Что такое органоид биология: Дистанционный репетитор — онлайн-репетиторы России и зарубежья

Рут Леманн

^a HHMI и Институт биомолекулярной медицины Скирболла, факультет клеточной биологии, Медицинский факультет Нью-Йоркского университета, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк 10016

Конни М.Lee

^B

^B Дивизион биологических наук, Чикаго Университета Чикаго, Чикаго IL 60637

Erika C. Shugart

^C Американское общество для клеточной биологии, Bethesda, MD 20814

Marta Benedetti

^D Simons Foundation , New York, NY 10010

R. Alta Charo

^e University of Wisconsin Madison Law School, Madison, WI 53706

Zev Gartner

^f Фармацевтический факультет Калифорнийского университета Сан-Франциско, Сан-Франциско, Калифорния 94158

Бриджит Хоган

^g Кафедра клеточной биологии Медицинского центра Университета Дьюка, Дарем, Северная Каролина 27710

Юрген Кноблих

^ч Институт молекулярной биотехнологии, Австрия 1030 Вена, Австрия

Селеста М.

ⁱ Кафедра химической и биологической инженерии и кафедра молекулярной биологии Принстонского университета, Принстон, Нью-Джерси 08544

Кевин М. Уилсон

^c Американское общество клеточной биологии, Bethesda, MD 208013 David G Друбин, редактор отдела мониторинга

Калифорнийский университет, Беркли

^a HHMI и Институт биомолекулярной медицины Скирболла, кафедра клеточной биологии, Медицинский факультет Нью-Йоркского университета, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк 10016

^b Отделение биологических наук, Университет Чикаго, Чикаго, Иллинойс 60637

^c Американское общество клеточной биологии, Бетесда, Мэриленд 20814

^d Фонд Саймонса, Нью-Йорк, Нью-Йорк 10010

^e Университет Мэдисона, Вискон

^f Факультет фармацевтической химии, Факультет фармации, Калифорнийский университет, Сан-Франциско, Сан-Франциско, Калифорния 94158

^g Кафедра клеточной биологии Медицинского центра Университета Дьюка, Дарем, Северная Каролина 27710

^h Институт молекулярной биотехнологии Австрийской академии наук, 1030 Вена, Австрия Химический

ⁱ Департамент биологической инженерии и кафедра молекулярной биологии Принстонского университета, Принстон, штат Нью-Джерси 08544

Поступила в редакцию 4 марта 2019 г. ; Принято 7 марта 2019 г.

Эта статья распространяется Американским обществом клеточной биологии по лицензии автора (авторов). Через два месяца после публикации он доступен для общественности по лицензии Attribution-Noncommercial-Share Alike 3.0 Unported Creative Commons.

Abstract

Органоиды, полученные из стволовых клеток или тканей в культуре, могут развиваться в структуры, напоминающие in vivo анатомию и физиологию интактных органов. Культуры человеческих органоидов дают возможность изучать развитие человека и моделировать болезненные процессы с той же тщательностью и глубиной анализа, что и обычные для исследований с нечеловеческими модельными организмами. Напоминая по сложности реальную ткань или орган, исследования органов человека, полученные от пациентов, могут ускорить медицинские исследования, открывая новые возможности для тканевой инженерии и регенеративной медицины, генерируя знания и инструменты для доклинических исследований, включая разработку и тестирование лекарств. Биологов привлекает эта система как новый «модельный организм» для изучения сложных фенотипов заболеваний и генетической изменчивости среди людей с использованием тканей, полученных от пациентов. Американское общество клеточной биологии созвало целевую группу, чтобы сообщить о потенциале, проблемах и ограничениях исследований органов человека. Целевая группа предлагает способы облегчить вход новых исследователей в эту область и как способствовать более широкому использованию этого нового модельного организма в исследовательском сообществе. Это включает в себя рекомендации по воспроизводимости, культивированию, обмену материалами пациентов, согласию пациентов, обучению и общению с общественностью.

РЕЗЮМЕ

Достижения в области биологии стволовых клеток возвестили революцию в биологии и медицине. По мере распространения этих технологий на человеческие клетки они проложили путь к открытиям в фундаментальной биологии человека и развитию медицины. Важным недавним шагом в этой революции стала разработка методов создания в контролируемых условиях культивирования трехмерных (3D) структур, известных как органоиды, которые резюмируют развитие и организацию тканей и напоминают органы в организме. Органоиды происходят из возобновляемых источников тканей, которые самоорганизуются в культуре, приобретая in vivo подобную органу сложность. Органоиды могут быть получены из источников клеток человека, включая взрослые тканеспецифические стволовые клетки, эмбриональные стволовые клетки (hESC) и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (hIPSC). Таким образом, у них есть потенциал преодолеть ряд прежних ограничений в биомедицинских исследованиях, направленных на получение механистического понимания развития человека, создание точных моделей заболеваний человека и создание источников тканей, соответствующих пациентам, для регенеративной медицины.

Чтобы оптимизировать потенциал этих новых мощных разработок для ученых, Американское общество клеточной биологии (ASCB) обратилось к целевой группе членов ASCB, включая исследователей, некоторые из которых играют решающую роль в разработке систем органоидов; специалисты по этике; и защитники прав пациентов, чтобы определить возможности для исследований органоидов для биологов, выделить препятствия на пути прогресса и проблемы, а также разработать рекомендации и передовой опыт для повышения воздействия этой новой, быстро расширяющейся и многообещающей области. Обсуждение рабочей группой, а также результаты опроса, разосланного членам ASCB, подтверждают огромный потенциал этих новых «модельных систем», а также демонстрируют вызовы для науки и общества, связанные с этой возможностью. Состав рабочей группы см. в дополнительной информации 1; сводку результатов опроса см. в дополнительной информации 2.

Возможности

• Органоиды дают возможность изучать ткани человека на том же уровне научной тщательности, воспроизводимости и глубины анализа, что обычно возможно только с нечеловеческой моделью. организмы.

• Органоиды позволяют исследователям резюмировать морфогенетические события в развитии человека, которые приводят к образованию тканей и органов.

• Органоиды можно использовать для изучения механизмов болезней, действующих в тканях человека, для получения знаний и инструментов, применимых к доклиническим исследованиям, включая тестирование лекарств.

• Органоиды могут быть получены от любого человека, что позволяет изучать изменчивость среди людей на тканевом уровне, а также клеточные механизмы, приводящие к сложным фенотипам заболеваний.

• Органоиды, напоминающие по сложности ткани и органы, находят широкое применение в тканевой инженерии, разработке лекарств и регенеративной медицине.

Мы предполагаем, что человеческие органоиды могут предоставить фундаментальным ученым возможность проводить механистические исследования в системе «человеческой модели» с приемлемыми этическими ограничениями.

Задачи и рекомендации

• Органоиды повторяют только часть всего тела и могут не точно отражать стереотипные и сложные функции отдельных органов.Таким образом, в отличие от моделей целых животных, органоиды предлагают лишь приблизительное представление о биологии всего органа и не имитируют поведение всего организма. У них отсутствуют ключевые особенности in vivo, такие как определенная ось тела, функциональная иммунная система и полные физиологические сети. Следовательно, результаты органоидов должны быть дополнены исследованиями всего организма в модельных системах и сопоставлены с реальным развитием человека, организацией тканей и физиологией.

• «Золотые стандарты» и лучшие практики должны быть определены для изучения органоидов.Протоколы получения и условий культивирования органоидов должны содержать достаточно деталей для обеспечения воспроизводимости. Необходимо разработать критерии, которые позволят исследователям сравнивать типы и структуры клеток в органоиде с составом и организацией соответствующего органа.

• Долгосрочное развитие исследований органоидов зависит от распределения источников тканей, которые являются возобновляемыми и легко сопоставимыми между лабораториями. Особенно важным для изучения заболеваний является создание банков тканей (биобанков), которые распределяют чТПСК от разных пациентов с одним и тем же заболеванием.Такие биобанки также могут быть центрами распределения контрольных образцов как здоровых людей, так и генетически модифицированных образцов тканей, полученных от пациентов.

• Для образцов ткани, полученных от пациента, в согласии пациента должно быть указано требование о том, что материалы будут использоваться совместно различными учреждениями, исследователями и странами.

• Вход новых исследователей на разных этапах карьеры в эту область следует поощрять и облегчать путем создания учебных центров, где исследователи могут приобретать и адаптировать органоидную технологию.Из-за быстрого развития методов культивирования тканей и сложности материалов и временных рамок, необходимых для создания органоида из возобновляемого источника ткани, либо существующие объекты, либо практикующие лаборатории могут предложить лучшие возможности для обучения, чем более традиционные учебные курсы.

• Потенциал органоидов для исследований и медицины несет с собой этическую неопределенность и озабоченность общественности. Четкое определение того, чем органоиды являются и чем они не являются, а также реалистичное описание возможностей, которые они предлагают, должны быть сформулированы учеными и научными организациями в их сообщениях.

ПРЕДПОСЫЛКИ: БИОЛОГИЯ И ПРОИЗВОДСТВО ОРГАНОИДОВ

Определение органоидов

Мы изучаем органоиды, потому что они представляют собой минимальные и воспроизводимые модели сложной динамики тканей человека во время развития, гомеостаза и болезни. Эти модели могут использоваться несколькими лабораториями, ими легко манипулировать, визуализировать и подвергать биомолекулярному анализу без мешающей сложности, связанной с исследованиями in vivo. При выращивании из клеток человека они облегчают переход от животных моделей к биологии человека с приемлемыми этическими ограничениями.

Органоиды определяются как использование возобновляемого источника ткани, который 1) получают из стволовых клеток или первичной ткани, 2) культивируют в определенной среде, 3) самоорганизуются в структуру, имитирующую здоровую или больную смоделированную ткань , 4) включает в себя многие аспекты клеточной сложности смоделированной ткани, и 5) может быть размножен и распространен либо как сама культура, либо через определенную популяцию стволовых клеток или клеток-предшественников.

Краткая история

Культура органоидов основана на методологии 3D-культуры клеток, разработанной в прошлом столетии.Еще в 1906 году так называемый метод висячей капли позволял культивировать клетки в 3D (подробную историческую перспективу см. в Harrison, 1906, и Simian and Bissell, 2017). Нынешний бум исследований органоидов является результатом возможности выращивать органоиды из клеток или тканей, полученных от людей, что раскрывает их огромный потенциал для биологии человека и медицинских исследований (Dekkers et al. , 2013; Lancaster et al. , 2013). . Для целей этого отчета мы сосредоточимся в первую очередь на возможностях и проблемах, связанных с человеческими органоидами, а не на органоидах, полученных из клеток и тканей животных.

Человеческие органоиды как новый модельный организм для исследований

В течение последних нескольких десятилетий биомедицинские исследования проводились почти исключительно на животных моделях. Хотя это привело к глубокому пониманию многих фундаментальных биологических процессов, оно оставило пробелы в нашем механистическом понимании специфических для человека процессов развития, клеточных биологических, физиологических и связанных с болезнями событий. Кроме того, разнообразие человеческих особей резко контрастирует с генетической однородностью инбредных моделей животных, что приводит к дефициту наших знаний о разнообразии популяций. Действительно, это отсутствие модельных систем человека, возможно, способствовало низкому показателю успеха в клинических испытаниях фармацевтических соединений, разработанных на животных моделях.

С появлением моделей человеческих органоидов эта ситуация, кажется, должна измениться. Впервые органоиды дают возможность индивидуально изучать сборку тканей человека. Органоиды позволяют повторить многие морфогенетические события, ведущие к образованию ткани. Потенциально они могут быть получены от любого человека, здорового или больного.Таким образом, как изменчивость среди людей, так и специфические для человека клеточные механизмы, которые приводят к фенотипам заболеваний, могут быть проанализированы напрямую.

Однако органоиды человека как модельная система имеют ограничения. В отличие от животных моделей, органоиды предлагают лишь приблизительное представление о биологии человеческого тела. У них отсутствуют ключевые особенности in vivo, такие как определенная ось тела, функциональная иммунная или нервная система или функциональная сосудистая сеть. Следовательно, хотя органоиды могут рассказать нам о специфических для человека аспектах развития органов и физиологии, в настоящее время они менее полезны для раскрытия аспектов биологии, которые зависят от интегрированных физиологических систем и сложного взаимодействия систем органов человека.Какие бы результаты мы ни нашли в органоидах, они будут полезны только в сравнении с фоном знаний, определенным в других модельных системах. В этом смысле органоиды сами по себе являются новой модельной системой, которая дополняет, а не превосходит существующие модели животных.

Органоиды могут быть созданы различными способами, воспроизводящими либо развитие органов, либо регенерацию органов. В своей простейшей форме органоиды генерируются из стволовых клеток ткани взрослых, культивируемых в присутствии факторов роста и матрикса, обычно обеспечиваемого нишей стволовых клеток.Такие культуры могут содержать все типы клеток, полученные из стволовых клеток in vivo, либо во время нормального тканевого обновления, либо во время восстановления после повреждения, и могут повторять аспекты их трехмерного расположения. В качестве альтернативы органоиды могут быть получены из PSC, включая ESC или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC). Это достигается путем культивирования их в определенной серии коктейлей факторов роста или сред, которые индуцируют органоспецифические клеточные судьбы в последовательности, имитирующей нормальное развитие. Окончательный конгломерат органоспецифических типов клеток может располагаться таким же образом, как и в реальном органе, что позволяет анализировать морфогенетические и физиологические процессы «в чашке».

Опрос членов ASCB (см. Дополнительную информацию 2) показал, что в то время как более 90% респондентов используют человеческие клетки в культуре, менее 30% используют человеческие органоиды. Среди основных узких мест, которые назвали респонденты, были трудности с выращиванием органоидов и доступность тканей человека для инициации культур. Значительное количество комментариев указывало на проблемы воспроизводимости и стоимости, и многие респонденты задавались вопросом, насколько хорошо органоиды на самом деле моделируют биологию человека. В этом отчете мы излагаем возможности для исследования органоидов, рассматриваем проблемы и даем рекомендации по использованию человеческих органоидов для добавления в репертуар «модельного организма».

ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЙ ОРГАНОИДОВ

Органоиды предлагают множество захватывающих экспериментальных применений, начиная от лучшего понимания развития человека и заканчивая созданием клинических моделей для тестирования лекарств и регенеративной медицины. Учитывая быстрый прогресс, мы считаем, что приведенные ниже приложения дадут представление о том, что может произойти в будущем.

Биология развития человека

Изучение развития человека в основном ограничивалось обсервационными исследованиями преимплантационных эмбрионов или клеток-предшественников и тканей, выделенных из абортированных плодов. Например, в последнем случае органоспецифические клетки-предшественники выделяют из тканей плода и выращивают в культуре в условиях, в которых они продолжают расти и дифференцироваться (Nikolic et al. , 2017). Однако появление множества моделей органоидов, полученных из ИПСК, открыло путь к динамическому наблюдению и механистическим исследованиям человеческого развития.

Существует два основных подхода к изучению развития человека с использованием моделей органоидов, полученных из ИПСК. Во-первых, органоспецифические предшественники генерируются из iPSCs путем прохождения их через последовательность воздействий определенных факторов. После дальнейшего культивирования предшественники самоорганизуются в органоиды, представляющие развивающийся орган. Этот подход уже обеспечил глубокое понимание морфогенеза нескольких систем органов и, что более интригующе, начинает проливать свет на то, как генетика человека влияет на болезни развития мозга, легких и кишечника (Perez-Lanzon et al., 2018).

При втором подходе иПСК принуждают образовывать клеточные агрегаты, которые имитируют сам ранний преимплантационный эмбрион. Эти структуры, известные как эмбриоиды или гаструлоиды, автономно проходят ранние стадии развития. Прогресс в этой области значительно ускорился в последние годы, даже вопреки правилу, которое ограничивает культивирование человеческих эмбрионов сроком более 14 дней, стадии, когда мезодермальные клетки обычно образуются в примитивной полоске (Hyun et al., 2016). Эти исследования выявили различия между самыми ранними стадиями развития человека и модельных организмов, таких как мыши, например, в установлении эмбриональных осей и спецификации первичных зародышевых клеток (Irie et al. , 2015; Kobayashi and Surani, 2018; Мартин и др. , 2018). Они предлагают возможность дальнейшего понимания раннего развития человека, позволяют проводить эволюционные исследования видовой специфичности событий раннего развития и создают новую модельную систему, имеющую отношение к основным причинам ранней потери беременности у человека.

Моделирование болезней человека

Помимо моделирования человеческого развития, клеточная сложность и трехмерная организация органоидов обеспечивают уникальную платформу для определения механизмов болезней взрослого человека. Клеточная организация органоидов может быть изучена на системном уровне благодаря достижениям в области функциональной геномики и протеомики, включая анализ отдельных клеток и высокопроизводительную транскриптомику, протеомику и крупномасштабную характеристику доменов хроматина и регуляторных элементов транскрипции.Этот уровень детального анализа трудно достичь с тканью человека, взятой на месте, и он обеспечит более полное понимание развития и клеточного состава органоидов. Более того, эта информация повысит их актуальность в качестве моделей для изучения морфологии, функций и заболеваний органов и откроет новые возможности в разработке лекарств и регенеративной медицине. Например, клеточное разнообразие развивающихся органоидов головного мозга было использовано для моделирования генетической микроцефалии (Lancaster et al., 2013), чтобы определить потенциальные механизмы, с помощью которых вирус Зика приводит к микроцефалии (Dang et al. , 2016; Garcez et al. , 2016), а органоиды толстой кишки использовались для изучения мутационных стадий, лежащих в основе опухоли. инициация и развитие (Drost et al. , 2017). Наконец, органоиды, полученные от пациентов, использовались для обобщения прогрессирования пигментного ретинита (Deng et al. , 2018), для изучения роли нейроглии в нейродегенеративном заболевании (Abud et al., 2017), а также для моделирования кистозного фиброза в органоидах дыхательных путей человека (McCauley et al. , 2017).

Тканевая инженерия и регенеративная медицина

Полученные из ИПСК органоиды обладают огромным потенциалом для применения в тканевой инженерии и регенеративной медицине. Эти небольшие ткани обладают многими характеристиками эмбриональных тканей, которые, как было показано ранее, обладают регенеративным потенциалом при имплантации in vivo. Например, кишечные органоиды, полученные из hIPSC, включающие как энтодерму, так и мезодерму, дифференцируются в полностью васкуляризированный кишечник при имплантации мышам с ослабленным иммунитетом.Кроме того, имплантированные органоиды включают структурные особенности высокого уровня, такие как ворсинки, которые не наблюдаются при культивировании органоидов in vitro (Spence et al. , 2011; Munera et al., 2017). Дополнительными тканями, которые, как было показано, обладают регенеративным потенциалом, являются легкие, кожа и волосы (Hirsch et al. , 2017). Другие исследователи изучают органоиды в качестве регенеративной терапии заболеваний печени (зачатки органов) и глаз (глазные бокалы) (Huch et al., 2017; Мандай и др. , 2017).

Персонализированная медицина

Одно из интригующих применений органоидов, полученных от пациентов — будь то из ИПСК или взрослых стволовых клеток/клеток-предшественников — это клинические модели для конкретных пациентов, которые помогают в идентификации лекарств или комбинаций лекарств для лечения заболеваний. Эта концепция уже нашла некоторый успех. Например, кишечные органоиды использовались для выявления пациентов, которые однозначно реагируют на дорогостоящую терапию муковисцидоза (Dekkers et al., 2013).

Доклиническое моделирование заболеваний/лекарственный скрининг

В отчете Центра изучения разработки лекарственных средств Тафтса описывается средняя стоимость разработки рецептурного препарата для его утверждения на рынке в размере 2,6 миллиарда долларов. Эти расходы обусловлены главным образом высокой частотой неудачных попыток (∼88%) лекарств, которые тестируются на людях (DiMasi et al. , 2016). Таким образом, органоиды могут предоставить уникальную модель заболевания тканей человека для использования в тестах на лекарства или в доклинических моделях.Например, скрининг более 6000 одобренных лекарств в клетках-предшественниках коры головного мозга, полученных из hIPSC, выявил несколько соединений, которые обладали защитным действием при тестировании на органоидах головного мозга человека (Zhou et al. , 2017). В дополнение к потенциальному перепрофилированию существующих лекарств скрининг на основе органоидов также можно использовать для открытия новых мишеней для лекарств.

Чтобы в полной мере воспользоваться огромным потенциалом, который могут предложить исследования органоидов, необходимо решить несколько серьезных проблем.Эти проблемы включают воспроизводимость, разработку золотых стандартов для различных систем органов, стандартизированные механизмы обмена тканями и опытом, способы получения согласия пациента и прозрачность в общении с общественностью. Эти вопросы подробно обсуждаются ниже.

ВОСПРОИЗВОДИМОСТЬ В ИССЛЕДОВАНИЯХ ОРГАНОИДОВ

Полезность органоидов в биомедицинских исследованиях в значительной степени зависит от того, насколько воспроизводимы их результаты в различных анализах или протоколах дифференциации.Это верно независимо от того, проводятся ли исследования в одной и той же лаборатории или в разных лабораториях с использованием общих ячеек или экспериментальных протоколов. Факторы, влияющие на воспроизводимость, будут варьироваться в зависимости от типа и сложности анализа и источника инициирующих клеток, например, являются ли они хорошо охарактеризованными клеточными линиями или первичными стволовыми клетками, полученными из эмбриональных или взрослых тканей. Контроль качества для снижения изменчивости чрезвычайно важен, если органоиды должны выращиваться в больших количествах для клинических испытаний.

Здесь невозможно обсудить все потенциальные источники изменчивости в культуре органоидов, но некоторые из наиболее важных соображений приведены ниже. Предполагается, что академические исследователи следуют основным принципам «строгости и воспроизводимости» в своих экспериментах. Эти принципы включают стандартизацию номенклатуры, количество повторов, статистический анализ, рандомизацию, ослепление, оценку размера выборки и прозрачность отчетности.

Генетическая и эпигенетическая изменчивость клеток человека

Генетическая изменчивость менее важна для воспроизводимости анализов с использованием инбредных клеточных линий мыши.То же самое относится и к первичным стволовым клеткам, если они получены из инбредных штаммов. Ряд хорошо охарактеризованных чЭСК также доступен для исследований, например, HUES1 и HUES9 (https://grants.nih.gov/stem_cells/registry/current.htm; http://stemcelldistribution.harvard.edu/). . В какой-то степени эти линии, полученные из эмбрионов, полученных от явно «нормальных» доноров, можно считать золотым стандартом для проверки воспроизводимости анализов органоидов в разных лабораториях.

Потенциальная изменчивость в анализах из-за генетического фона может возникнуть с hiPSC, особенно полученными от пациентов с мутациями, связанными с риском наследственного заболевания различной степени тяжести и пенетрантности. В этих случаях фенотип дифференцированных клеток может зависеть от генетического фона, в котором лежит мутация. Теоретически иПСК, полученные от разных пациентов с одной и той же мутацией, могут по-разному вести себя в органоидных культурах. Следовательно, в исследованиях органоидов следует использовать линии ИПСК, полученные от нескольких пациентов, и, в идеале, исследователи должны быть готовы поделиться этими различными линиями с другими лабораториями, чтобы можно было сравнить результаты.Для заболеваний, при которых известен специфический генетический дефект, могут быть созданы и распространены клеточные системы «модели заболевания», в которых генетический дефект корректируется с помощью CRISPR-Cas9 в клетках пациентов или генетический дефект воссоздается в нормальных контрольных клетках. Исследования, подтверждающие принцип, были предоставлены на клеточных линиях пациентов с мышечной дистрофией и муковисцидозом (Simsek et al. , 2016; Min et al. , 2019).

Выделение стволовых клеток из первичных тканей

В некоторых органоидных анализах используются стволовые клетки, выделенные из первичных тканей человека.Изменчивость может исходить от методов, используемых для выделения и очистки клеток. Например, клинические образцы могут храниться в течение разного времени, протеазы, используемые для диссоциации ткани, могут различаться по эффективности или условия сортировки клеток могут различаться по-разному (например, размер сопла, давление потока, стробирование и источник антител). к поверхностным маркерам; рассмотрено в Hines et al. [2014]). Поэтому важно, чтобы в протоколы изоляции было включено как можно больше технических деталей.

Условия, при которых поддерживаются клеточные линии или стволовые клетки

Исследователи, плохо знакомые с клеточными культурами и анализами органоидов, должны знать, что клетки могут со временем меняться в культуре, включая потерю способности к дифференцировке. Например, возможен выбор быстрорастущих вариантов или изменение поведения из-за разного состава коммерчески доступных сред (например, разных уровней глюкозы и кальция), разных партий фетальной бычьей сыворотки, компонентов замещающей сыворотки, фактора роста и микоплазмы. загрязнения и др.Эти потенциальные источники изменчивости описаны в основных руководствах по культуре клеток. Клеточные линии должны быть заморожены в аликвотах, а подробные записи должны содержать количество пассажей и другие переменные.

Проведение анализов органоидов

Важным источником изменчивости как между лабораториями, так и между экспериментами могут быть условия выращивания органоидов. Проблемы делятся на несколько категорий, в том числе изменчивость чистоты факторов роста в партиях, различия в воздействии на клетки уровня кислорода в многолуночных планшетах и ​​изменчивость степени и скорости созревания дифференцированных типов клеток.Эти переменные могут быть объединены, если органоиды получены из комбинации различных типов клеток, таких как «мультиплексные» органоиды, в которых эпителиальные, стромальные, эндотелиальные и иммунные клетки агрегированы вместе. Изменчивость также может быть связана с использованием различных протоколов индукции. Например, протокол, разработанный для индукции энтодермы задней кишки человека из ИПСК, также генерирует небольшое количество мезодермы, которая имеет правильный паттерн задней боковой пластинки и дает начало гладким мышцам, тогда как протоколы для индукции передней энтодермы не генерируют ассоциированную мезодерму (Munera and Wells). , 2017; McCauley et al., 2018).

Важно отметить, что органоиды полезны только в том случае, если они приближаются к воспроизведению реального органа на месте. Для сравнения использовались различные критерии, такие как описание типов клеток, образованных с использованием экспрессии РНК на уровне одной клетки, антител или генетически кодируемых маркеров; реконструкция всего органоида из 3D в 4D для определения общей морфологии, расслоения и регионального паттерна; и, наконец, разработка тестов для оценки физиологии и функции конкретного органоида.Последнее может включать трансплантацию и функциональную интеграцию в животное-хозяин, как это было показано для моделей кишечника (Fumagalli et al. , 2017; Munera et al. , 2017). Надежная проверка достигается путем сравнения этих структурных и функциональных показателей с соответствующим органом в другой модельной системе, такой как мышь, свинья и примат, или в реальной ткани человека.

Выводы и рекомендации

Учитывая потенциальные источники изменчивости, рассмотренные выше, можно сделать ряд рекомендаций:

• Крайне важно, чтобы протоколы для органоидов были подробно описаны в первоначальных публикациях, а источники реагентов, используемых на каждом этапе (выделение клеток, условия культивирования органоидов, методы индукции дифференцировки, выделение дифференцированных типов клеток), были предоставлены.

• Передача знаний наиболее эффективна посредством посещений лабораторий, объектов и хранилищ, которые регулярно культивируют и выращивают органоиды (для дальнейшего обсуждения см. Обучение исследованиям органоидов ниже).

• Критерии (транскриптомные профили, наборы поверхностных антител, трехмерная реконструкция, анализ отдельных клеток и поведение после трансплантации) должны быть установлены для сравнения дифференцированных типов клеток и структур, полученных в органоидах, с типами клеток и тканевой организацией, присутствующими в норме. ткани.

• Вполне вероятно, что генетический фон может влиять на поведение ИПСК, несущих мутации, связанные с заболеванием. Поэтому рекомендуется, чтобы линии были получены и сохранены от нескольких пациентов. Чтобы максимизировать полезность этих банков, согласие пациента должно включать возможность совместного использования их между различными учреждениями и исследователями (для дальнейшего обсуждения см. Получение тканей и согласие пациента в исследованиях органоидов и Совместное использование материалов и результатов ниже).

ПОИСК ТКАНЕЙ И СОГЛАСИЕ ПАЦИЕНТА НА ОРГАНОИДНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Важно обеспечить достаточное количество тканей человека, уважая при этом пожелания доноров и сохраняя доверие общественности к добросовестности исследований и усилий по медицинскому применению. В случае с биообразцами, полученными от человека, процесс получения согласия является важной частью исследования, призванного защитить права и благополучие лиц, участвующих в исследовании, и уважать достоинство и автономию этих лиц, предоставляя им возможность выбора, помогать или нет. исследование (Huch et al., 2017).

Определение для сбора тканей

Как и раньше, работа с человеческими тканями вызывает ряд опасений и регулируется правовыми нормами и ограничениями финансирования, которые различаются в зависимости от страны и на уровне штата в США.

Ткань, все еще in situ, взята у живых или неживых людей

Для живых людей взятие ткани in situ предполагает вторжение в их тело и требует добровольного и информированного согласия.Прикосновение к телу живого человека без надлежащего согласия и таким образом, который может быть вредным или оскорбительным, является вмешательством в общепринятые представления о личной автономии и является незаконным во многих национальных правовых системах, в том числе в Соединенных Штатах.

Ткани, взятые у умерших людей, могут вызвать вопросы о том, кто имеет право давать согласие на донорство. Во многих законодательных органах, таких как Соединенные Штаты, умерший человек не считается человеком-субъектом исследования с целью инициирования федеральных правил исследовательской этики.Тем не менее, в некоторых юрисдикциях ткани рассматриваются как находящиеся в распоряжении кого-то, кроме государства или исследовательского сообщества, так что, например, может потребоваться согласие близкого родственника. Наконец, из-за религиозных, этнических или национальных обычаев взятие ткани у умершего может считаться правонарушением, а некоторые виды исследований (например, изучение прошлых перемещений населения и моделей расселения) могут представлять культурную или даже политическую проблему.

Ткань ex vivo

Ткань ex vivo включает «брошенную ткань», такую ​​как хирургические отходы или «подаренная ткань», когда она взята с согласия, как указано выше, или принципиально «измененные ткани», такие как клеточные линии.Национальные правила различаются в зависимости от того, считается ли это какой-либо формой собственности лица, у которого оно было взято. Такие правила могут применяться, если имеется достаточно информации, включенной в образец или прикрепленной к образцу, так что первоначальный источник/донор может быть идентифицирован. В этом случае источник/донор является предметом исследования всякий раз, когда изучается ткань, и если личность не будет достаточно скрыта, это вызовет одобрение и защиту интересов донора.

Регуляторные советы

В целом, если ткань берется специально для исследовательских целей, применяются национальные правила проведения исследований, и во многих системах это предполагает не только информированное согласие, но и некую форму независимого надзора для обеспечения того, чтобы исследование добросовестно и защищены интересы участников.В Соединенных Штатах, например, он в большинстве случаев подлежит надзору со стороны институционального наблюдательного совета (IRB) и некоторых федеральных правил, закрепленных в Общем правиле. Федеральное регулирование и требования IRB формально вступают в силу, когда исследование финансируется одним из федеральных агентств и департаментов, принявших Общее правило, но во многих других случаях исследование проводится в условиях добровольного соблюдения.

Даже если согласие получено, может оказаться необходимым проверить, распространяется ли оно на все исследования или, по крайней мере, на конкретное планируемое исследование.Некоторые исследования органоидов могут быть настолько тревожными для некоторых представителей общественности, что это станет актуальным. По этой причине процесс получения ткани от доноров может потребовать включения информации о диапазоне предполагаемых применений и возможностях будущего использования, которые еще не рассматривались. Например, работа с тканями, полученными из банка тканей, может потребовать внимания к тому, известны ли личности источника/донора и, если да, то можно ли их скрыть. Если нет, то, возможно, потребуется получить согласие, за исключением случаев, когда от согласия можно отказаться на основании исключений для таких ситуаций, как минимальный риск и необоснованные затраты на связь с донором.Для получения дополнительной информации о том, как управлять тканями, полученными до начала исследования ИПСК или органоидов, см. обсуждение в Lomax et al. (2015) .

Для конкретных исследовательских целей учреждениям может быть целесообразно иметь специализированные исследовательские советы, обладающие конкретными знаниями в области технологий и применений стволовых клеток. Конкретные исследования человеческих эмбрионов, которые теперь возможны с новыми методами культивирования, могут потребовать дополнительных надзорных комитетов, которые рассматривают, одобряют и контролируют любые исследования, включающие исследования органоидов на раннем этапе развития человека или направленные на получение человеческих гамет с неявной целью изучения оплодотворения или использования в экстракорпоральном оплодотворении. (ЭКО).

Было опубликовано несколько руководств и обсуждений на тему согласия; см., например, Руководство по исследованию стволовых клеток и клиническому переводу , опубликованное Международным обществом исследований стволовых клеток www.isscr.org/docs/default-source/all-isscr-guidelines/guidelines-2016/isscr-guidelines- for-steam-cell-research-and-clinical-translation.pdf).

Элементы согласия

Когда участник исследования или родитель/опекун участника исследования дает согласие, необходимо указать следующее:

• Каковы непосредственные исследовательские цели и предполагаемое использование в будущем, а также известные риски и выгоды (если таковые имеются) от собираемой информации?

• Желает ли донор повторно связаться с ним для дополнительных целей в будущем или он/она предпочитает разрешить использование ткани без дальнейшего согласия? Участника также следует спросить, существуют ли какие-либо конкретные виды использования, на которые донор не дает согласия.

• Если донор ткани должен быть идентифицирован, как будет храниться медицинская и личная информация и идентификационные данные донора? Как она будет защищена и по каким правилам она будет храниться в тайне или распространяться среди других исследователей? Кроме того, планируется ли возвращать результаты исследований участникам? Если да, то следует обсудить обстоятельства, вызвавшие такое возвращение.

• Если донор ткани будет невозможно идентифицировать в результате исследования образца, донор должен понимать, что обезличенные данные и биообразцы будут переданы исследователям и/или помещены в центральные базы данных и биобанки.

• Участник должен быть проинформирован о том, что клетки крови, биоптаты кожи (фибробласты) или другие ткани (например, волосы) могут быть использованы для получения ИПСК и органоидов, особенно если ткань собирается в контексте более крупного исследования ( генетика/геномика, например), и образцы будут заморожены для будущего использования. Должно быть предоставлено согласие на отказ, если донор или его родственники прямо соглашаются на использование, или, что более желательно, но менее вероятно, согласие на отказ, когда должны быть указаны исключения.

• Участник должен получить разрешение на привязку любых медицинских, клинических и генетических данных к биообразцам и их производным. Участника также следует попросить связать любые медицинские, клинические и генетические данные с данными членов его семьи, если они также участвуют в том же исследовании.

• Участнику должна быть предоставлена ​​возможность отказаться от участия в исследовании с пониманием того, что материал, возможно, уже был распространен, использован или может быть использован в будущем в исследовательских целях и сообщен в опубликованных журнальных статьях или на конференциях.

• Исследования органоидов могут дать важную информацию о конкретных заболеваниях и даже лечении. Таким образом, пациенты, которые пожертвовали свои клетки или ткани с общего согласия, тем не менее должны иметь возможность узнать о результатах своих органоидов.

Рекомендации для будущего сбора

Правила в отношении необходимости и степени согласия сильно различаются в зависимости от источника ткани. Мы обсудим только рассмотрение будущего сбора тканей.

• Для живых доноров следует отличать неидентифицируемые ткани (часто в случае хирургических отходов, когда собирается только информация о заболевании) от идентифицируемых тканей (где информацию о донорах можно получить путем изучения ткани).

• Для умерших лиц согласие должно быть основано либо на ранее выраженном желании умершего лица, либо на согласии ближайших родственников.

• Для неидентифицируемой ткани согласие не требуется, но может потребоваться, если тип исследования (например,г., трансплантация, образование эмбриоидов, гаструлоидов или зародышевых клеток/гамет) могли бы расстроить, если бы донор задумался об этом. Для этого типа исследований рекомендуется обсудить с IRB (или эквивалентным надзорным органом, если он находится за пределами США), важно ли обращаться к донорам за дополнительным согласием.

• В отношении идентифицируемой ткани следует давать согласие на использование, отдавая предпочтение как можно более широкому разрешению на ожидаемое и непредвиденное использование, включая широкое распространение среди учреждений по всему миру.Обратите внимание, что это требует некоторой степени воображения при описании возможного будущего использования ткани.

• Если невозможно получить самое широкое согласие, забор ткани не следует проводить или только распределять с учетом конкретных ограничений. Новые технологии электронной записи могут упростить управление различными ограничениями, налагаемыми каждым донором.

• Уникальный идентификатор, такой как GUID (глобальные уникальные идентификаторы), первоначально разработанный сообществом исследователей аутизма, создает общий идентификатор субъекта для участников исследования в исследовательских лабораториях и репозиториях и рекомендуется исследователям в других областях в качестве инструмента для поделиться данными (https://ndar.nih.gov/tools_guid_tool.html)

ОБМЕН МАТЕРИАЛАМИ И РЕЗУЛЬТАТАМИ

Исследования продвигаются путем обмена результатами и данными. Мы предлагаем четкие рекомендации по обмену и передаче результатов и материалов, полученных в результате исследований органоидов, и предлагаем более широкое использование поддерживаемых государством биобанков в качестве центров для улучшения и координации распространения, обучения и обмена. Распространение через банки данных и тканей весьма желательно в будущем. Несколько банков и центров органоидов уже существуют в Японии, США и Европе (van de Wetering et al., 2015; Сакс и др. , 2018; Такебе и др. , 2018; Ян и др. , 2018).

Эти биобанки могут предложить несколько преимуществ для исследования органоидов:

• Установите стандарты качества сохранности материалов.

• Разработка стандартных процедур для органоидной культуры.

• Пройти обучение.

• Уважайте и применяйте ограничения, установленные донором через хранилища данных.

• Содействовать общению с донором для получения специального согласия (например, трансплантация, создание эмбрионов или манипуляции с зародышевыми клетками/гаметами).

• Распространяйте материалы с точной информацией, подробно описывающие протоколы контроля качества, используемые для создания и обслуживания клеток, тканей, органоидов.

• Собирайте и распространяйте биологические образцы для широкого распространения, которые были модифицированы отдельными лабораториями, например, для исправления определенного генетического дефекта.

Руководство по коммуникации и обмену

• Данные и образцы для исследований должны быть доступны для использования утвержденными исследователями без географических ограничений.

• Данные и биообразцы должны быть распространены после того, как запрашивающий утвержденный исследователь и его учреждение согласовали и подписали соответствующее соглашение о передаче материала (MTA) и, при необходимости, представили разрешение IRB/освобождение от своего учреждения.

• В интересах быстрого распространения данных и выводов, расширения знаний и воспроизводимости данных MTA должен включать формулировку в поддержку обмена данными.

• Исследователи должны согласиться вернуть сгенерированные данные и модифицированные биообразцы в биобанк или сделать материалы доступными в оговоренное время или к моменту публикации, в зависимости от того, что наступит раньше. Формулировка обмена может поощрять или требовать депонирования результатов в www.bioRxiv.org или аналогичный сервер препринтов для обеспечения свободного доступа.

ОБУЧЕНИЕ ОРГАНОИДНЫМ ИССЛЕДОВАНИЯМ

Успех любой исследовательской области, метода или приложения напрямую зависит от относительного опыта и подготовки ученых, выполняющих работу.Экспериментальные подходы, которые просты в реализации, также легче распространять, с коммерциализацией или без нее. Более сложные протоколы, в том числе генерация и характеристика органоидов, требуют большого опыта в выполнении процедур до мастерства. С такими технологиями «неспособность» воспроизвести предыдущую работу не обязательно означает, что ранее опубликованные исследования были ошибочными; в равной степени вероятно, что «искусство» проведения процедуры не было успешно передано и/или освоено второй группой исследователей.Эта фундаментальная проблема имеет серьезные последствия для любой области, зависящей от сложных экспериментальных протоколов.

Увеличение числа ученых, обученных работе с органоидами, будет иметь важное значение для решения нескольких ключевых вопросов:

• Решение проблем и неопределенностей, связанных с воспроизводимостью. Пока критическая масса исследователей в разных учреждениях не будет обучена надежным и последовательным методам создания органоидов, будет сложно понять, в какой степени возникает изменчивость из-за технических различий по сравнению с генетическими (или биологическими).

• Устранение узких мест в исследованиях органоидов. Пока обучение не станет надежным и доступным, количество лабораторий, проводящих исследования с использованием органоидов, будет оставаться ограниченным, что напрямую ограничивает количество вопросов, которые будут задаваться с использованием этой технологии.

• Расширение использования органоидов в трансляционных областях, включая скрининг новых терапевтических средств и регенеративной медицины.

• Использование органоидов для расширения новых границ исследований.Это может включать, например, всестороннее описание типов клеток в организме и их организации в ткани. Усилия по тканевой инженерии могут привести к созданию более реалистичных органоидов, которые больше напоминают орган in vivo, включая васкуляризацию, иннервацию и поддержку иммунной системы.

Область будет процветать только тогда, когда у нас будут надежные и надежные методы обучения. Мы признаем, что существуют как проблемы, так и возможности, связанные с разработкой и реализацией возможностей обучения.Проблемы включают тот факт, что практическое обучение этим протоколам затруднено, и протоколы могут быть сложными для воспроизведения в разных географических точках. Развитие хорошо структурированных органоидов требует длительных периодов времени (многие месяцы или годы) и не может быть легко переведено с одного типа органоида на другой. Кроме того, для получения и культивирования органоидов требуется инфраструктура, несколько опытных сотрудников и институциональная поддержка. Эти проблемы затрудняют распространение подробных знаний о культивировании органоидов в новых лабораториях на типичных краткосрочных практических курсах, таких как те, которые в настоящее время используются для обучения экспериментам с модельными организмами.

Таким образом, необходимо найти альтернативы существующим методам обучения, которые уже существуют в ограниченном количестве мест. К ним относятся основные объекты стволовых клеток, которые можно расширить, чтобы обеспечить учебную платформу, которая может включать программы посещения, открытые для людей из разных учреждений. Такие программы могут по существу закрепить искусство на практике с помощью протоколов, которые они выбирают для обучения, и могут включать такие темы, как культивирование и получение hPSCs, выделение тканеспецифических стволовых клеток или тканевых эксплантатов, дифференцировка в органоиды человека, генетические манипуляции, в том числе основанные на CRISPR и функциональные геномные подходы с разрешением одной клетки.Такие объекты также станут механизмом и средой для обмена знаниями и сотрудничества, объединяя экспертов в области культуры органов, робототехники и инженерии, микроскопии и анализа изображений, криоконсервации и исследований на животных моделях. Примеры совместных средств, стремящихся к клиническому переводу, см. в Takebe et al. (2018 г.) и Ян и др. (2018) .

Выводы и рекомендации

• Учебные заведения должны стимулировать распространение искусства культивирования органоидов и способствовать обмену опытом и знаниями между исследователями между учреждениями.

• Обмен исходными материалами имеет решающее значение для обучения и распространения.

• Для обучения и увеличения количества исследователей в этой области в следующем поколении необходимо использовать передовые методы исследования органоидов.

СВЯЗЬ С ОБЩЕСТВЕННОСТЬЮ

С момента зарождения медицинской науки поступательные шаги в понимании лечения или механики болезней обеспечили значительный прогресс в медицинской помощи. Эти достижения, однако, часто выходили за рамки того, что считается социально приемлемым, и не всегда встречали немедленное общественное признание.

Общественная настороженность, культурные и религиозные барьеры часто стоят на пути немедленного принятия некоторых из этих достижений. Примеры включают донорство и трансплантацию органов, ЭКО и другие передовые медицинские исследовательские процедуры. Эта неуверенность общественности, а иногда и прямое противодействие, часто приводила к снижению общественного признания новых медицинских достижений и в последние годы приводила к политически мотивированным попыткам наложить политические ограничения (запреты на финансирование и, в некоторых случаях, уголовные наказания) в отношении научных исследований.Примеры включают рекомбинантную ДНК (1970-е годы), исследования стволовых клеток (2000-е годы), исследования тканей плода (1990-е годы, 2016-настоящее время), редактирование генов (2016-настоящее время) и митохондриальную заместительную терапию (2016-настоящее время).

Большая часть исследований с использованием органоидов финансируется Национальным институтом здравоохранения, Европейским Союзом, Министерством образования Японии и другими государственными фондами. Таким образом, ученые обязаны открыто сообщать общественности о результатах своих исследований и их последствиях, не преувеличивая их.Исследователи также должны быть прозрачны в отношении источников материала, используемого для создания органоидов. Признание этических проблем, связанных с этой областью, также важно.

Во время дебатов в Соединенных Штатах по поводу федеральной поддержки исследований с использованием чЭСК защитники исследований, включая ученых, были осторожны, чтобы не обещать излечение в результате исследований, которые в то время находились только в зачаточном состоянии. Ученым было предложено обсудить потенциал и перспективы этой области в случае успеха их исследований.

Крайне важно, чтобы ученые знали свою аудиторию. В целом общественное мнение об ученых и поддержка науки довольно позитивны, но могут сильно различаться в зависимости от расы, пола, возраста, образования, региона и политической принадлежности. Публичная аудитория также с большей вероятностью поначалу будет настороженно относиться к новым областям исследований. Американцы стали больше принимать исследования hESC с течением времени, поскольку в период с 2000 по 2013 год продолжались общественные и политические дебаты, потому что у них было время узнать об области исследований и освоиться в ней.Поскольку исследование органоидов является новой областью и предоставляет исследователям новые инструменты для их исследований, они должны поделиться своим волнением по поводу того, как эти инструменты помогут им достичь своих исследовательских целей. Также важно заверить неспециалистов в том, чем органоиды не являются. Например, органоиды мозга — это , а не полных мозга. Они не могут полностью заменить функцию мозга, а поле не воспроизводит сознание в тарелке. То же самое можно сказать и об органоидах других органов тела.Кишечные органоиды не копируют кишечник, а органоиды сетчатки не являются глазами и не обладают зрением. Одной лекцией поддержки не добиться. Как и в других областях исследований, широкой общественности потребуется время, чтобы адаптироваться, и научное сообщество должно будет приложить постоянные усилия в области образования и диалога, особенно по мере дальнейшего прогресса.

По мере того, как исследования продвигаются вперед, а клиническое применение становится все более очевидным и реальным, исследования органоидов будут привлекать к себе повышенное внимание средств массовой информации.Это сыграет важную роль в просвещении общественности и поможет сформировать любые возникающие политические дебаты. Поэтому исследователям органоидов следует подумать об обучении журналистов этой области исследований, даже если они не решаются сделать это. Исследователи, не имеющие предыдущего опыта или подготовки в области СМИ, могут быть обеспокоены тем, чтобы их разговор был точно передан репортером, особенно тем, кто не знаком с наукой. Сложный характер науки об органоидах также может служить барьером для дискуссий между учеными и журналистами.Слишком многие ученые не могут описать свои исследования в самых общих чертах, не говоря уже о том, чтобы продемонстрировать опыт работы с журналистами или обучение работе со СМИ. Такие общества, как ASCB, или институциональные отделы общественной информации и связи, желают и должны консультироваться.

Мы предлагаем, чтобы ученые, работающие над органоидами, рассмотрели следующие темы для обсуждения при общении с общественностью об органоидах:

1. Опишите, что такое органоиды и чем они не являются.

2. Четко опишите потенциальные возможности органоидов для ваших исследований.

3. Сформулируйте ключевые открытия, сделанные с помощью органоидов, которые были бы невозможны при использовании других подходов.

4. Признайте неизвестность и вызовы.

5. Не говорите о неопубликованных результатах, не прошедших экспертную оценку.

6. Проконсультируйтесь с исследователями в других передовых областях об их опыте работы с прессой и другими аудиториями.Какой опыт они получили в аналогичных областях передовой науки? Какие предложения у них есть для вас, основанные на этом опыте?

7. Члены и сотрудники ASCB могут предоставить вам профессиональную консультацию (www.ascb.org/advocacy/).

Сокращения, используемые:

ССЫЛКИ

• Абуд Э.М., Рамирес Р.Н., Мартинес Э.С., Хили Л.М., Нгуен Ч.Х., Ньюман С.А., Еромин А.В., Скарфон В.М., Марш С.Е., Фимбрес С., и др. (2017). Микроглиоподобные клетки человека, полученные из иПСК, для изучения неврологических заболеваний. Нейрон , 278–293.e279. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Данг Дж., Тивари С.К., Личинчи Г., Цинь Ю., Патил В.С., Ерошкин А.М., Рана Т.М. (2016). Вирус Зика истощает нейроны-предшественники в органоидах головного мозга человека посредством активации рецептора врожденного иммунитета TLR3. Стволовая клетка , 258–265. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Dekkers JF, Wiegerinck CL, de Jonge HR, Bronsveld I, Janssens HM, de Winter-de Groot KM, Brandsma AM, de Jong NW, Bijvelds MJ, Scholte BJ, и др. (2013). Функциональный анализ CFTR с использованием кишечных органоидов первичного кистозного фиброза. Nat Med , 939–945. [PubMed] [Google Scholar]
• Deng WL, Gao ML, Lei XL, Lv JN, Zhao H, He KW, Xia XX, Li LY, Chen YC, Li YP, и др. (2018). Коррекция генов устраняет цилиопатию и потерю фоторецепторов в органоидах сетчатки, полученных из иПСК, у пациентов с пигментным ретинитом. Rep стволовых клеток, 1267–1281. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• DiMasi JA, Grabowski HG, Hansen RW. (2016). Инновации в фарминдустрии: новые оценки затрат на НИОКР. J Health Econ , 20–33. [PubMed] [Google Scholar]
• Дрост Дж., Ван Бокстел Р., Блокзейл Ф., Мизутани Т., Сасаки Н., Сасселли В., де Лигт Дж., Бехжати С., Гроллеман Дж. Э., ван Везел Т., и др. (2017). Использование CRISPR-модифицированных органоидов стволовых клеток человека для изучения происхождения мутационных сигнатур при раке. Наука , 234–238. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Fumagalli A, Drost J, Suijkerbuijk SJ, van Boxtel R, de Ligt J, Offerhaus GJ, Begthel H, Beerling E, Tan EH, Sansom OJ, et al. (2017). Генетическое вскрытие прогрессирования колоректального рака путем ортотопической трансплантации сконструированных раковых органоидов. Proc Natl Acad Sci USA , E2357–E2364.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Garcez PP, Loiola EC, Madeiro da Costa R, Higa LM, Trindade P, Delvecchio R, Nascimento JM, Brindeiro R, Tanuri A, Rehen SK. (2016). Вирус Зика нарушает рост нейросфер и органоидов головного мозга человека. Наука , 816–818. [PubMed] [Google Scholar]
• Harrison RG. (1906 г.). Наблюдения за живым развивающимся нервным волокном. Exp Biol Med , 140–143. [Google Scholar]
• Hines WC, Su Y, Kuhn I, Polyak K, Bissell MJ.(2014). Разбираемся с FACS: дьявол в деталях. Cell Rep , 779–781. [PubMed] [Google Scholar]
• Hirsch T, Rothoeft T, Teig N, Bauer JW, Pellegrini G, De Rosa L, Scaglione D, Reichelt J, Klausegger A, Kneisz D, et al. (2017). Регенерация всего эпидермиса человека с помощью трансгенных стволовых клеток. Природа , 327–332. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Huch M, Knoblich JA, Lutolf MP, Martinez-Arias A. (2017). Надежда и ажиотаж исследований органоидов. Разработка , 938–941. [PubMed] [Google Scholar]
• Хён И., Вилкерсон А., Джонстон Дж. (2016). Эмбриологическая политика: пересмотрите правило 14 дней. Природа , 169–171. [PubMed] [Google Scholar]
• Ири Н., Вайнбергер Л., Тан В.В., Кобаяши Т., Виуков С., Манор Ю.С., Дитманн С., Ханна Д.Х., Сурани М.А. (2015). SOX17 является критическим спецификатором судьбы первичных зародышевых клеток человека. Сотовый , 253–268. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Кобаяши Т., Сурани М.А.(2018). О происхождении зародышевой линии человека. Разработка , dev150433. [PubMed] [Google Scholar]
• Lancaster MA, Renner M, Martin CA, Wenzel D, Bicknell LS, Hurles ME, Homfray T, Penninger JM, Jackson AP, Knoblich JA. (2013). Церебральные органоиды моделируют развитие человеческого мозга и микроцефалию. Природа , 373–379. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Lomax GP, Hull SC, Isasi R. (2015). Проект DISCUSS: пересмотренные пункты, которые следует учитывать при получении линий индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из ранее собранных исследовательских образцов. Стволовые клетки Transl Med , 123–129. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Mandai M, Watanabe A, Kurimoto Y, Hirami Y, Morinaga C, Daimon T, Fujihara M, Akimaru H, Sakai N, Shibata Y, et al. (2017). Аутологичные индуцированные клетки сетчатки, полученные из стволовых клеток, для дегенерации желтого пятна. N Engl J Med , 1038–1046. [PubMed] [Google Scholar]
• Martyn I, Kanno TY, Ruzo A, Siggia ED, Brivanlou AH. (2018). Самоорганизация человека-организатора с помощью комбинированной передачи сигналов Wnt и Nodal. Природа , 132–135. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• McCauley KB, Hawkins F, Kotton DN. (2018). Получение эпителиальных органоидов дыхательных путей из плюрипотентных стволовых клеток человека. Curr Protoc Stem Cell Biol , e51. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• McCauley KB, Hawkins F, Serra M, Thomas DC, Jacob A, Kotton DN. (2017). Эффективное получение функционального эпителия дыхательных путей человека из плюрипотентных стволовых клеток посредством временной регуляции передачи сигналов Wnt. Стволовая клетка , 844–857 е846. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Min YL, Basssel-Duby R, Olson EN. (2019). CRISPR-коррекция мышечной дистрофии Дюшенна. Annu Rev Med , 239–255. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Мунера Дж. О., Сундарам Н., Ранкин С. А., Хилл Д., Уотсон С., Маэ М., Валланс Дж. Э., Шройер Н. Ф., Синагога К. Л., Зарзосо-Лакост А., и др. (2017). Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток человека в органоиды толстой кишки посредством временной активации передачи сигналов BMP. Стволовая клетка , 51–64.e56. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Munera JO, Wells JM. (2017). Генерация желудочно-кишечных органоидов из плюрипотентных стволовых клеток человека. Методы Mol Biol , 167–177. [PubMed] [Google Scholar]
• Николич М.З., Каритг О., Дженг К., Джонсон Дж.А., Сун Д., Хауэлл К.Дж., Брэди Дж.Л., Ларесгоити У., Аллен Г., Батлер Р., и др. (2017). Эпителиальные кончики легких эмбрионов человека являются мультипотентными предшественниками, которые могут размножаться in vitro в виде долговременных самообновляющихся органоидов. Элайф , е26575. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Perez-Lanzon M, Kroemer G, Maiuri MC. (2018). Органоиды для моделирования генетических заболеваний. Int Rev Cell Mol Biol , 49–81. [PubMed] [Google Scholar]
• Sachs N, de Ligt J, Kopper O, Gogola E, Bounova G, Weeber F, Balgobind AV, Wind K, Gracanin A, Begthel H, et al. (2018). Живой биобанк органоидов рака молочной железы фиксирует гетерогенность заболевания. Сотовый , 373–386.e310.[PubMed] [Google Scholar]
• Симиан М., Бисселл М.Дж. (2017). Органоиды: историческая перспектива трехмерного мышления. J Cell Biol , 31–40. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Simsek S, Zhou T, Robinson CL, Tsai SY, Crespo M, Amin S, Lin X, Hon J, Evans T, Chen S. (2016). Моделирование кистозного фиброза с использованием эпителиальных клеток протоков поджелудочной железы человека, полученных из плюрипотентных стволовых клеток. Стволовые клетки Transl Med , 572–579. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Spence JR, Mayhew CN, Rankin SA, Kuhar MF, Vallance JE, Tolle K, Hoskins EE, Kalinichenko VV, Wells SI, Zorn AM, et al. (2011). Направленная дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток человека в ткани кишечника in vitro. Природа , 105–109. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Takebe T, Wells JM, Helmrath MA, Zorn AM. (2018). Стратегии органоидного центра для ускорения клинической трансляции. Стволовая клетка , 806–809. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• van de Wetering M, Francies HE, Francis JM, Bounova G, Iorio F, Pronk A, van Houdt W, van Gorp J, Taylor-Weiner A, Kester L, и др. (2015). Перспективное создание биобанка живых органоидов больных колоректальным раком. Сотовый , 933–945. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Yan HHN, Siu HC, Law S, Ho SL, Yue SSK, Tsui WY, Chan D, Chan AS, Ma S, Lam KO, et al. (2018). Комплексный биобанк органоидов рака желудка человека фиксирует гетерогенность подтипа опухоли и позволяет проводить терапевтический скрининг. Стволовая клетка , 882–897.e11. [PubMed] [Google Scholar]
• Zhou T, Tan L, Cederquist GY, Fan Y, Hartley BJ, Mukherjee S, Tomishima M, Brennand KJ, Zhang Q, Schwartz RE, et al. (2017). Скрининг высокого содержания в hPSC-нейральных предшественниках выявляет кандидаты в лекарственные средства, которые ингибируют вирусную инфекцию Зика в органоидах, подобных плоду, и в головном мозге взрослого человека. Стволовая клетка , 274–283.e275. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

Frontiers | Применение органоидов мозга: от развития нейронов до неврологических заболеваний

Введение

Текущие знания о человеческом мозге в основном основаны на посмертных образцах мозга трупов, в основном из-за этических проблем.Модели животных, в том числе нечеловеческие приматы, имеют несколько несоответствий по сравнению с человеческим мозгом. Эти недостатки создали большие проблемы для изучения развития центральной нервной системы (ЦНС) человека и связанных с ним заболеваний (Adams et al., 2019). Появление и быстрый прогресс технологии стволовых клеток, включая эмбриональные стволовые клетки человека (hESC) и индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (hiPSC), позволили по-новому взглянуть на развитие человеческого мозга и неврологические заболевания (Thomson et al., 1998; Такахаши и Яманака, 2006 г.; Такахаши и др., 2007).

На основе технологии стволовых клеток появление трехмерных (3-D) органоидов привлекло большое внимание в регенеративной медицине. Органоид мозга — это тип органоида, который воспроизводит определенные структуры мозга и использовался для моделирования различных областей человеческого мозга, включая средний мозг (Jo et al., 2016; Monzel et al., 2017), гиппокамп (Sakaguchi et al., 2015). ), гипофиз (Ozone et al., 2016), гипоталамус (Qian et al., 2016) и мозжечок (Muguruma et al., 2015). Таким образом, органоиды головного мозга становятся отличной моделью для изучения развития мозга и механизмов связанных с ним заболеваний (Lancaster and Knoblich, 2014b; Kelava and Lancaster, 2016; Kretzschmar and Clevers, 2016; Di Lullo and Kriegstein, 2017; Benito-Kwiecinski and Lancaster, 2019). Совсем недавно, благодаря достижениям в области редактирования генов, секвенирования отдельных клеток и других передовых технологий, в эту область была введена новая жизненная сила, которая открыла беспрецедентные возможности для моделирования неврологических заболеваний in vitro .

В этом обзоре мы впервые обобщили новые достижения в области методов культивирования и протоколов генерации органоидов головного мозга. Затем мы рассказали о применении органоидов головного мозга в исследовании развития человеческого мозга, неврологических заболеваний и воздействия церебральной токсичности.

Методологический прогресс в культуре органоидов мозга

Для получения органоидов головного мозга эмбриональные тела (ЭТ), полученные из плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSC), обычно встраивают во внеклеточный матрикс (такой как Matrigel), а затем культивируют во вращающемся биореакторе, чтобы способствовать амплификации тканей и дифференцировке нейронов (Kadoshima et al. ., 2013; Цянь и др., 2016). В некоторых исследованиях также были получены сфероиды и органоиды коры головного мозга человека из плюрипотентных стволовых клеток с использованием системы трехмерного культивирования без внедрения во внеклеточный матрикс, и полученные нейроны также демонстрируют функциональную зрелость и синаптогенез (Pasca et al., 2015; Xiang et al., 2017). . Во время культивирования обычно добавляются небольшие молекулы и факторы роста, которые способствуют формированию hPSCs специфических структур различных областей мозга (Qian et al., 2019). В качестве исходной клеточной популяции нейральные предшественники (Xu R.et al., 2019) и нейроэпителиальные стволовые клетки (Monzel et al., 2017) также используются для создания органоидов.

Продленное время культивирования

Органоиды головного мозга, культивируемые в течение короткого времени, в основном содержат астроциты, нейроны и нейральные стволовые клетки/клетки-предшественники, но обычно не содержат зрелых олигодендроцитов и функциональных зрелых нейронов. При более длительном времени культивирования активность кальция можно обнаружить после культивирования в течение 50 дней, и больше клеток проявляют активность кальция (Pasca et al., 2015; Qian et al., 2016; Li et al., 2017). Спонтанные возбуждающие постсинаптические токи также можно обнаружить в органоидах, культивируемых в течение 4 мес (Li et al., 2017). Экспрессию маркеров зрелых астроцитов и нейронов, синапсов и дендритных шипиков можно наблюдать в органоидах, культивируемых в течение 6 месяцев или дольше (Quadrato et al., 2017). Длительное культивирование не только способствует созреванию нейронов, но также усиливает рост и дифференцировку глиальных клеток. Сообщалось, что органоиды головного мозга, культивированные в течение 229 дней in vitro , заполнены обильными глиальными клетками, положительными по GFAP и GLT1 (Renner et al., 2017). Таким образом, длительное культивирование способствует созреванию органоидов головного мозга и лучше отражает развитие человеческого мозга (рис. 1).

Рисунок 1. Последние методологические достижения в области органоидов головного мозга. Несколько методов были использованы для улучшения созревания органоидов головного мозга.

Органоидная культура срезов мозга

Культивирование органотипических срезов значительно улучшило снабжение органоидных тканей кислородом и уменьшило образование гипоксических ядер.В 2019 году группа Ланкастера применила методы культивирования на границе раздела воздух-жидкость, которые повышают выживаемость нейронов и рост аксонов, а также способствуют формированию цепей и выходу функциональных нейронов (Giandomenico et al., 2019). Совсем недавно было обнаружено, что срезы неокортикальной системы органоидов могут способствовать непрерывному нейрогенезу и расширению кортикальной пластинки; корковая пластинка имеет отчетливые верхний и глубокий корковые слои, которые захватывают неокортекс на поздних сроках беременности человека и в некоторой степени устраняют ограничение роста и диффузии органоидов головного мозга (Qian et al., 2020). Эти результаты показывают, что культуру срезов мозговых органоидов можно использовать для изучения специфического для человека продвинутого развития коры и механизмов, связанных с заболеванием (рис. 1).

Культура на микрофлюидных чипах

Микрожидкостные и инженерные методы внесли большой вклад в улучшение воспроизводимости и однородности культур органоидов головного мозга. Особенность этих технологий заключается в том, что они могут упростить процесс выращивания органоидных культур и обеспечить лучшие геометрические ограничения и контроль окружающей среды (Ao et al., 2020). Микрожидкостные чипы упрощают процесс производства мозговых органоидов, а устройства массива микростолбов использовались для формирования большого количества мозговых органоидов in situ (Zhu et al., 2017). Система мозговых органоидов на чипе демонстрирует определенную дифференцировку нейронов, регионализацию и корковую ткань, которые обобщают ключевые особенности раннего развития человеческого мозга (Wang et al., 2018). Эта система применялась для имитации складок мозга и для изучения влияния физических сил на развитие органоидов (Karzbrun et al., 2018). Недавно была создана новая микрожидкостная платформа с рядом уникальных преимуществ (Ao et al., 2020). Устройство объединило культуру интерфейса воздух-жидкость in situ для создания интегрированного рабочего процесса и поддержки универсальной платформы для сборки и культивирования органоидов головного мозга (Ao et al., 2020). Благодаря постоянному прогрессу и совершенствованию биоинженерных технологий культуры органоидов мозга могут стать недорогой, краткосрочной и массовой технологией культивирования.

Васкуляризованные органоиды головного мозга

Органоиды мозга, полученные традиционными методами, обычно не имеют микроциркуляторного русла, что считается губительным для органоидов.В условиях длительного культивирования отсутствие сосудистой системы ограничивает транспорт кислорода и питательных веществ к самым внутренним частям органоидов головного мозга, тем самым вызывая апоптоз и гибель клеток во внутренних зонах (Lancaster and Knoblich, 2014a; Yin et al., 2016; Хайде и др., 2018). Более того, недостаток функциональной сосудистой сети влияет на дифференцировку и созревание нейрональных/глиальных клеток-предшественников (Shen et al., 2004). Васкуляризованные кортикальные органоиды человека (vhCOs) генерируются посредством эктопической экспрессии варианта 2 ETS человека (ETV2).Более того, 20% клеток, инфицированных ETV2, в hCO оптимальны для образования vhCO. На 30-й день культивирования появляются эндотелиальные трубочки CD31 ⁺ , а на 70-й день наблюдается более сложная сеть сосудов CD31 ⁺ (Shen et al., 2004). Кроме того, vhCO также обладает более очевидными характеристиками гематоэнцефалического барьера, проявляющимися в уникальной экспрессии маркеров плотных контактов (таких как α-ZOI), белков астроцитов и перицитов и транспортеров (Cakir et al., 2019).

Совсем недавно другая система совместного культивирования hPSCs и эндотелиальных клеток пупочной вены человека была использована для получения васкуляризированных органоидов, которые демонстрируют хорошо развитую тубулярную сосудистую структуру (Shi et al., 2020). Васкуляризованные органоиды демонстрируют сниженный апоптоз и гипоксию клеток и большее количество синаптических связей и устанавливают сосудистые связи после трансплантации in vivo (Cakir et al., 2019; Shi et al., 2020).

Специализированные мозговые органоиды

С развитием технологий все больше типов клеток, включая олигодендроциты (ОЛ) и интернейроны, стали использоваться для создания органоидов. OL необходимы для развития мозга, включая миелинизирующие и электрически изолирующие аксоны нейронов для распространения импульсов, а также для обеспечения питания и метаболической поддержки нейронов.Однако результаты секвенирования одиночных клеток показывают, что в обычных органоидах коры отсутствуют клетки-предшественники олигодендроцитов (Quadrato and Arlotta, 2017; Sloan et al., 2017).

Чтобы решить эти проблемы, Madhavan et al. (2018) подвергли развитые органоиды воздействию факторов роста олигодендроцитов для индукции предшественников олигодендроцитов и миелинизирующих OL в кортикальных сфероидах. Промиелинизирующие препараты могут стимулировать продукцию олигодендроцитов и миелинизацию, а также воспроизводить фенотипы заболеваний с дефектом миелинизации (Madhavan et al., 2018). Ким и др. (2019b) применили репортерную линию стволовых клеток OLIG2-зеленый флуоресцентный белок (GFP) для создания органоидов переднего мозга, и производство OL можно отслеживать с помощью сигнала GFP. С их протоколом созревание OL ускоряется и может наблюдаться уже через 9 недель после образования органоида (Kim et al., 2019b). Группа Пашки разработала другой протокол для культивирования органоидов, которые производят OL, астроциты и нейроны (Marton et al., 2019). Их протокол использует набор малых молекул и факторов роста и может быть использован для изучения развития OL, миелинизации и взаимодействия с другими основными типами клеток в центральной нервной системе (Marton et al., 2019).

Интернейроны играют ключевую роль в регуляции активности корковых сетей. Сян и др. (2017) создали органоиды, чтобы резюмировать развитие медиального ганглиозного возвышения человека (MGE). Эти органоиды содержат функциональные корковые интернейроны, нейронные сети и ключевые вентральные домены мозга, которые сходны с развивающимися MGE и корой (Xiang et al., 2017).

Применение органоидов мозга в качестве моделей заболеваний

Предыдущие исследования показали, что органоиды головного мозга могут воспроизводить некоторые ключевые особенности человеческого мозга, включая клеточное распределение и организацию, физиологическую структуру, электрическую активность и нейронные сети (Lancaster et al., 2013; Паска и др., 2015; Цянь и др., 2016). Таким образом, органоиды головного мозга стали уникальной моделью для изучения механизмов неврологических расстройств (рис. 2).

Рисунок 2. Применение органоидов головного мозга в качестве моделей заболеваний. Органоиды мозга использовались для моделирования заболеваний нервной системы и дегенеративных заболеваний.

Нарушения развития нервной системы

Первичная микроцефалия

Первичная микроцефалия, также известная как истинная микроцефалия или аутосомно-рецессивная первичная микроцефалия, в основном вызывается генами, которые регулируют сборку центросом и ресничек, вызванных аутосомно-рецессивными мутациями, включая MCPh2 , ASPM , WDR62 , CDK5RAP2 9 CPAP и CENPJ .В настоящее время установлены специфические органоиды головного мозга для врожденной микроцефалии, несущие мутации CDK5RAP2 , CPAP , ASPM и WDR62 соответственно (Lancaster et al., 2013; Li et al., 2017; 2017; Чжан и др., 2019).

Ланкастер и др. (2013) создали церебральную органоидную модель первичной микроцефалии. Соматические клетки пациента с гетерозиготными укороченными мутациями CDK5RAP2 были перепрограммированы в ИПСК.После переноса в нейронную индукцию нейроэпителиальная ткань, полученная из ИПСК пациента, меньше, чем у контрольной группы. Сгенерированные церебральные органоиды содержат меньше радиальных глиальных стволовых клеток (RGs) и больше нейронов, указывая на то, что потеря CDK5RAP2 ведет к преждевременной нейральной дифференцировке за счет клеток-предшественников (Lancaster et al., 2013). Белок, ассоциированный с центросомой P4.1 (белок CPAP), связан с микроцефалией, и его мутация может вызывать синдром Секкеля и микроцефалию.Органоиды головного мозга, полученные от пациента с синдромом Секкеля с мутацией CPAP , демонстрируют меньший размер и преждевременную дифференцировку нейронов (Gabriel et al., 2016). Более того, органоиды Секкеля обнаруживают увеличенное количество и длину ресничек по сравнению с таковыми у контрольных органоидов, указывая на отсроченное разрушение ресничек (Gabriel et al., 2016). Эти находки отражают роль реснички в поддержании нейральных клеток-предшественников (NPCs) и указывают на то, что CPAP является негативным регулятором длины реснички.Органоиды, генерируемые мутантными ИПСК WDR62 , демонстрируют замедленное разложение ресничек, удлинение и прогрессирование клеточного цикла, снижение пролиферации и преждевременную дифференцировку NPC (Zhang et al., 2019). Изучение механизма показывает, что WDR62 взаимодействует с CEP170 и способствует локализации CEP170 в матриксе первичных ресничек, где CEP170 рекрутирует фактор деполимеризации микротрубочек KIF2A для разрушения реснички (Zhang et al., 2019). Эти данные позволяют по-новому взглянуть на патогенез первичной микроцефалии.

Мутантные органоиды микроцефалии ASPM обнаруживают меньше нейроэпителиальных тканей, меньше вентрикулярных радиальных глиальных клеток и наружных радиальных глиальных клеток (oRGs) и плохое ламинирование (Li et al., 2017). Снижение созревания и электрической активности наблюдается в мутантных органоидах ASPM , что связано с врожденной умственной отсталостью у пациентов с мутациями ASPM . Ван Л. и др. (2020) провели соответствующие проверки с помощью секвенирования всего экзома и обнаружили связанные с микроцефалией мутации NARS1 у более чем 5000 человек с нарушениями развития нервной системы.Они создали органоиды коры головного мозга с мутациями NARS1 и обнаружили, что органоиды, полученные от пациентов, демонстрируют меньший размер, сниженную пролиферацию и дефекты клеточного цикла RG (Wang L. et al., 2020).

Приобретенная микроцефалия

Помимо первичной микроцефалии, вызванной хромосомными мутациями, внешняя среда, инфекция и другие факторы также могут вызывать вторичную микроцефалию. Наиболее изученной является микроцефалия, вызванная инфицированием вирусом Зика (ZIKV).Частицы ZIKV могут связываться с клеточными мембранами, локализоваться в митохондриях и клеточных везикулах, приводить к гибели клеток и ингибировать образование нейросфер (Garcez et al., 2016). Цянь и др. (2016) разработали органоид переднего мозга и смоделировали воздействие ZIKV на разных стадиях беременности. Заражение ZIKV на ранней стадии органоидов (14-й день) значительно уменьшает толщину и размеры зоны ВЗ, при этом размер просвета желудочковой структуры значительно увеличивается (Qian et al., 2016), которые очень похожи на клинические фенотипы дилатации центрального желудочка в мозге плода, инфицированного ZIKV (Driggers et al., 2016).

Лиссэнцефалия

Синдром Миллера-Дикера (МДС) — наиболее серьезная форма классической лиссэнцефалии, характеризующаяся уменьшением размеров головного мозга, черепно-лицевыми деформациями, умственной отсталостью и судорогами. Органоиды головного мозга, полученные от пациентов с МДС, демонстрируют повышенный апоптоз и снижение вертикальных делений (Bershteyn et al., 2017; Iefremova et al., 2017). Наблюдаются также дефекты радиальной миграции нейронов, клеточной автономии и замедленного цитокинеза, специфичного для клеток oRG (Bershteyn et al., 2017; Iefremova et al., 2017). Эти митотические дефекты oRG могут быть вовлечены в патогенез лиссэнцефалии человека. Органоиды переднего мозга, полученные от пациентов с МДС, также демонстрируют сдвиг от симметричного к асимметричному клеточному делению клеток вентрикулярной радиальной глии (vRGCs) (Iefremova et al., 2017). Кроме того, они также наблюдали серьезные изменения в организации желудочковой ниши в органоидах МДС, в том числе низкую компактность тканей vRGC и беспорядочное расположение клеток, отошедших от апикальной мембраны (Iefremova et al., 2017). Эти фенотипы могут быть восстановлены путем регуляции пути N-cadherin/β-catenin, что указывает на важную функцию передачи сигналов Wnt при МДС.

Расстройства аутистического спектра

Расстройство аутистического спектра (РАС) — это нарушение развития нервной системы, вызванное различными патогенными факторами, такими как генетическая мутация, эпигенетические модификации и факторы окружающей среды. Кортикальные органоиды, полученные от пациентов с РАС, демонстрируют предпочтительную дифференциацию в сторону ГАМКергических нейронов, но без изменений глутаматергических нейронов, что приводит к дисбалансу нейронов глутамата/ГАМК, что является результатом измененной экспрессии FOXG1 (Mariani et al., 2015). Мультиомное исследование показывает, что кортикальные органоиды, полученные из иПСК, демонстрируют сходный паттерн транскриптома и эпигенома с изогенной мозговой тканью плода, особенно между 5 и 16 неделями после зачатия (Amiri et al., 2018). Это исследование также выявило 49 640 активных энхансеров, важных для спецификации кортикальных нейронов (Amiri et al., 2018), и дифференциально экспрессируемые гены тесно связаны с сигнальным путем Wnt/β-catenin (Wang et al., 2017). CHD8 представляет собой ген, связанный с РАС, и церебральные органоиды, полученные из ИПСК с мутацией гена CHD8 , показывают, что CHD8 регулирует другие гены, связанные с РАС, такие как TCF4 и AUTS2 .