126

1049

1064

и др. . (

2010

Комплекс MIS12 является центром взаимодействия белков для сборки внешней кинетохоры

J Cell Biol

190

835

852

& (

2003

Sim4: новый кинетохорный белок делящихся дрожжей, необходимый для центромерного сайленсинга и сегрегации хромосом

J Cell Biol

161

295

307

и др. . (

2009

Scm3 делящихся дрожжей: рецептор CENP-A, необходимый для целостности субкинетохорного хроматина

Mol Cell

33

299

311

& (

2003

Комплекс Mtw1 способствует биориентации кинетохор, которая контролируется протеинкиназой Ipl1 / Aurora

Dev Cell

5

735

745

и др. . (

2009

Кинетохорный комплекс Ndc80 формирует несущие нагрузки прикрепления к динамическим концам микротрубочек посредством смещенной диффузии

Ячейка

136

865

875

& (

2011

CENP-C — это структурная платформа для сборки кинетохор

Curr Biol

21

399

405

и др. . (

2003

Рекрутирование кинетохор двух ядрышковых белков необходимо для сегрегации гомологов в мейозе I

Dev Cell

4

535

548

и др. . (

2006

Протеиновая фосфатаза 2A защищает слипание центромерных сестринских хроматид во время мейоза I

Природа

441

53

61

(

1982

Формирование, структура и состав кинетохор и кинетохорных волокон млекопитающих

Int Rev Cytol

79

1

58

& (

2011

KNL1 / Spc105 нанимает PP1, чтобы заглушить контрольную точку узла шпинделя

Curr Biol

21

942

947

& (

2013

Процесс сборки кинетохор в дрожжах

FEMS Microbiol Lett

338

107

117

& (

2007

Хромосомные пассажиры: деление клеток

Nat Rev Mol Cell Biol

8

798

812

& (

1996

Контрольная точка шпиндельной сборки

Curr Opin Cell Biol

8

773

780

& (

2009

Исследования мейоза раскрывают различные роли когезии в центральной центромере и перицентромерном регионе

Chromosome Res

17

239

249

& (

2009

Геометрия кинетохор определяется сцеплением внутри центромеры

Природа

458

852

858

и др. . (

2005

Комплекс DASH и кинезин Klp5 / Klp6 координируют прикрепление биполярных хромосом у делящихся дрожжей

EMBO J

24

2931

2943

& (

2013

Субъединица монополина Csm1 ассоциирует с комплексом MIND, чтобы установить монополярное прикрепление сестринских кинетохоров в мейозе I

PLoS Genet

9

e1003610

& (

2011

Aurora B потенцирует активацию Mps1 для обеспечения быстрого установления контрольных точек в начале митоза

Нац Коммуна

2

316

& (

2012

Белки CENP-T являются консервативными центромерными рецепторами комплекса Ndc80

Nat Cell Biol

14

604

613

& (

2011

Прямое связывание Cenp-C с комплексом Mis12 соединяет внутреннюю и внешнюю кинетохоры

Curr Biol

21

391

398

и др. . (

2012

Фосфозависимое рекрутирование Bub1 и Bub3 на Spc7 / KNL1 с помощью киназы Mph2 поддерживает контрольную точку веретена

Curr Biol

22

891

899

& (

2013

Замена CENP-A

Cell Mol Life Sci

70

387

406

& (

2012

Интеграция киназной и фосфатазной активностей с помощью BUBR1 обеспечивает образование стабильных прикреплений кинетохор и микротрубочек

Dev Cell

23

745

755

& (

2011

Ассоциация конденсина с гистоном h3A формирует митотические хромосомы

Природа

474

477

483

& (

2000

Требование соединителя центромеры Mis6 для локализации CENP-A-подобного белка в делящихся дрожжах

Наука

288

2215

2219

(

2010

Взаимодействия кинетохора-микротрубочка: шаги к би-ориентации

EMBO J

29

4070

4082

и др. . (

2002

Доказательство того, что комплекс Ipl1-Sli15 (Aurora kinase-INCENP) способствует биориентации хромосом путем изменения связей кинетохора-полюс веретена

Ячейка

108

317

329

& (

2009

CENP-C функционирует как каркас для эффекторов с важными кинетохорными функциями в митозе и мейозе

Dev Cell

17

334

343

& (

2013

Внутренняя петля делящихся дрожжей Ndc80 связывает Alp7 / TACC-Alp14 / TOG и обеспечивает правильное прикрепление хромосомы

Mol Biol Cell

24

1122

1133

& (

1998

Человеческий гомолог Bub3 необходим для кинетохорной локализации Bub1 и родственной Mad3 / Bub1 протеинкиназы

J Cell Biol

142

1

11

& (

2000

Функциональная геномика идентифицирует монополин: кинетохорный белок, необходимый для сегрегации гомологов во время мейоза I

Ячейка

103

1155

1168

& (

2010

Фосфорилирование CPC с помощью Cdk1 способствует би-ориентации хромосом

Природа

467

719

723

(

2009

Вопрос выбора: установление сцепления сестринских хроматид

Представитель EMBO

10

1095

1102

и др. . (

2012

Рекрутирование человеческого белка лицензирования репликации Cdt1 петлевым доменом Hec1 необходимо для стабильного прикрепления кинетохора к микротрубочке

Nat Cell Biol

14

593

603

& (

2008

Архитектура и гибкость дрожжевого кинетохорного комплекса Ndc80

Дж Мол Биол

383

894

903

и др. . (

2010

Фосфорилирование гистона h4 Thr-3 с помощью Haspin позиционирует Aurora B на центромерах митоза

Наука

330

231

235

& (

2011

Динамика полярного сияния B на центромерах создает градиент фосфорилирования

J Cell Biol

194

539

549

& (

1999

Cohesin Rec8 необходим для редукционной сегрегации хромосом при мейозе

Природа

400

461

464

& (

2001

Премейотическая S-фаза связана с редукционной сегрегацией и рекомбинацией хромосом

Природа

409

359

363

& (

2005

Молекулярная организация комплекса Ndc80, важного кинетохорного компонента

P Natl Acad Sci USA

102

5363

5367

& (

2007

Комплекс Ndc80 / HEC1 является точкой контакта для прикрепления кинетохоры и микротрубочек

Nat Struct Mol Biol

14

54

59

& (

1996

Saccharomyces cerevisiae ген дупликации тела полюса веретена MPS1 является частью митотической контрольной точки

J Cell Biol

132

111

123

& (

2009

Комплекс кинетохор человека Ska1 способствует подвижности микротрубочек, связанной с деполимеризацией

Dev Cell

16

374

385

& (

2010

Aurora B фосфорилирует пространственно разные мишени, чтобы по-разному регулировать интерфейс кинетохора-микротрубочка

Mol Cell

38

383

392

& (

2013

Семейные вопросы: структурная и функциональная консервация белков, связанных с центромерой, от дрожжей до человека

Trends Cell Biol

23

260

269

& (

2003

Архитектура кинетохоры почкующихся дрожжей обнаруживает консервативное молекулярное ядро ​​

J Cell Biol

163

215

222

и др. . (

2005

Формирование динамического интерфейса кинетохора-микротрубочка посредством сборки кольцевого комплекса Dam1

Mol Cell

17

277

290

& (

1989

Организация дальнего действия тандемных массивов альфа-сателлитной ДНК в центромерах хромосом человека: высокочастотный полиморфизм длины массива и мейотическая стабильность

P Natl Acad Sci USA

86

9394

9398

& (

2001

Комплекс Ndc80p из Saccharomyces cerevisiae содержит консервативные компоненты центромеры и выполняет функцию сегрегации хромосом

J Cell Biol

152

349

360

(

1990

Центромеры хромосом млекопитающих

Trends Genet

6

410

416

& (

2010

Две гистоновые метки устанавливают внутреннюю центромеру и биориентацию хромосомы

Наука

330

239

243

& (

2012

MPS1 / Mph2 фосфорилирует кинетохорный белок KNL1 / Spc7 для рекрутирования компонентов SAC

Nat Cell Biol

14

746

752

и др. . (

2012

Комплекс Saccharomyces cerevisiae MHF структурно напоминает гетеротетрамер гистонов (h4-h5) (2) и функционирует как гетеротетрамер

Структура

20

364

370

& (

2005

Кинетохорный белок Moa1 обеспечивает опосредованное когезией монополярное прикрепление в мейозе I

Ячейка

123

803

817

& (

2003

Cohesins определяют способ прикрепления кинетохор к микротрубочкам веретена в мейозе I у делящихся дрожжей

Mol Cell Biol

23

3965

3973

& (

2012

Внутренняя петля Ndc80 необходима для рекрутирования комплекса Ska для установления прикрепления микротрубочек на конце к кинетохорам

J Cell Sci

125

3243

3253

© 2014 Федерация европейских микробиологических обществ.

Инструктивный внеклеточный матрикс легкого: основной состав и изменения при хроническом заболевании легких

Часть A: легочный ECM

Эволюция сложных тканей у высших организмов сопровождается увеличением разнообразия белков и структурной организации в ECM [ 1], а также расширение разнообразия рецепторов ЕСМ на клетках.Как и во всех других системах органов, легочный ECM состоит из двух основных структурных типов: 1) базальные мембраны, которые представляют собой тонкие слои гликопротеинов, которые покрывают базальную сторону эпителия и эндотелия и окружают мышечные, жировые и периферические нервные клетки; и 2) интерстициальные матрицы, которые образуют рыхлую и похожую на фибриллы сетку, которая связывает структурные типы клеток в тканях и, таким образом, поддерживает трехмерную (3D) когезию и биомеханические характеристики легких [2].И базальные мембраны, и интерстициальные матрицы образуют тканеспецифические «ниши», которые влияют на стволовость и дифференцировку популяций клеток-предшественников / стволовых клеток, а также на правильную функцию тканеспецифичных дифференцированных типов клеток.

Распутывание матрисомы

На основании биоинформатического анализа доступного генома млекопитающих, число основных структурных компонентов всего ЕСМ млекопитающего, по прогнозам, включает ~ 300 белков (основная матрисома) [3, 4].Кроме того, ЕСМ связывается и служит резервуаром для большого количества секретируемых белков, таких как факторы роста, модифицирующие ЕСМ ферменты или другие связанные с ЕСМ белки, которые не вносят вклад в структуру ЕСМ, но влияют на его функцию как обучающая «ниша» (белки, ассоциированные с матрисомой). Из-за их сложных биохимических свойств (нерастворимость, высокая молекулярная масса и высокая степень сшивки белков) детальный анализ белков ЕСМ был очень сложным [5]; однако недавний прогресс в области оборудования для масс-спектрометрии (МС) и алгоритмов количественной оценки впервые позволил провести всесторонний анализ протеомов ЕСМ из различных тканей [6–13].Количественная оценка белков без метки с помощью МС не только позволяет относительное сравнение белков в разных образцах и экспериментальных условиях, но также позволяет оценить абсолютные количества [14]. Используя этот подход, мы проанализировали наш недавно опубликованный набор протеомных данных протеома легких мышей [12] и оценили относительное содержание белков коровой матрицы, что позволило получить углубленный профиль экспрессии ECM в легких здоровых мышей (рис. 1).

Протеом внеклеточного матрикса (ЕСМ) взрослого здорового легкого мыши.а) Мы использовали наш недавно опубликованный набор протеомных данных протеомов легких мышей для расчета относительной массовой доли белка указанных категорий генов. Интенсивности МС белков в пределах изображенных категорий генов выражали в миллионных долях от общей интенсивности МС всех белков. б – г) Для определения относительного числа копий белков ЕСМ в протеоме легких интенсивность МС нормализовали к теоретическому количеству триптических пептидов (нормализация размера белка; iBAQ).Мы использовали эту оценку числа копий белка для ранжирования коллагенов (b), протеогликанов (c) и гликопротеинов (d) по их количеству. МС: масс-спектрометрия; iBAQ: абсолютное количественное определение на основе интенсивности.

Состав ЕСМ

Коллагены составляют основную часть протеина в легких [15], и они сильно изменяются при многих заболеваниях легких (рис. 2). Фибриллярные коллагены (типы I, II, III, V и XI), которые имеют большую прочность на разрыв, но низкую эластичность, вносят вклад в общую архитектуру легкого [16, 17], тогда как большие эластичные волокна, которые характеризуются низкой прочность на разрыв и высокая эластичность, обеспечивают легкому необходимую податливость и упругую отдачу.Эластичные волокна состоят из двух различных компонентов: эластин белка ЕСМ находится в его сшитой форме во внутренней сердцевине эластичных волокон, тогда как внешняя периферия эластичных волокон содержит микрофибриллы размером 10-15 нм [18].

Патологические изменения внутри интерстициального внеклеточного матрикса (ЕСМ) в пораженном легком. а) Обзор легкого и участков образования болезни. б) Здоровый интерстициальный ECM поддерживается активностью резидентных фибробластов и представляет собой рыхлую сеть коллагенов, эластина и фибронектина, прикрепленную к базальной мембране слоя эпителиальных клеток.c) При идиопатическом фиброзе легких (IPF) фибробласты трансдифференцируются в миофибробласты с высокой сократимостью, которые откладывают высокие уровни молекул ECM в интерстиции и резко увеличивают жесткость ECM за счет ферментативного ковалентного сшивания коллагена и эластина. г) Признаками патологических изменений внутри ВКМ при хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) являются обширное разрушение эластических волокон ферментами, разрушающими ВКМ, высвобождаемыми воспалительными клетками, наряду с повышенными уровнями гиалуронана и тенасцина С и сниженным отложением декорина. .Разрушение слоя эпителиальных клеток приводит к увеличению воздушного пространства (эмфиземе). д) При легочной артериальной гипертензии (ЛАГ) ремоделирование внеклеточного матрикса в стенке артерии характеризуется увеличением эластиновых и коллагеновых волокон, фибронектина и тенасцина С и гиперплазией гладкомышечных клеток. е) При астме характерные изменения ВКМ происходят под эпителием бронхов и утолщенной базальной мембраной. Кроме того, гладкомышечные клетки подвергаются гиперплазии, и увеличивается отложение коллагенов, фибронектина, гиалуронана и декорина.ж) При раке опухоли на первичной и метастатической сторонах окружены обширной жесткой стромой, которая содержит сильно сшитые коллагены и высокие уровни фибронектина, тенасцина С и гиалуронана. з) Легенда, изображающая молекулы и типы клеток.

Основными структурными компонентами микрофибрилл являются крупные гликопротеины фибриллин-1, -2 и -3 [19]. Кроме того, другие белки, такие как гликопротеины, ассоциированные с микрофибриллами, фибулины, белки, расположенные на границе раздела микрофибрилл эластина (EMILINs) и члены семейства эластин-сшивающих лизилоксидаз (LOX), связаны с микрофибриллами или с самим эластином [18].Интересно, что связанный с микрофибриллами протеин 4 (MFAP4) был самым распространенным гликопротеином, обнаруженным в нашем наборе данных по матрисомам легких здоровых взрослых мышей (рисунок 1) [12]. У людей высокая экспрессия MFAP4 была показана не только для легких, но и для других высокоэластичных тканей, таких как сердце и кишечник [20]. Биологическая функция MFAP4 в значительной степени неизвестна; Хотя он был идентифицирован как сывороточный биомаркер гаптического фиброза, он не может служить биомаркером фиброза легких [21].

Интерстициальный ECM альвеол состоит из расслабленной сети, в значительной степени основанной на коллагенах I и III типов и эластине как важных коровых белках [22, 23].Трехмерное расположение этой сети переплетенных волокон допускает нелинейное поведение напряжения-деформации (гистерезис и вязкоупругость), которое является характерным свойством мягких соединительных тканей [24]. Во время дыхания рассеяние энергии, вызывающее гистерезис и вязкоупругость в паренхиме легких, обусловлено контактами волокна с волокном в ECM коллаген-эластин, хотя типы сократительных клеток и сурфактант на границе раздела воздух-жидкость также могут способствовать этим эффектам [17] . В дополнение к своим биомеханическим функциям компоненты эластичных волокон, такие как фибулины и EMILINs, регулируют адгезию клетка-ECM, взаимодействуя с гетеромерными трансмембранными интегриновыми рецепторами [25, 26].В отличие от EMILINs, которые связывают интегрины через их домен gC1q-1, фибулин-5 связывает интегрины через эволюционно консервативную последовательность RGD (аргинин-глицин-аспарагиновая кислота). Этот трипептид-связывающий мотив RGD характерен для других гликопротеинов ЕСМ, включая фибронектин, витронектин, остеопонтин, коллагены, тромбоспондины, фибриноген и фактор фон Виллебранда, все из которых опосредуют адгезию клетки-ЕСМ через рецепторы интегрина [27]. Помимо фиброзных коллагенов и гликопротеинов, протеогликаны (PGs), которые состоят из основного белкового компонента, ковалентно связанного с сульфатированными полисахаридами или гликозаминогликанами (GAG), являются основными составляющими ECM [28].Благодаря высокому содержанию полисахаридов PG являются гидрофильными, что способствует образованию гидрогелей и способствует вязкоупругости легких. PG содержат составляющие базальной мембраны перлекан и агрин, а также hyalectans versican, aggrecan, нейрокан, бревикан и подкласс протеогликанов с низким содержанием лейцина, включая его наиболее выдающиеся представители, декорин, бигликан и люмикан [29]. Декорин, бигликан и люмикан были одними из самых распространенных протеогликанов в нашем наборе данных по матрисомам здоровых легких взрослых мышей (рис. 1) [12]. In vitro , как декорин человека, так и бигликан способны связываться с профибротическим цитокин-трансформирующим фактором роста-β1 (TGF-β1), но in vivo , только декорин, но не бигликан, ингибирует фиброгенный эффект TGF- β1 [30]. Кроме того, сообщается, что декорин взаимодействует с различными металлопротеазами и может действовать как опухолевый супрессор, ослабляя рост, миграцию и ангиогенез опухоли [31].

Посттрансляционные модификации компонентов ECM

Посттрансляционные модификации (PTMs), e.грамм. Известно, что ферментативное и химическое сшивание, трансглютаминирование, гликозилирование и гликозилирование, окисление и цитруллинирование влияют на структурное и / или функциональное разнообразие белков ЕСМ [32]. Например, ферментативное перекрестное сшивание коллагена и эластина, существенный шаг во время их биосинтеза, который в основном осуществляется ферментами семейства лизилоксидаз (LOX, LOXL1-4) и членами семейства трансглутаминаз (TG1-7, FXIII- A), обеспечивает компоненты ECM их характерной прочностью на разрыв [33–35].Кроме того, ферментативное (гликозилирование) или неферментативное (гликозилирование) добавление сахаров к белкам также влияет на биомеханику и функцию ЕСМ. В частности, в настоящее время гликирование считается фактором фиброза, связанного со старением. Этот процесс вызывает образование и накопление конечных продуктов гликирования (AGE). Аберрантные процессы гликирования были связаны с повышенной жесткостью тканей, например. при экспериментальном образовании AGE в сухожилиях, которые, как было показано, уменьшают скольжение волокна при увеличении растяжения волокна [36].Карбамилирование, представляющее собой неферментативное присоединение мочевины к остаткам изоциановой кислоты в белках, отрицательно влияет на стабильность и конформацию тройных спиралей коллагена I, а также на их расщепление под действием ММП [37]. Окисление белков ЕСМ реактивными формами кислорода (ROS) дополнительно модулирует качества ЕСМ, изменяя его производство, оборот и модификации, а также оказывая влияние на взаимодействия клетка-ЕСМ [38]. Кроме того, было обнаружено, что сывороточные уровни маркеров окислительного стресса повышены у пациентов с ИЛФ [39] и в конденсатах дыхания пациентов с астмой [40].ECM также может модулироваться цитруллинированием, ферментативной реакцией дезаминирования аргинина, которая влияет на адгезию клеток [41]. Для более полного обзора PTMs в ECM и их роли в заболевании мы отсылаем читателя к этим дополнительным обзорам [32, 42–45]. Взятые вместе, структурные и функциональные свойства легочного ECM могут быть изменены с помощью PTM, которые считаются важным потенциальным источником заболевания легких, как подробно описано в следующих разделах.

Биомеханика и перекрестные помехи между клетками и ЕСМ

Все клетки временно или постоянно прикрепляются к какой-либо форме ЕСМ через рецепторы клеточной адгезии , наиболее заметно семейство интегринов трансмембранных гетеродимерных рецепторов [46, 47].Клетки могут использовать интегрины для исследования биохимических и топографических характеристик своего окружения [47, 48]. Сигнальная трансдукция, исходящая от адгезии клетка-ECM, контролирует клеточное поведение, такое как подвижность и распространение, морфология, выживаемость, пролиферация и дифференцировка [1, 22]. Эти сигнальные события зависят от множества белков, которые рекрутируются в кластеры интегринов плазматической мембраны, которые вместе называются «адгезомами» [49]. Недавние протеомные исследования очертили общий белковый состав адгезомы и его динамику под влиянием механических сил [50–55].Когда клетки сталкиваются со своим внеклеточным субстратом, они реагируют на жесткость этого субстрата множеством способов, включая немедленные изменения формы и активности клеток, а также долговременную экспрессию генов и изменения идентичности клеток. Эта механо-реципрокность генерируется посредством обратных связей между адгезиями клетка-ECM и цитоскелетом, которые настраивают силу сократительных сил на равновесие между приложенной силой и прочностью на разрыв субстрата ECM [47]. В этом процессе структура и организация цитоскелета изменяются, и было показано, что это вызывает долгосрочные изменения экспрессии генов [56].Точная молекулярная природа многих элементов в этих обратных связях в настоящее время неизвестна, и также неясно, в какой степени равновесие механо-чувствительности и механо-реакции различается между типами клеток и как такие различия могут быть запрограммированы. Важно отметить, что хорошо известно, что механочувствительные сигнальные пути важны в патофизиологии фиброзных заболеваний и рака, оба из которых обнаруживают динамические изменения в составе ВКМ и механических свойствах во время прогрессирования заболевания [57–61].В частности, патологически повышенное отложение ВКМ, сопровождающееся ковалентным перекрестным связыванием и ремоделированием ВКМ, вызывает резкое увеличение жесткости ВКМ, вызывая, таким образом, механический градиент между патологической и нормальной тканью. Градиенты жесткости внутри ЕСМ диктуют миграционное поведение клеток в процессе, называемом дуротаксисом. Дуротаксис, по-видимому, является довольно общим явлением, поскольку было показано, что многие типы клеток, включая фибробласты, мезенхимальные стволовые клетки (МСК), миобласты и раковые клетки, перемещаются по градиентам жесткости [62–65].Кроме того, жесткость ВКМ влияет на распространение, сократимость и дифференцировку фибробластов [66, 67]. При выращивании на мягких матрицах фибробласты и многие другие клетки обычно демонстрируют низкие сократительные силы вместе с уменьшенным распространением и пролиферацией [68, 69]. Жесткость ВКМ также влияет на дифференцировку МСК, поскольку остеогенные и адипогенные клоны появляются на жестких и мягких поверхностях, соответственно [66]. Первичные культуры клеток альвеолярного эпителия типа II (ATII), которые, как считается, обладают потенциалом стволовых клеток и способны к долгосрочному самообновлению во взрослом легком, изменяют свою морфологию и функциональные характеристики (синтез и секреция сурфактанта) в зависимости от субстрат ЕСМ, используемый в культуре [28].В исследовании in vitro первичные альвеолярные макрофаги человека, которые опосредуют фиброз легких, показали увеличение фагоцитоза и изменения транскрипции и фенотипа при культивировании на жестком ECM [70]. Кроме того, для монослоя эндотелиальных клеток было продемонстрировано, что их культивирование на более жестком ECM оказывает негативное влияние на целостность монослоя, таким образом подтверждая важность проницаемости барьера в отношении трансмиграции лейкоцитов [71].

Резервная функция ЕСМ

ЕСМ служит резервуаром для ряда факторов роста и цитокинов, которые имеют решающее значение для дифференцировки и пролиферации клеток [4, 22, 72].Связь таких факторов, как фактор роста фибробластов (FGF), фактор роста гепатоцитов, а также латентный и активный TGF-β1 (полный список мы отсылаем читателя к ранее опубликованной таблице [72]) с ECM имеет некоторые последствия: ECM -связанные факторы 1) могут быть латентными, замаскированными или иметь иную активность по сравнению с их растворимой формой, 2) могут образовывать иммобилизованные градиенты, имеющие решающее значение для миграции клеток, 3) могут, как отпечатки прежней клеточной активности, иметь функцию памяти для инструктирования клеток поведение, 4) облегчают клеточную адгезию и рост клеток, и 5) как запасенные факторы могут быстро активироваться протеолитическим высвобождением и генерировать локальные сигналы, которые не зависят от медленных процессов, таких как экспрессия генов [72, 73].Деградация ЕСМ является ключевым событием в ремоделировании ткани, и в этом процессе цинк-зависимые протеиназы (метцинцины) играют решающую роль.

Ферменты, разрушающие ЕСМ

Это суперсемейство металлопротеиназ включает матриксные металлопротеиназы (ММП) и адамализины. ММП представляют собой семейство из 25 цинк-зависимых эндопептидаз. Эти ферменты способны расщеплять все компоненты ВКМ [74] и базальные мембраны [75]. ММП секретируются в высоко согласованном процессе вместе с их ингибиторами, тканевыми ингибиторами металлопротеиназ (ТИМП) [76].Адамализины включают дезинтегрин и металлопротеиназы (ADAM) и ADAM с мотивом тромбоспондина (ADAMTS). Благодаря способности ADAM разрушать цитокины, факторы роста и лиганд FAS, им приписывают потенциальное клиническое применение при фиброзе, раке, воспалении и нейродегенерации [77]. При фиброзных заболеваниях легких производство и секреция ММП и ТИМП связывается с макрофагами [78], фиброцитами, эндотелиальными клетками и фибробластами [79], а также сильная экспрессия ММП, особенно ММП-1 и ММР-7. наблюдается в бронхиолярных и альвеолярных эпителиальных клетках [80].Для более подробного обсуждения молекулярных игроков в деградации и ремоделировании ECM, читатель может обратиться к превосходному обзору Lu et al. [81].

Часть B: Процессы ремоделирования ВКМ при хронических заболеваниях легких

IPF

Патогенез и ремоделирование тканей

Хотя этиология IPF остается в значительной степени неизвестной, IPF затрагивает примерно пять миллионов человек во всем мире. До недавнего времени единственным эффективным методом лечения была трансплантация легких. Недавно было показано, что два препарата, одобренные Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA), пирфенидон и нинтеданиб, которые оказывают плейотропное действие на клетки, включая ингибирование продукции ECM, замедляют скорость снижения функции легких [82, 83].При IPF повторяющееся повреждение легких и последующие механизмы восстановления приводят к продолжающемуся разрушению эластичной паренхиматозной ткани легкого, которая постоянно замещается жесткой рубцовой тканью, состоящей из крупных и конденсированных агрегатов клетки-внеклеточного матрикса, известных как фибробластные очаги в легочном интерстиции (рис. 2c). . Прогрессивное ремоделирование ткани приводит к тракционным бронхоэктазам, утолщению межлобулярных перегородок и субплевральным сотам, что можно визуализировать с помощью компьютерной аксиальной томографии (CAT) [84]. Все эти микроскопические и макроскопические изменения способствуют прогрессирующей потере газообмена с последующим ухудшением функции легких, одышкой и, наконец, дыхательной недостаточностью, ведущей к смерти [85].

Миофибробласты

Фибробластные очаги содержат активированные фибробласты и / или высококонтрактильные миофибробласты, которые в основном характеризуются неоэкспрессией α-гладкомышечного актина (α-SMA) и его включением в волокна сократительного стресса. Помимо сократительных свойств, миофибробласты продуцируют большое количество молекул ВКМ в ответ на профибротические стимулы, которые, как полагают, являются результатом несбалансированных механизмов восстановления альвеолярного и бронхиолярного эпителия после повторяющихся микротравм и воспалительных процессов [86] (рисунок 2c).Происхождение миофибробластов в фиброзных очагах все еще остается предметом серьезных дискуссий. В различных исследованиях было показано, что миофибробласты в фиброзном легком происходят из клеток-предшественников костного мозга [87], циркулирующих фиброцитов периферической крови [88, 89], альвеолярных эпителиальных клеток, претерпевающих эпителиально-мезенхимальный переход [90], резидентных фибробластов [ 91] и перициты [92]. Довольно спорно, применяя отслеживание клонов, другое исследование описало пока еще не идентифицированную популяцию резидентных стромальных клеток в фиброзных очагах как источник миофибробластов, но исключило перициты и эпителиальные клетки как источники [93].

Инструктивность

Поскольку миофибробласт считается отличительной чертой IPF, можно предположить, что ECM, продуцируемый миофибробластом, является поучительным компонентом заболевания, который способствует прогрессированию заболевания. Действительно, культивируя фибробласты, происходящие из IPF или здоровых контрольных легких на фиброзной или здоровой децеллюляризованной легочной ткани, Parker et al. продемонстрировал, что аберрантное микроокружение ЕСМ в IPF преимущественно управляет изменениями в экспрессии генов и белков, а не внутренними клеточными изменениями [94].Процесс децеллюляризации и успешной рецеллюляризации целых органов, в идеале с использованием аутологичных стволовых клеток или клеток-предшественников, был протестирован как потенциальный суррогат в медицине трансплантации легких [95–97]. Даже трупные легкие человека, взятые у людей с хроническими заболеваниями легких, были исследованы на предмет их возможного использования в тканевой инженерии ex vivo [98]. Однако в свете текущих открытий, что децеллюляризованные каркасы ВКМ от пациентов с IPF изменяют транскриптом и трансатом пересеянных фибробластов, остается интригующим открытым вопрос, могут ли такие суррогаты, полученные из патологических тканей легких, вообще использоваться для трансплантации легких.

Механофизиология

Современные концепции в этой области предполагают важнейшие функции конкретных белков ЕСМ в тонкой настройке сигнальных путей за счет их способности модулировать передачу сигналов факторов роста [99–101] или важные эффекты жесткости тканей на прогрессирование заболевания. Жесткость ECM при фиброзных нарушениях увеличивается за счет ферментативного ковалентного сшивания коллагена и эластина членами семейства LOX и TG [34, 35]. Было показано, что при IPF экспрессия лизилоксидазоподобного 2 (LOXL2) и TG2 повышается в сыворотке и легких, соответственно, пациентов с IPF [102, 103].Жесткость децеллюляризованной ткани IPF действительно выше, чем обычно, как показывает атомно-силовая микроскопия [13], и, соответственно, активность немышечного миозина-II, который управляет сократимостью клеток, также выше в фиброзных областях пациенты с ИЛФ [57]. Таким образом, активность и выживание активированных фибробластов при фиброзных заболеваниях можно в значительной степени контролировать с помощью механических сигналов. Действительно, ингибирование опосредованной миозином-II сократимости клеток с использованием ингибитора Rho-киназы индуцировало апоптоз миофибробластов и улучшало экспериментальный фиброз легких [57].Чумперлин и его коллеги использовали измерения экспериментального фиброза в легких, поврежденных блеомицином, с помощью атомно-силовой микроскопии, чтобы выявить поразительное увеличение фиброзных зон с модулем упругости (который измеряет жесткость ткани в Паскалях), превышающим 2 кПа [68]. Интересно, что диапазон физиологической жесткости (0,2–2 кПа) удерживает фибробласты легких в состоянии покоя, тогда как субстраты с более высокой жесткостью (2–35 кПа), наблюдаемые в фиброзных легких, вызывают профиброгенный фенотип с высокой пролиферацией и синтезом ВКМ. ставки [68].Мы показали, что (мио) фибробластам требуется комбинация α5β1-интегрина и гетеродимеров семейства αV-интегрина для эффективного ответа на жесткость богатого фибронектином тканевого микроокружения, которое присутствует в тканевом фиброгенезе [50]. Интересно, что устранение интегринов αV-семейства снижает фиброз в нескольких органах, включая легкие, на экспериментальных моделях мышей с травмой [104], что может указывать на то, что эти интегрины участвуют в механо-чувствительной реакции [50] и / или активации TGF-β. [105].

Протеомные сигнатуры ECM

Будущие протеомные исследования острых по сравнению с хроническими моделями повреждения легких и последующего фиброза могут позволить идентифицировать компоненты внеклеточной ниши, которые выборочно вызывают патологию в постоянном и прогрессирующем фенотипе рубцевания, как видно на IPF. Мы провели протеомное исследование с временным разрешением на модели мышей с острым повреждением легких блеомицином и, основываясь на наблюдаемой временной кинетике изобилия белков, мы смогли предсказать функции отдельных белков на ранних стадиях восстановления ткани, таких как мобилизация стволовых клеток. или поздние стадии, такие как разрешение фиброза.Неожиданные белки ЕСМ, которые не были изучены в контексте повреждения по сравнению с восстановлением и фиброзом, такие как Эмилин-2 и коллаген-XXVIII, были обнаружены в высокой степени через 2 недели после повреждения [12]. Используя сочетание метки стабильных изотопов, фракционирования растворимости децеллюляризованной легочной ткани и протеомного анализа, Декарис и его коллеги оценили кинетику синтеза и отложения ВКМ на модели блеомицина [106] и обнаружили, что скорость синтеза белка фибриллярных коллагенов (типы I, III и V) резко увеличивались как в растворимой, так и в нерастворимой фракциях во время позднего фиброзного ответа, тогда как небольшие богатые лейцином протеогликаны бигликан и декорин, а также фибронектин были повышены при раннем фиброзном ответе.Однако в другом анализе ECM на основе MS децеллюляризованных IPF легких авт. Идентифицировали обогащение гликозаминокликанами, матриксным Gla белком и ассоциированными с микрофибриллами белками в ECM легких IPF [13]. Безусловно, ECM пораженных легких человека может содержать специфическую для заболевания и прогрессирования комбинацию секретируемых белков и протеолитических фрагментов компонентов ECM («сигнатуры»), которая может иметь не только большую диагностическую и / или прогностическую ценность для точной медицины будущего. но может также дать новое понимание молекулярных механизмов патогенеза болезни.

ХОБЛ и эмфизема

Патофизиологические аспекты ХОБЛ, которая в основном вызвана воздействием дыма, включают обструкцию воздушного потока и гиперинфляцию. Ограничение воздушного потока при ХОБЛ вызвано тремя взаимосвязанными процессами: ремоделирование малых дыхательных путей, приводящее к утолщению стенок дыхательных путей, потеря мелких дыхательных путей и увеличение дыхательных пространств в альвеолах, состояние, называемое эмфиземой [17]. Следовательно, распространение транспульмонального давления нарушается, вызывая гиперинфляцию легких.Эти структурные изменения вызывают биомеханические изменения, которые проявляются в потере эластической отдачи легких. Поскольку ECM представляет собой основной компонент дыхательной системы, несущий нагрузку, потеря упругой отдачи при эмфиземе легких предполагает, что эластин, основной компонент эластичных волокон, является главной целью разложения (рис. 2d). На модели эмфиземы мышей как интратрахеальная инстилляция эластолитического фермента эластазы, так и дефицит α1-антитрипсина, основного ингибитора эластазы нейтрофилов, приводили к образованию эмфиземы [107].Дисбаланс протеазной и антипротеазной активности — широко распространенная гипотеза о том, как разложение ткани может происходить при эмфиземе [108]. Высвобождение ферментов, разрушающих ECM, в значительной степени связано с воспалительными клетками, в основном макрофагами, нейтрофилами и Т-клетками [109]. Однако не только разрушение эластических волокон может быть ответственным за изменения биомеханики легких, поскольку есть также экспериментальные доказательства того, что ремоделирование коллагена в стенках альвеол вносит вклад в структурные и биомеханические изменения, обнаруживаемые при эмфиземе легких [110].Соответственно, утолщение коллагеновых фибрилл было продемонстрировано на ультраструктурном уровне у людей и на моделях мышей-грызунов [111]. Это довольно неожиданное открытие подтверждается данными in vivo доказательств того, что деградация эластазой компонентов ECM может запускать синтез коллагена [112], но описанный ответ также может быть результатом TGF-β1-продуцирующих макрофагов, которые стимулируют выработку коллагена эффекторными клетками. [111]. Однако аберрантное отложение коллагена при ХОБЛ по-разному влияет на разные отделы легких.В то время как электронные микрофотографии показали высокое содержание коллагена и эластина в стенках альвеолярной перегородки эмфизематозной ткани [113], более низкая экспрессия коллагена I была обнаружена в дыхательных путях пациентов с ХОБЛ [114]. Annoni et al. проанализировал подробный состав внеклеточного матрикса пациентов с ХОБЛ по сравнению со здоровым контролем в различных отделах легких и показал, что в образцах умеренной ХОБЛ были изменения эластичных волокон, фибронектина, коллагенов, тенасцина-С и версикана во всех отделах легких. [114].В соответствии с этими выводами Roman et al. продемонстрировал индуцированное никотином усиление экспрессии фибронектина как in vitro, , так и in vivo [115]. Более того, in vitro , клетки гладких мышц дыхательных путей (ASM), выделенные от пациентов с ХОБЛ, продуцировали более высокие уровни Col8a1, MMP1, MMP3 и MMP10 в ответ на экстракт сигаретного дыма [116]. Недавно было обнаружено, что у мышей с дефицитом гликопротеина ЕСМ фибулина-4 повышена активность ММП и эластазы нейтрофилов в легких, что привело к разрушению альвеол у новорожденных мышей и впоследствии к образованию эмфиземы [117].Было обнаружено, что при ХОБЛ уровни экспрессии остеопонтина, который представляет собой фосфорилированный кислый гликопротеин ВКМ с функциями клеточной адгезии и миграции, повышены в мокроте пациентов с ХОБЛ [118]. Повышенные уровни остеопонтина неспецифичны для ХОБЛ, поскольку аналогичная повышающая регуляция остеопонтина была описана в легких и жидкости бронхоальвеолярного лаважа пациентов с ИЛФ [119]. Было обнаружено, что AGE, которые в основном вызваны воспалительными процессами, накапливаются в коже пациентов с ХОБЛ.Это потенциально подразумевает роль AGEs и событий гликирования в ранних патологических фазах COPD, хотя прямое участие AGEs в ECM in vivo и в легких человека все еще остается неясным [120]. Кроме того, во время острых обострений ХОБЛ происходит ускоренный оборот белка ЕСМ, что приводит к продуцируемой протеазой фрагментации белков ЕСМ, таких как коллагены, версикан и эластины. Эти отпечатки пальцев белка ЕСМ, циркулирующего в крови, могут быть использованы в качестве мощных биомаркеров при прогнозировании прогрессирования ХОБЛ [121].

ЛАГ

ЛАГ — прогрессирующее заболевание с неблагоприятным прогнозом. Патофизиология ЛАГ характеризуется повышенной нагрузкой на правый желудочек сердца в результате нескольких процессов, таких как генетическая предрасположенность, воспаление, пролиферация клеток, сужение сосудов и ремоделирование сосудов. Легочные артерии подвержены стойкому сужению сосудов и ремоделированию сосудов, что приводит к снижению эластичности легочной артерии [122]. При ЛАГ вся трехслойная архитектура артериальной стенки претерпевает ремоделирование, что приводит к утолщению интимы, медиальной части и адвентиции [123] (рис. 2а).Соответственно, исследования динамического включения с использованием радиоактивного индикатора показали быстрый синтез эластина и коллагена в легочных артериях во время гипоксической легочной гипертензии [124]. Кроме того, компонент ECM, тенасцин-C, был связан с прогрессированием заболевания. У пациентов с ЛАГ и на экспериментальных моделях заболевания тенасцин-C коррелировал с пролиферацией гладкомышечных клеток (SMC) (рисунок 2e) и митогенным ответом на FGF2. Аналогичным образом, в легких мышей с фиброзом тенасцин-C отрицательно коррелировал с эластичностью легких, то есть большие количества этого белка были связаны с более жесткой легочной тканью [12].Между тем, положительная корреляция между экспрессией тенасцина-C и пролиферацией SMC была обнаружена у пациентов с врожденным пороком сердца и на модели грызунов с монокроталином-индуцированной ЛАГ [125]. Однако, in vitro экспрессия эластина обратно коррелировала с пролиферацией SMCs [126]. Кроме того, в утолщенной интиме пораженных сосудов из тканей биопсии легких пациентов с ЛАГ повышенные уровни фибронектина и тенасцина-C были идентифицированы с помощью иммуногистохимии и гибридизации in situ [125].Повышенное отложение ГАГ, таких как гиалуроновая кислота (ГК), также наблюдалось в реконструированных легочных артериях [127, 128]. Более того, патологическая модификация тяжелой цепи НА, которая, как предполагается, также способствует адгезии и активации лейкоцитов, была идентифицирована в ткани легких пациентов с ЛАГ [129].

Известно, что ММП играют решающую роль в ремоделировании легочных сосудов. In vitro и in situ Исследования SMC легочной артерии выявили дисбаланс MMP и TIMP при идиопатической ЛАГ [130]; Было обнаружено, что MMP3 подвергается понижающей регуляции, тогда как TIMP1 активируется в пораженных SMCs [131].Nave et al. сообщил, что лизилоксидазы также участвуют в ремоделировании легочных сосудов при ЛГ, вызывая массивное перекрестное сшивание ВКМ [132]. Несмотря на гиперплазию и гипертрофию сосудистой стенки, обнаруженную в легких с легочной гипертензией, они были успешно децеллюляризованы и рецеллюляризованы мезенхимальными стволовыми клетками [133]. При успешной рецеллюляризации стволовыми клетками децеллюляризованные каркасы 3D ECM из больных легких могут представлять собой действительный источник в клиническом использовании для создания здоровых функциональных тканей.Однако предварительным условием является то, что процесс рецеллюляризации приводит к успешному ремоделированию больного гипертрофического ВКМ в децеллюляризованных каркасах, и, по крайней мере, при фиброзных заболеваниях наблюдается противоположный эффект [94].

Астма

Патология астмы характеризуется хроническим воспалением подслизистых областей малых дыхательных путей с ассоциированной гиперплазией бокаловидных клеток, повышенной секрецией слизи, гипертрофией гладких мышц и бронхоспазмом (рисунок 2f).На структуру легких влияет ремоделирование дыхательных путей, вызванное гиперплазией ASM, с сопутствующим измененным профилем ECM вокруг структур дыхательных путей. Эти структурные изменения проявляются в биомеханических дисфункциях. Соответственно, уменьшается упругая отдача легких, что может быть вызвано нарушением передачи упругой нагрузки между паренхимой легкого и дыхательными путями. Аберрантное накопление ВКМ ранее было обнаружено в легких, страдающих астмой, с его основной локализацией в подслизистых и адвентициальных областях как больших, так и малых дыхательных путей [134].Отложения ВКМ, которые возникают даже при легкой форме астмы, включают коллагены I, III и V в субэпителиальной области, а также фибронектин в ретикулярной пластинке бронхиального эпителия [135] (рисунок 2f). Кроме того, при астме со смертельным исходом сообщалось об увеличении эластических волокон, MMP-9 и MMP-12 в крупных дыхательных путях [136]. Интересно, что состав ВКМ центральных и дистальных дыхательных путей у пациентов со стойкими симптомами астмы, несмотря на терапию кортикостероидами (неконтролируемая астма), отличается от такового у пациентов с чувствительной к кортикостероидам (контролируемой) астмой.По сути, при неконтролируемой по сравнению с контролируемой астмой было обнаружено, что отложение коллагена увеличивается в альвеолярной паренхиме, тогда как версикан увеличивается в центральных дыхательных путях, а декорин и бигликан увеличиваются в обоих отделах [137]. Различия между дистальными отделами дыхательных путей и ремоделированием бронхов могут быть основаны на изменении статуса секреции ВКМ фибробластов, происходящих из этих разных областей [138]. Эти данные указывают на высокую клиническую значимость ремоделирования ВКМ при астме.Было показано, что в ASM присутствие растворимых форм фибронектина и коллагена I может уменьшать сократительную способность, но увеличивать пролиферативную способность ASM, тогда как культивирование клеток в присутствии только экзогенного растворимого ламинина не влияло ни на пролиферацию, ни на сократимость [ 139]. Однако механизм, объясняющий, как белки ECM в их растворимых, не депонированных формах по-разному влияют на фенотип и сократительные функции в ASMs, остается неуловимым. Таким образом, изменения в ECM могут управлять механизмами, ведущими к усиленному росту ASM (рисунок 2f), что является ключевым событием в молекулярной патологии астмы [140].Более того, in vitro исследований ASMs предполагают, что изменения в ECM также происходят на посттрансляционных уровнях при астме [140]. Аберрантное отложение компонентов внеклеточного матрикса по-разному влияет на биомеханические свойства легких. Отложение ВКМ вокруг дыхательных путей усиливает сужение дыхательных путей и вызывает изменения в жесткости тканей.

Рак легкого

Признаками рака у человека, которые были подробно описаны Ханаханом и Вайнбергом [141], являются многоступенчатые биологические возможности, которые включают устойчивую пролиферацию, уклонение от подавления роста, устойчивость к смерти, репликативное бессмертие, индуцированный ангиогенез, инициирование инвазия и метастазирование, нарушение регуляции клеточной энергетики и воспалительные процессы (рис. 2g).Поскольку ЕСМ по своим биохимическим и биофизическим свойствам является регулятором клеточных ответов, лежащих в основе признаков рака, изучение влияния ЕСМ на неопластическое прогрессирование становится важным [142]. Например, мелкоклеточный рак легкого (SCLC) окружен обширной стромой ECM, которая содержит высокие уровни фибронектина, ламинина, коллагена IV и тенасцина-C [143]. Более того, строма опухоли развитой склеротической опухолевой ткани богата коллагеном I, тогда как коллаген III очень распространен в менее зрелой строме [144].Трансляционные исследования показали, что у пациентов с опухолями SCLC, окруженными обширной стромой, время выживания было сокращено, поскольку связывание клеток SCLC с ECM защищает раковые клетки от апоптоза, вызванного химиотерапией [143]. Ремоделирование стромы опухоли сильно влияет на жесткость ткани, что, в свою очередь, влияет на механобиологию клеток и запускает клеточные реакции (рисунок 2g). Поскольку коллаген, как сообщается, вносит основной вклад в прочность на разрыв в архитектуре легких, метаболизм коллагена играет решающую роль в укреплении стромы опухоли.Помимо аберрантного отложения и обмена коллагена, при раке легких наблюдались изменения в перекрестном связывании коллагена. Совсем недавно Chen et al. сообщил, что строма опухоли демонстрирует высокие уровни поперечных связей коллагена, производных гидроксилизинового альдегида (HLCC), и более низкие уровни поперечных связей, производных лизинового альдегида (LCC) [145] (рисунок 2g). Механически этот переход от преимущественно LCC в здоровых к HLCC в опухолевой ткани легкого был связан с ферментом лизилгидроксилазой 2 (Lh3).Сопутствующее увеличение жесткости стромы, в свою очередь, способствовало инвазии опухолевых клеток и метастазированию [145]. В соответствии с этими результатами известно, что опухолевые клетки экспрессируют высокие уровни LOX, и фармакологические вмешательства, направленные на это семейство ферментов, подавляли метастазирование у животных с опухолями [146]. Mouw et al. показали, что при раке груди жесткость ECM индуцирует miR-18a для снижения экспрессии фосфатазы и гомолога тензина (PTEN), что, в свою очередь, приводит к прогрессированию опухоли [147]. Кроме того, повышенная жесткость ECM в опухолях возвращается к клеткам Rho-зависимым образом, увеличивая напряжение цитоскелета и стабилизируя фокальные спайки [148].Поскольку микросреда опухоли создается раком и стромальными клетками, активация стромальных клеток происходит аутокринным и паракринным образом. В частности, активированные фибробласты, так называемые фибробласты, ассоциированные с раком, играют важную роль в прогрессировании опухоли, существенно ремоделируя ECM опухоли, подавляя иммунный ответ и высвобождая факторы, способствующие росту опухоли [149]. Таким образом, опухолевый ЕСМ обеспечивает аберрантные сигналы микросреды, благоприятствующие пролиферации и метастазированию, а также ингибируя апоптоз опухолевых клеток.Соответственно, на первичных участках и участках метастазов инкапсулирующая строма опухоли может придавать устойчивость к химиотерапии. При SCLC было продемонстрировано, что адгезия опухолевых клеток через интегрин-β1 к белкам ECM является решающим событием в устойчивости клеток к химиотерапии [143]. Безусловно, патологические изменения в ECM при раке легких, такие как повышенная экспрессия коллагена, изменение перекрестного связывания коллагена и последующее увеличение жесткости тканей, напоминают изменения, также обнаруженные в IPF, который защищает сходство между этими двумя заболеваниями.Интересно, что сообщается о многих патогенных аналогиях между раком и IPF: общие факторы риска ( например, курение, воздействие окружающей среды, вирусные инфекции и хроническое повреждение тканей), отсроченный апоптоз, активация конкретных сигнальных путей, как эпигенетические, так и генетические изменения, измененная экспрессия микроРНК и аберрантная пролиферация и инвазия клеток [150–154]. Есть практические основания рассматривать IPF как рак, подобное заболеванию, что в конечном итоге может привести к новым клиническим испытаниям противораковых препаратов для IPF [154].

Модельные системы ECM

Состав ECM и его биомеханические свойства влияют на морфологию клеток [155], подвижность, распространение, жизнеспособность клеток и апоптоз, а также на пролиферацию и дифференцировку [5]. Следовательно, поскольку клеточное поведение и ECM сильно взаимосвязаны, необходимы системы культур клеток in vitro, , которые точно имитируют физиологические и патологические условия, обнаруженные in vivo . Множественные модели in vivo на животных , отражающие патогенез заболеваний легких человека, были разработаны в прошлом.Поскольку подробное обсуждение животных моделей, представляющих заболевания легких, далеко выходит за рамки этого обзора, мы отсылаем читателя к ряду отличных обзоров для дальнейшего чтения [156–162]. В частности, исследования мезенхимальных клеток, которые физиологически встроены в ЕСМ, могут быть полезны с использованием моделей in vitro, , in vivo, или ex vivo, , которые очень похожи по структуре и биомеханике интерстициального легочного ВКМ [163–165] . В прошлом применялись различные системы трехмерных культур клеток [166].Самая упрощенная модель — это пластик для тканевой культуры, покрытый молекулами ЕСМ. Благодаря упрощенной конструкции его можно использовать для изучения взаимодействия определенных молекул ЕСМ с клетками, хотя здесь клетки прикреплены к двумерной (2D) поверхности, а не встроены в ЕСМ. Более того, жесткость пластика для клеточных культур намного превосходит физиологически обнаруженный in vivo ; Согласно измерениям с помощью атомно-силовой микроскопии, модуль Юнга (измеренный в Паскалях) пластика клеточной культуры колеблется от 2 до 4 ГПа, тогда как нормальная ткань легких колеблется от 0.44 и 7,5 кПа, в зависимости от измеряемой области, а фиброзная ткань легкого человека у пациентов с ИЛФ в среднем составляет 16,52 кПа [13, 167, 168]. Однако механически настраиваемые 2D-модели с использованием синтетических матриц на основе акриламида или полиэтиленгликоля дают возможность индуцировать образование градиента и жесткий контроль жесткости ECM [166, 169]. Помимо этих искусственно синтезированных макромолекулярных структур, в модельных системах in vitro ECM [174] широко используются нативные и сконструированные биополимеры, состоящие из коллагенов [170], эластина [171], фибрина [172] или ламинина [173].Гели экстракта базальной мембраны и децеллюляризованные матриксы на основе фибробластов также используются в настоящее время [175], и они более точно имитируют состав, трехмерную структуру и биомеханику физиологического внеклеточного матрикса. Однако ни одна из этих моделей не может имитировать уникальную пространственную геометрию легочной ткани. Чтобы обойти эти биомиметические ограничения, можно использовать нарезанные вибратомом матрицы ex vivo , взятые из различных моделей болезней животных, а также из пораженных тканей человека в их нативных или децеллюляризованных формах [13, 176–178]. Ex vivo Модели , использующие децеллюляризованную легочную ткань, помогут дополнительно механистически определить влияние ECM на патологии легких. Наконец, в будущем технологии трехмерной биопечати или методы аддитивного производства могут открыть многообещающие и захватывающие новые способы создания биосовместимых каркасов ECM, которые биомеханически напоминают настоящую ткань. Такие изготовленные каркасы могут быть использованы либо в качестве настраиваемых моделей in vitro для изучения инструктивной природы ECM, либо, в конечном счете, при успешном пересеве с клетками, в качестве биоинженерной ткани, готовой заменить больные ткани или целые органы [179].

Заключение и перспективы на будущее

Хронические респираторные заболевания возникают в результате сложного взаимодействия факторов риска окружающей среды, эпигенетических и генетических влияний. Считается, что неблагоприятные воздействия окружающей среды во время жизни плода и младенца приводят к стойким изменениям в структуре и функции легких. Такое «программирование» на ранних этапах жизни могло бы ошибочно переделать ECM и, следовательно, проложить путь для развития хронических респираторных заболеваний во взрослом возрасте. Регулируемое ремоделирование внеклеточного матрикса, особенно в процессе заживления ран, его резидентными клетками является предпосылкой для поддержания гомеостаза тканей.В патологических событиях качества ECM, такие как его состав и топологические особенности, биомеханические свойства, PTM или роль резервуара для секретируемых медиаторов, действуют как поучительные сигналы, которые влияют на поведение фибробластов и других типов клеток. Как только гомеостаз ткани нарушается повторным повреждением и восстановлением, аберрантные механизмы обратной связи между клетками и их реконструированным ECM запускают порочный круг, который приводит к прогрессированию заболевания. Во время прогрессирования заболевания взаимодействие между клетками и ECM может быть очень сложным, может включать различные типы клеток и может происходить в пространственно различных компартментах.Например, успешное метастазирование требует раннего ремоделирования ВКМ в метастатической нише, которая пространственно удалена от локальной ниши первичной опухоли, чтобы помочь циркулирующим опухолевым клеткам прижиться в отдаленных органах [180]. Следовательно, определение молекулярного состава ЕСМ в пораженных легких с помощью современных технологий, таких как протеомика, управляемая МС или секвенирование следующего поколения, является важным шагом на пути к идентификации диагностических биомаркеров прогрессирования заболевания и одинаковая терапия.Будущие попытки разработать методы для понимания сложной функциональной и физической топологии ECM in situ на системном уровне будут ключевыми для понимания его роли в тканевой (патофизиологии). Чтобы увидеть прорывы в разработке новых терапевтических вмешательств, крайне важно понять сложные взаимодействия и лежащие в основе механизмы обратной связи, которые происходят между основной матрисомой, факторами, связанными с матрисомой, и клетками [168, 181]. Потенциальные терапевтические средства для лечения фиброзных заболеваний включают ферменты, которые воздействуют на жесткость ECM путем разрушения аномального ECM, а также антитела, которые ингибируют активность ферментов сшивания ECM, таких как лизилоксидазы, а также активность MMP и TGF-β1 [73].Кроме того, ингибиторы клеточных рецепторов, таких как рецептор эпидермального фактора роста, или лекарства, нацеленные на механизм механотрансдукции через интегрины , в настоящее время тестируются в качестве терапевтических средств при таких заболеваниях, как рак легких и фиброзные расстройства [73). Кроме того, молекулы и пути, участвующие в реакции легких на окислительный стресс, обсуждаются как потенциальные терапевтические мишени [38]. Также растет интерес к использованию клеток-предшественников, таких как мезенхимальные стволовые клетки, которые могут обладать регенеративным потенциалом, в качестве усилителей восстановления тканей [168].Однако на данный момент трансплантация легких остается единственным действенным методом лечения терминальной стадии заболеваний легких, но нехватка донорских легких и необходимость интенсивной иммуносупрессии для предотвращения отторжения аллотрансплантата ограничивают их клиническое применение. Следовательно, биоартификационные каркасы внеклеточного матрикса станут важными элементами терапии на основе стволовых клеток в регенеративной медицине. Дальнейшие усилия позволят определить, могут ли синтетические (напечатанные на 3D-принтере) каркасы или децеллюляризованные каркасы ECM целых органов и их рецеллляризация аутологичными предшественниками или стволовыми клетками привести к полностью функциональным и трансплантируемым органам.Изготовление таких суррогатов легких все еще далеко от реальности, но фундаментальные исследования архитектуры и функции ECM, а также тканевой инженерии, вероятно, дадут новые идеи для практического применения.

Потеря полицистинов подавляет децилизацию посредством активации пути центросомной целостности

Abstract

Первичная ресничка представляет собой основанную на микротрубочках, антенно-подобную органеллу, в которой находятся несколько сигнальных путей. Он следует циклическому паттерну сборки и дециляции (разборки и / или шеддинга), когда клетки выходят и снова входят в клеточный цикл, соответственно.Как правило, потеря первичных ресничек приводит к цистогенезу почек. Однако в моделях на животных аутосомно-доминантной поликистозной болезни почек, основного заболевания, вызванного мутациями в генах полицистина ( Pkd1 или Pkd2 ), удаление первичных ресничек или ускорение децилитации подавляет кистозный рост, тогда как замедление децилирования усиливается. цистогенез. Здесь мы показываем, что децилиция задерживается в кистозном эпителии мышиной модели постнатальной делеции Pkd1 и в Pkd1 — или Pkd2 — нулевых клетках в культуре.Механистические эксперименты показывают, что истощение PKD1 активирует путь центросомной целостности / митотического наблюдения с участием 53BP1, USP28 и p53, что приводит к задержке децилирования. Снижение скорости децилитации вызывает длительную активацию сигнальных путей на основе ресничек, которые могут способствовать росту кисты. Наше исследование связывает поликистины с динамикой ресничек, идентифицирует клеточную децилизацию ниже пути центросомной целостности и помогает объяснить прокистозные эффекты первичных ресничек при аутосомно-доминантной поликистозной болезни почек.

Введение

Первичная ресничка представляет собой одиночную антенно-подобную органеллу, присутствующую практически во всех типах клеток человеческого тела. Он состоит из аксонемы, микротрубочковой структуры, покрытой специальной формой плазматической мембраны и базального тельца, модифицированной центросомы, формирующей основу реснички (Haimo & Rosenbaum, 1981). Сборка и поддержание ресничек достигается за счет внутрижгутикового транспорта (IFT), опосредованного согласованным действием антероградных кинезинов (комплекс IFT-B) и ретроградного динеина (комплекс IFT-A) (Ishikawa & Marshall, 2011; Kobayashi & Dynlacht, 2011; Nigg & Stearns, 2011; Sung & Leroux, 2013).Реснички достигают своей максимальной длины в состоянии покоя (G0) и постепенно разбираются или сбрасываются при повторном входе в клеточный цикл (Pugacheva et al, 2007; Liu et al, 2018; Mirvis et al, 2018, 2019; Wang & Dynlacht, 2018). Постепенная разборка и отторжение ресничек — сложный процесс, и хотя он был связан с развитием клеточного цикла в культивируемых клетках, его биологическая роль в контексте всего животного неясна (Sanchez & Dynlacht, 2016; Breslow & Holland, 2019). Ускоренная или пониженная скорость разборки ресничек может уменьшать или увеличивать время, которое клетки проводят в G1 и, таким образом, усиливать или замедлять повторный вход клеточного цикла, соответственно (Kim et al, 2011; Li et al, 2011; Phua et al, 2017).Также появляются доказательства связи ресничек и реакции на повреждение ДНК (Chaki et al, 2012; Johnson & Collis, 2016; Walz, 2017). Следовательно, также возможно, что пониженная скорость разборки может также запускать активацию ответа на повреждение ДНК, вызывая остановку клеток в G2 и G1 для полной резорбции ресничек. В этом случае несвоевременная разборка ресничек может привести к анеуплоидии и геномной нестабильности, что может привести к неконтролируемой пролиферации. Следовательно, изменения в скорости разборки и / или шедирования ресничек могут иметь положительные и отрицательные эффекты на прогрессию клеточного цикла в зависимости от клеточного контекста и типа и передачи сигналов на основе ресничек.

HEF1 / AURKA / HDAC6 (Pugacheva et al, 2007), Nek2 / Kif24 (Kim et al, 2015) и Plk1 / Kif2A (Miyamoto et al, 2015) являются основными путями разборки ресничек, которые активируются при индуцировании клеток. повторно войти в клеточный цикл. В пути HEF1 / AURKA / HDAC6 HEF1 является каркасным белком, который при связывании с AURKA индуцирует аутофосфорилирование и активацию AURKA (Nikonova et al, 2013). Активированный AURKA фосфорилирует HEF1 и HDAC6 (Никонова и др., 2013). Активированный HDAC6 ведет к разборке ресничек за счет деацетилирования α-тубулина, вызывая деполимеризацию микротрубочек (Pugacheva et al, 2007).Этот путь молчит в G1 / G0 и не участвует в контроле длины ресничек в G1 / G0, но активируется за счет активации HEF1 в ответ на передачу митогенных сигналов (Pugacheva et al, 2007). AURKA и некоторые др. Центросомные белки, включая NDE1, негативный регулятор цилиогенеза, образуют большой комплекс, называемый комплексом разборки ресничек (CDC) (Gabriel et al, 2016). Активность CDC может быть положительно или отрицательно модулирована несколькими факторами / путями. Эти пути включают передачу сигналов Ca ²⁺ (Plotnikova et al, 2010, 2012), неканоническую передачу сигналов Wnt5a (Lee et al, 2012), изменения в составе фосфолипидов цилиарной мембраны (Bielas et al, 2009; Phua et al, 2017) и др.Супрессоры опухолей, такие как Von Hippel-Lindau (pVHL) (Xu et al, 2010) и гомолог фосфатазы и тензина (PTEN) (Shnitsar et al, 2015), негативно регулируют разборку ресничек. Таким образом, разборка ресничек в значительной степени контролируется тремя путями, на которые в дальнейшем могут влиять внеклеточные / средовые и внутриклеточные факторы.

ADPKD характеризуется образованием массивных кист в почках и повышенной пролиферацией клеток (Bhunia et al, 2002; Kim et al, 2004; Zhou, 2009).В культуре клеток потеря Pkd1 или Pkd2 , по-видимому, ускоряет переход G1 в S, влияя на уровни p21 (Bhunia et al, 2002; Kim et al, 2004; Li et al, 2005; Low et al, 2006 г.). Соответственно, количество активно циркулирующих клеток в кистозном эпителии всегда заметно увеличивается в Pkd1 — или Pkd2 -нулевых почках по сравнению с почками дикого типа (Zhou, 2009). Однако, несмотря на повышенную пролиферацию кистозных клеток, на животных моделях ADPKD или тканях пациентов с ADPKD нет грубых цилиарных аномалий, за заметным исключением более длинных ресничек в медленно прогрессирующей гипоморфной мышиной модели патогенной мутации человека (Hopp и др., 2012).Это наблюдение указывает на то, что сильно пролиферирующие кистозные клетки, по-видимому, утратили способность поддерживать координацию прогрессии клеточного цикла и обновления ресничек. Эти данные также согласуются с идеей, что постоянная митогенная передача сигналов на основе ресничек может поддерживать пролиферацию клеток и экспансию кист в клетках, лишенных Pkd1 или Pkd2 . Фактически, мыши с двойными мутантами, лишенные одного из генов полицистина и гена, необходимого для образования ресничек, ift20 или Kif3a , демонстрируют гораздо менее тяжелый фенотип с точки зрения образования кист и пролиферации клеток по сравнению с одиночные мутанты (Ma et al, 2013).Соответственно, ускорение разборки ресничек (Nikonova et al, 2018) подавляет рост кисты и улучшает функцию почек, тогда как замедление разборки ресничек имеет противоположные эффекты в моделях ADPKD у мышей (Nikonova et al, 2014).

Наши исследования, представленные здесь, показывают, что делеция Pkd1 или Pkd2 в нескольких клеточных линиях и MEF приводит к ингибированию индуцированной сывороткой разборки и / или шедирования ресничек и стойкой активации передачи сигналов на основе ресничек.Отсроченная разборка также наблюдается в модели ADPKD у мышей в послеродовой период. Задержка разборки, вызванная потерей Pkd1 , является вторичной по отношению к активации пути центросомной целостности / митотического наблюдения (CI / MS), включающего ось 53BP1-USP28-p53.

Результаты

Удаление

(A) Схема, показывающая введение 4-гидрокситамоксифена (4-OHT) от P2 к P6 и внутрибрюшинную инъекцию EdU на P20. (B) Типичные изображения срезов почек, окрашенных на EdU (зеленый) и ацетилированный α-тубулин (реснички, красный) P21 Pkd1 ^{f / f} или Ubc-Cre ^ERT2 ; Pkd1 ^{f / f} мышей, индуцированных 4-OHT от P2 к P6.Стрелками обозначены клетки EdU ⁺ с ресничками. Звездочки обозначают кисты. Масштабные линейки: 5 мкм. (C) Процент клеток EdU ⁺ с ресничками в Pkd1 ^{f / f} (n = 3) и Ubc-Cre ^ERT2 ; Pkd1 f / ; Pkd1 f / 907 (n = 4) почки. 50–100 EdU ⁺ клеток на животное оценивали на наличие ресничек. Данные представлены как средние значения ± стандартная ошибка среднего. t test, **** P <0.0001.

(A, B) Отношение веса двух почек к массе тела (2 кВт / масса тела) (A) и определение происхождения кисты в P21 Pkd1 ^{f / f} или UbcCre ^ERT2 ; Pkd1 ^{f / f} мышей (B), индуцированных тамоксифеном из P2-P6. Lotus Tetragonolobus Lectin маркирует проксимальные канальцы, а Dolichos Biflorus Agglutinin маркирует собирающие протоки.Масштабные линейки: 30 мкм. Данные представлены как средние значения ± стандартная ошибка среднего. t test, **** P <0,0001. (C) Типичные изображения срезов почек, окрашенных на ацетилированный α-тубулин (реснички, зеленый) и GEMININ (красный) из P21 Pkd1 ^{f / f} или Ubc-Cre ^ERT2 ; Pkd1 ^{f / f} мышей, индуцированных 4-OHT от P2 к P6. Стрелки указывают на ГЕМИНИН-положительные клетки. Масштабные линейки: 5 мкм.

Разборка или выпадение ресничек — это динамический процесс, который трудно повторить in vivo.Таким образом, мы непосредственно протестировали влияние делеции Pkd1 или Pkd2 на индуцированную сывороткой децилиацию в культуре клеток. Поскольку потеря / укорочение ресничек в ответ на сыворотку может быть опосредовано постепенной резорбцией / разборкой ресничек (Пугачева и др., 2007), мгновенным расслоением и / или отслаиванием (Мирвис и др., 2019), мы оценивали клеточные культуры на основе наличия или отсутствие детектируемых ресничек, чтобы объяснить все способы потери ресничек. С этого момента мы адаптируем термин «децилиация» для включения всех форм потери ресничек.Мы использовали три разных типа клеток: MEF, фибробласты NIh4T3 и почечные эпителиальные клетки мыши (mIMCD3). Делеция Pkd1 или Pkd2 , достигнутая либо путем гомологичной рекомбинации в MEF, либо путем редактирования гена CRISPR / Cas9 в NIh4T3 (рис. S2A и B) и mIMCD3 (Kleene & Kleene, 2016), не повлияла на процент мерцательных клеток или длина ресничек после 48 часов сывороточного голодания (рис. S2C), что указывает на отсутствие эффекта делеции Pkd1 или Pkd2 на сборку ресничек.Однако делеция Pkd1 или Pkd2 значительно снижает уровень индуцированной сывороткой децилитации во всех типах клеток, несмотря на различную кинетику среди этих типов клеток (Figs 2A – D и S2D – G).