Содержание

Нуклеиновые кислоты. 10-й класс

Ключевые слова: биология, Нуклеиновые кислоты

Цель урока: изучение нуклеиновых кислот.

Задачи урока:

  • Образовательные: повторение и закрепление знаний по теме «Строение и функции белков»; познакомить с азотистыми основаниями и пространственной организацией ДНК и РНК, основными видами РНК; раскрыть роль нуклеиновых кислот в хранении и передаче наследственной информации;
  • Развивающие: развивать умения сравнивать изучаемые объекты, делать вывод; развитие  логического мышления, внимания и памяти.
  • Воспитательные: формирование целостного мировоззрения, соответствующего современному уровню развития науки;  формирование ответственного отношения к учению и самообразованию на основе мотивации к обучению. 

Тип урока: изучение нового материала.

Оборудование: компьютерная презентация, карточка-информатор  по теме «Нуклеиновые кислоты».

Ход урока

1. Актуализация знаний

Слайд №2

1. Назовите мономеры белков?

Ответ (аминокислоты)

 2. Какие уровни организации белковой молекулы существуют?

Ответ (первичная - линейная, вторичная – спираль, третичная – глобула, четвертичная)

3. Что произойдет с белком при нагревании?

Ответ (утрата природной структуры – денатурация белка)

4. Назовите функции белков?

Ответ ( защитная, энергетическая, каталитическая, двигательная, транспортная, структурная)

Слайд №3 Проблемный вопрос: что вырастет из семян яблока? Почему?

Сегодня почти каждый знает, что такое наследственность, но так было, естественно не всегда. Ученые, изучая наследование признаков, не знали, какое именно вещество несет информацию.

Впервые ДНК была выделена в 1869 году Фридрихом Мишером было открыто неизвестное ранее вещество.

Слайд №4 видеоролик из фильма ВВС «Клетка или как устроена жизнь»

Запишите тему сегодняшнего урока: Нуклеиновые кислоты.

2. Изучение новой темы

Слайд № 5 записать в тетради:

Нуклеиновые кислоты: ДНК, РНК.

Состоят из нуклеотидов – сложных веществ, состоящие из:

  • азотистого основания
  • углевода
  • остатка фосфорной кислоты

Задание. Рассмотрите карточку-информатор по теме «Нуклеиновые кислоты» (Приложение №1), определите какие бывают азотистые основания и какие углеводы содержаться в составе ДНК и РНК?

Слайд № 6 Записать в тетради:

Дезоксирибонуклеиновая кислота - ДНК

Углевод – дезоксирибоза

Азотистые основания комплементарны: аденин А ¾ тимин Т цитозин Ц ¾ гуанин Г

Слайд № 7 Нуклеиновые кислоты подобно белкам имеют первичную структуру – последовательность нуклеотидов. Расположение нуклеотидов важно, так как задает последовательность аминокислот в кодируемых белках.

Задание. Определите нуклеотиды второй цепи ДНК используя принцип комплементарности.

Вторичную структуру – две комплементарные цепи, и третичную – пространственную структуру, которую и установили в 1953 году Дж.Уотсон и Ф.Крик.

Слайд № 8 видеоролик из фильма ВВС «Клетка или как устроена жизнь».

Один виток ДНК – 10 нуклеотидов, а расстояние между нуклеотидами 0.34 нм. Цепи направлены в противоположные стороны- антипараллельны.

Структура каждой молекулы ДНК строго индивидуальна и представляет собой генетический код, предающийся следующим поколениям.

Слайд № 9 записать в тетради:

ДНК – обеспечивает хранение, передачу, и воспроизведение наследственной информации в разных поколениях.

Информация, хранящаяся в ДНК должна реализоваться в виде белков. Для этого служит РНК – переносит информацию о последовательности аминокислот в белках, т.е. от хромосом к месту синтеза белков и участвует в синтезе.

Слайд № 10 записать в тетрадь: Рибонуклеиновая кислота РНК:  одноцепочечная молекула, углевод - рибоза, азотистые основания:

  • аденин А
  • урацил У
  • гуанин Г
  • цитозин Ц

Слайд № 11 записать в тетради: три типа РНК – это информационная (матричная) иРНК, транспортная тРНК и рибосомная рРНК.

Все три типа синтезируются непосредственно на ДНК.

Слайд № 12 записать в тетради:

РНК – переносит информацию о последовательности аминокислот в белках, т.е. от хромосом к месту синтеза белков и участвует в синтезе.

3. Закрепление

Слайд № 13 Назовите отличия ДНК от РНК?

1. углеводом
2. азотистым основанием
3. структурой молекулы
4. функциями.

Слайд № 14 Нуклеиновые кислоты в отличие от крахмала, содержат молекулы? (азота и фосфора)

Слайд № 15 Наследственная информация в клетках грибов заключена в? (ДНК)

Слайд № 16 Углевод рибоза входит в состав? (иРНК)

Слайд № 17

  • Что было сложным на уроке?
  • Что вам особенно понравилось на уроке?

Подведение итогов и комментирование оценок.

Итак, мы с вами сегодня внимательно изучили нуклеиновые кислоты

Приложение №1

Карточка-информатор  по теме «Нуклеиновые кислоты»

Названия кислот

ДНК
Дезоксирибонуклеиновая кислота

РНК
Рибонуклеиновая кислота

Мономер

Нуклеотид

Нуклеотид

Состав нуклеотида:
1.Углевод (моносахарид)

2. Азотистые основания

Дезоксирибоза

Рибоза

Аденин
Тимин
Гуанин
Цитозин

Аденин
Урацил
Гуанин
Цитозин

3. Остаток фосфорной кислоты есть есть

Строение молекулы

Молекула двойная  правозакрученная. Один виток  –10 нуклеотидов, а расстояние между нуклеотидами 0.34 нм.

Молекула одинарная

Функции кислот

 Определяет последовательность аминокислот в белках и при делении клетки обеспечивает передачу  наследственной информации в разных поколениях клеток, организмов.

Переносит информацию о последовательности аминокислот в белках, т.е. от  ДНК к месту синтеза белков и участвует в его синтезе.

Презентация по биологии 10 класс "Нуклеиновые кислоты"

Просмотр содержимого документа
«Презентация по биологии 10 класс "Нуклеиновые кислоты"»

Выполнила: Левшинова Татьяна Владимировна, учитель биологии МБОУ Духовщинская СОШ

2014 год

Урок в биологии 10 класс

Содержание

  • Виды НУК
  • Где содержатся
  • Строение ДНК
  • Строение РНК
  • Виды РНК
  • Значение НУК
  • Интересные факты

История открытия

  • 1868 г. – немецкий физик Ф. Мишер обнаружил НУК в ядрах лейкоцитов
  • 1889 г. –Химик Альтман получил дрожжевую НК
  • 1953 г. амер. Д.Уотсон и анг. Д Крик расшифровали структуру ДНК

Ф. Мишер

Структура ДНК была установлена в 1953г. М. Уилкинсом, Дж. Уотсоном и Ф. Криком в Англии.

Нуклеиновые кислоты – биополимеры, состоящие из мономеров – нуклеотидов.

РНК

Рибонуклеиновая кислота

ДНК

Дезоксирибонуклеиновая кислота

Состав нуклеотида ДНК

Состав нуклеотида РНК

Азотистые основания

Аденин (А)

Гуанин (Г)

Цитозин (Ц)

Азотистые основания

Аденин (А)

Гуанин (Г)

Цитозин (Ц)

Урацил (У)

Тимин (Т)

Дезок-

сири-

боза

Остаток фосфорной кислоты

Остаток фосфорной кислоты

Рибоза

Нуклеотид

Структуры НУК

ДНК

РНК

Принцип комплементарности ( правило Э.Чаргаффа)

Водородные связи

Виды РНК

Транспортная РНК

  • Состоит из 100 нуклеотидов.
  • Переносит аминокислоты к месту синтеза белка.

Информационная РНК

  • Линейная.
  • Состоит из 300 – 30000 нуклеотидов.
  • Несёт информацию о последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК к рибосомам.

и-РНК

Рибосомная РНК

  • Состоит из 3000 – 5000 нуклеотидов.
  • Определяет структуру рибосом.

Значение НУК

ДНК

РНК

Сохраняет генетическую информацию

Участвуют в передачи генетической информации

Интересные факты

  • - ДНК человека на 30% совпадает с ДНК листового салата.
  • - ДНК человека и банана совпадают на 50%
  • - ДНК человека и шимпанзе совпадают на 95% (по новым сравнительным исследованиям). Раньше везде приводилась цифра 98.5%, но она оказалась ошибочной.
  • - 150 млн. лет назад предки кенгуру и людей были одинаковыми. Установлено, что в геноме кенгуру находятся большие куски человеческого генома.
  • - мыши и люди разошлись в геномах лишь 70 млн. лет назад, их ДНК совпадают на 70%
  • . Весь человеческий род имеет ДНК, идентичную на 99,9%. Что полностью противоречит теории расовой дискриминации.
  • Повторяющиеся последовательности нуклеотидов (единиц информации ДНК) – так называемый «ДНК-спам», рассматриваемый ранее как бесполезный, может оказаться «черным ящиком» и рассказать ученым о 800 миллионах лет «нашей» эволюции.

Реши задачу

  • Одна из цепей фрагмента молекулы ДНК имеет следующее строение:

Г-Г-Г-А-Т-А-А-Ц-А-Г-А-Т.

  • Укажите строение противоположной цепи.
  • Укажите последовательность нуклеотидов в молекуле и-РНК, построенной на этом участке цепи ДНК.

Выбери правильный ответ

1 . Если нуклеотидный состав ДНК-АТТ-ГЦГ-ТАТ-то каким должен быть нуклеотидный состав и-РНК?

а)ТАА-ЦГЦ-УТА ; к)ТАА-ГЦГ-УТУ; у)уаа-цгц-ауа;

г)уаа-цгц-ата

2.В каком случае правильно названы все отличия и -РНК от ДНК?

а. одноцепочечная, содержит дезоксирибозу, хранение информации

б. двуцепочечная, содержит рибозу, передает информацию

в. одноцепочечная, содержит рибозу, передает информацию

г. двуцепочечная, содержит дезоксирибозу, хранит информацию

Литература

  • Гуменюк М.М. Биология. 9 класс: Поурочные планы по учебнику Мамонтова С.Г.- Волгоград: Учитель, 2008.
  • Криксунов А.А., Каменский Е.А., Пасечник В.В. Общая биология 10 класс: учебник для общеобразовательных учреждений. – М.: Дрофа, 2007.
  • Лысенко И.В.. Биология. 10 класс: поурочные планы по учебнику Каменского А.А., Криксунова Е.А., Пасечника В.В..- Волгоград: Учитель, 2009.
  • Картинки. [Электронный ресурс]. URL: http://images.yandex.ru/ (дата обращения: 30.03.2014 г.).

Презентация - Нуклеиновые кислоты

Слайд №2
Аннотациия
Данный урок предназначен для обучающихся 1 курса СПО по профессии «ТО и ремонт автомобильного транспорта», «Технология общественного питания». Он используется для изучения новой темы и интересен тем, что предлагаемый материал можно использовать для организации и проведения нетрадиционных форм урока. Материал очень нагляден и интересен для познания окружающего мира, особенно той его части, которую трудно увидеть и представить. Разработка урока может быть полезна учителям биологии, студентам педагогических ВУЗов.
Слайд №3
Цель урока:
познакомить учащихся с особенностями строения молекулы ДНК и РНК, их функциями;
раскрыть механизм удвоения ДНК и РНК, роль этого механизма в передаче наследственной информации;
научить изображать этот процесс.
Слайд №4
Задачи:
Учебно-образовательные: проследить историю одного из самых блестящих открытий человеческого разума; рассмотреть виды нуклеиновых кислот, места их локализации в клетке и их функции; сформировать знание о строении ДНК и РНК, отдельного нуклеотида, соединение мономеров в цепь, основанную по принципу комплементарности.
Учебно-развивающие: развивать умения сравнивать, оценивать, составлять кластеры, развитие воображения, логическое мышление, внимание и память.
Учебно-воспитательные: показать учащимся связь изучаемого материала с жизнью и другими науками; продолжить формирование научного мировоззрения, подводить учащихся к правильному применению знаний в жизни человека.
Слайд №5
Изучение нового материала.
Нуклеиновые кислоты — природные высокомолекулярные органические соединения, обеспечивающие хранение и передачу наследственной информации в живых организмах.
Слайд №6
В природе существует 2 вида нуклеиновых кислот: ДНК и РНК.
Слайд №7
Структура ДНК была смоделирована в 1953 г. в США учеными Д. Уотсоном и Ф. Криком.
Слайд №8
Молекула ДНК представляет собой двухцепочечную спираль, закрученную вокруг собственной оси.
Слайд №9
Мономерами ДНК являются нуклеотиды.

Нуклеотид — это химическое соединение, состоящее из остатков трех веществ.

Слайд №10
Схематическое изображение ДНК
Слайд №11
Правило Чаргаффа
Нуклеотидный состав ДНК в 1905 г. впервые количественно проанализировал американский биохимик Эдвин Чаргафф.
Слайд №12
РЕПЛИКАЦИЯ
Процесс самоудвоения ДНК называется – репликация. В результате репликации две новые молекулы ДНК представляют точную копию исходной молекулы.
Слайд №13
Рибонуклеиновая кислота (РНК)
РНК – полимер, мономерами которого являются нуклеотиды. Нуклеотиды РНК представлены:
пятиатомным сахаром – рибозой, остаток фосфорной кислоты и азотистыми основаниями.
Слайд №14
Существует несколько видов одноцепочечных РНК:
Рибосомная РНК (р-РНК)
Информационная (матричная) РНК (и-РНК)
Транспортная РНК (т-РНК).
Слайд №15
Закрепление изученного материала
Какие особенности строения молекулы ДНК обеспечивают выполнение ее функций?
Как происходит самоудвоение ДНК и копирование содержащейся в ее молекулах информации?
Какие особенности в строении ДНК определяют ее роль как носителя наследственной информации?
Слайд №16
Список источников
Химия. 10 класс: учеб. для общеобразоват. учреждений/О.С.Габриелян, Ф.Н. Маскаев, С.Ю. Понамарев, В.И. Теренин; под ред. В.И. Теренина.- 6-е изд., стереотип. – М.: Дрофа, 2009.- 300 с.: ил.
Каменские А.А., Криксунов Е.А., Пасечник В.В.- Учебник Общая биология 10-11 классы – М: Дрофа, 2006.
http://nsportal.ru/shkola/khimiya/library/urok-po-teme-nukleinovye-kisloty-10-klass
http://danilovany.ucoz.ru/load/konspekt_uroka_po_teme_quot_nukleinovye_kisloty_quot/1-1-0-1
http://im0-tub-ru.yandex.net/i?id=58418392-21-72&n=21
http://im2-tub-ru.yandex.net/i?id=207238517-33-72&n=21
http://im3-tub-ru.yandex.net/i?id=533336641-08-72&n=21
http://im3-tub-ru.yandex.net/i?id=172206568-64-72&n=21
http://im7-tub-ru.yandex.net/i?id=106895256-01-72&n=21
http://im6-tub-ru.yandex.net/i?id=324735220-11-72&n=21
http://im6-tub-ru.yandex.net/i?id=209607341-61-72&n=21
http://im6-tub-ru.yandex.net/i?id=201354919-46-72&n=21
http://im2-tub-ru.yandex.net/i?id=586852275-32-72&n=21
http://im1-tub-ru.yandex.net/i?id=329379244-12-72&n=21
http://im4-tub-ru.yandex.net/i?id=503451532-24-72&n=21
http://im3-tub-ru.yandex.net/i?id=529415140-54-72&n=21
http://im0-tub-ru.yandex.net/i?id=266492670-53-72&n=21
http://im7-tub-ru.yandex.net/i?id=169491160-47-72&n=21
http://im5-tub-ru.yandex.net/i?id=304355530-70-72&n=21
http://im2-tub-ru.yandex.net/i?id=646812573-43-72&n=21
http://im2-tub-ru.yandex.net/i?id=147839963-41-72&n=21
http://im6-tub-ru.yandex.net/i?id=43487012-03-72&n=21
http://im3-tub-ru.yandex.net/i?id=519865718-64-72&n=21
http://im5-tub-ru.yandex.net/i?id=293906782-37-72&n=21

Презентация "Органические вещества клетки" (9

Органические вещества клетки

Основные группы

органических веществ

Белки (протеины, полипептиды)

  • Органические, высокомолекулярные полимерные соединения, мономером которых служат аминокислоты.

NH ² — CH — COOH

R

Функции белков

Белки формируют вещество соединительной ткани – коллаген , эластин , кератин . Непосредственно участвуют в построении мембран и цитоскелета (интегральные, полуинтегральные и поверхностные белки) – спектрин (поверхностный, основной белок цитоскелета эритроцитов).

К данной функции можно отнести участие в создании органелл – рибосомы .

Функции белков

  • Каталитическая.

Белки-ферменты – ускорители всех

протекающих в организме реакций.

● Транспортная.

Белки-переносчики: сывороточные альбумины (переносят питательные вещества, лекарственные вещества, витамины и т.д.)

Функции белков

Защитной функцией при инфекциях обладают иммуноглобулины крови, при повреждении тканей - белки свертывающей системы крови. Механическую защиту и поддержку клеток осуществляют протеогликаны.

Сократительная.

Существует ряд внутриклеточных белков, предназначенных для изменения формы клетки и движения самой клетки или ее органелл ( тубулин , актин , миозин ).

Углеводы .

Соединения этого класса составляют около 80 % сухой массы растений и 2—3 % массы животных.

Углеводы выполняют ряд функций:

•  структурную (углеводы принимают участие в построение клеточных стенок, рибоза и дезоксирибоза — компоненты нуклеиновых кислот).

•  энергетическую функцию (при полном расщеплении 1 г углеводов выделяется 17,6 кДж энергии).

•  защитную функцию (образование вязких секретов, компонентов противосвертывающих систем и др.),

 •  рецепторную (находятся в составе различного рода рецепторов клеточных стенок),

• запасающую (являются резервными углеводами растений и  животных).

Нуклеиновые кислоты

НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ

МОНОМЕРЫ - НУКЛЕОТИДЫ

РНК

рибонуклеиновая

кислота

ДНК –

дезоксирибонуклеиновая

кислота

Виды РНК

  • В клетке имеется несколько видов РНК. Все они участвуют в синтезе белка.
  • Транспортные РНК (т-РНК) - это самые маленькие по размерам РНК. Они связывают аминокислоты и транспортируют их к месту синтеза белка.
  • Информационные РНК (и-РНК) - они в 10 раз больше тРНК. Их функция состоит в переносе информации о структуре белка от ДНК к месту синтеза белка.
  • Рибосомные РНК (р-РНК) - имеют наибольшие размеры молекулы, входят в состав рибосом. Определяют структуру и функционирование рибосом.

Липиды — это жироподобные органические соединения, нерастворимые в воде, но хорошо растворимые в неполярных растворителях (эфире, бензине, бензоле, хлороформе и др.). Липиды принадлежат к простейшим биологическим молекулам.

Модель триглицерида.

Красным цветом выделен кислород, чёрным — углерод, белым — водород.

Функции липидов:

  • Структурная. Фосфолипиды вместе с белками образуют биологические мембраны. В состав мембран входят также стеролы.

2. Энергетическая. При окислении жиров высвобождается большое количество энергии, которая идет на образование АТФ.

Функции липидов:

3. Защитная и теплоизоляционная. Накапливаясь в подкожной клетчатке и вокруг некоторых органов (почек, кишечника), жировой слой защищает организм животных и его отдельные органы от механических повреждений.

4. Смазывающая и водоотталкивающая. Воск покрывает кожу, шерсть, перья, делает их более эластичными и предохраняет от влаги. Восковой налет имеют листья и плоды многих растений.

Функции липидов:

5. Регуляторная. Производные холестерола, витамин D играют ключевую роль в обмене кальция и фосфора. Желчные кислоты участвуют в процессах пищеварения (эмульгирование жиров) и всасывания высших карбоновых кислот.

Домашнее задание:

Презентация по биологии Нуклеиновые кислоты (9 класс)

  • Презентации
  • Презентация по биологии Нуклеиновые кислоты (9 класс)

Автор публикации: Шушарина Е.Ю.

Дата публикации: 19.11.2016

Краткое описание:



1

Д/З § 1.6, рт 26, 27, 28

2

1.Местонахождение НК а. ядро ( были впервые обнаружены в ядрах лейкоцитов, ядро - «нуклеус») б.митохондрии в.хлоропластыБлагодаря этой рекламе сайт может продолжать свое существование, спасибо за просмотр.

3

НК – это биополимеры, мономером которых является - нуклеотид Строение нуклеотида: Остаток Н3РО4 Азотистое основание Угле-вод

4

1.Строение нуклеотида 1.аденин – А 2.гуанин – Г 3.цитозин – Ц 4.тимин – Т Остаток Н3РО4 Азотистое основание Дез- окси- рибоза

5

2.Строение молекулы ДНК ДНК – это нерегулярный биополимер, состоящий из двух цепей, закрученных в виде спирали В одной цепи – в цепочку нуклеотиды объединяются благодаря связям между дезоксирибозой 1 – го и остатком фосфорной кислоты 2 – го нуклеотидов.

6

2.Строение молекулы ДНК Объединение цепей – при помощи водородных связей между АО, входящими в состав нуклеотидов противоположных цепей. Комплементарность – это способность к избирательному соединению нуклеотидов. А Т  Г Ц ( связь более крепкая, т.к. их 3 )

7

3.Функции ДНК - хранение наследственной информации - передача наследственной информации

8

1.Строение нуклеотида 1.аденин – А 2.гуанин – Г 3.цитозин – Ц 4.урацил - У А У Г Ц Остаток Н3РО4 Азотистое основание рибоза

9

РНК – это нерегулярный одноцепочечный биополимер (рибоза 1 – го связана остатком фосфорной кислоты 2 – го нуклеотидов)

10

Виды РНК Местона- хождение Функции рРНК рибосома Синтез белка иРНК Ядро, цитоплазма Переносят информацию от хромосом, располагающихся в ядре клетки, к рибосомам, о последова- тельности а/к в молекуле белка тРНК цитоплазма 1.доставляют а/к к месту синтеза белка 2.ориентируют а/к на рибосоме 3. «узнают» участок иРНК

11

1.Почему НК называют полимерами? 2.В чём сходство и различия ДНК и РНК?

12

13

Сходства: в состав нуклеотида входят АО и остаток фосфорной кислоты Различия: а) молекула – ДНК состоит из двух цепей, РНК из одной б) нуклеотид - в ДНК углевод дезоксирибоза, в РНК – рибоза - в ДНК – АО: А, Т, Г, Ц, в РНК – АО: А, У, Ц, Г

14

3. Используя принцип комплементарности, постройте вторую цепочку ДНК ТАТЦГАГАЦЦТАГ АТАГЦТЦТГГАТЦ

15

16

Урок "Нуклеиновые кислоты" – УчМет

Сообщение плана изучения нового материала

План

1.Открытие ДНК

2.Локализация ДНК в клетке

3.Строение молекулы ДНК

4.Строение РНК

5.Практическое применение знаний о ДНК.

6.Закрепление знаний и умений

Слушают и записывают в тетрадь план изучения нового материала

  1. Открытие ДНК

Просмотр фрагмента в/фильма «Секреты ДНК»

Вопрос : «Кто впервые открыл структуру ДНК?»

  1. Локализация ДНК в клетке Демонстрация таблицы «Строение клетки»

Вопрос классу: «Можете ли вы назвать органоиды клетки, в которых находится ДНК?

  1. Строение ДНК демонстрация модели ДНК -вопрос классу: «В чем особенность структуры молекулы ДНК?» Объяснение строения молекулы ДНК -высокомолекулярное соединение; -полимер; -мономером ДНК являются нуклеотиды; -нуклеотид- это соединение, состоящее из остатков азотистого основания, углевода дезоксирибозы и фосфата; -четыре нуклеотида соединяясь между собой образуют цепочку ДНК – таблица «Строение ДНК» Демонстрация моделей нуклеотидов и их сравнение; В чем их сходство и отличие? -название нуклеотиды получили от азотистых оснований: аденин –А; цитозин –Ц; гуанин – Г; тимин –Т -молекула ДНК –двуцепочечная, одна цепочка около другой удерживается водородными связями, образующимися между азотистыми основаниями. Просмотр фрагмента в/фильма «Секреты ДНК» Вопрос классу: «Какая закономерность существует в образовании водородных связей между азотистыми основаниями?» -объяснение с записью схемы строения ДНК: Т-Ц-Г-А-Т-Г-Ц-А-Г-Т-Ц-А-Г А-Г-Ц-Т-А-Ц-Г-Т-Ц-А-Г-Т-Ц -Т всегда располагается напротив А, -Ц всегда располагается напротив Г . закономерность такого расположения называют принципом комплементарности. (количество нуклеотидов А=Т, а количество нуклеотидов Ц=Г –правило Э.Чаргаффа).

Узнают при просмотре в/фильма о ученых, открывших структуру ДНК и записывают фамилии ученых в тетрадь.

Рассматривают клетку и называют органоиды, где локализована ДНК (ядро, митохондрии, хлоропласты), запись в тетрадь.

Отвечают на вопрос

Записывают в тетрадь характеристику ДНК.

Сравнивают нуклеотиды, находят сходство и отличия.

Записывают название нуклеотидов в тетрадь

Отвечают на вопрос, после просмотра фрагмента в/ф.

Записывают схему двойной цепочки ДНК

Репликация или удвоение ДНК.

ДНК не только хранит наследственную информацию, но и передает её. Клетки постоянно делятся и вновь возникшие дочерние клетки являются копией материнской клетки. –Проблемный вопрос: Каким образом происходит равномерное распределение наследственной информации?

Объяснение механизма репликации ДНК по принципу комплементарности

Обсуждают проблемный вопрос

Слушают и записывают в тетрадь схему репликации ДНК.

Первичное закрепление знаний о структуре и функции ДНК.

1)Игра – соревнование: «Кто быстрее». Условие: необходимо достроит вторую цепочку ДНК. Каждый ряд – команда, получает лист с фрагментом одной цепи ДНК, который передается по цепочке.

1 команда: цепочка № 1 Т-Ц-Г-Т-А-Ц-А-Г-А-Г-Т-Ц

цепочка № 2 ?

2 команда: цепочка № 1 А-Г-Ц-А-Т-Г-Т-Ц-Т-Ц-А-Г

цепочка № 2 ?

3, 4, 5,6 команды получают аналогичные задания.

На выполнение дается 1 минута

- Подведение итогов соревнования .

2)Вопрос: Что вы узнали на уроке о ДНК?

Каждый из вас должен сказать одно предложение о ДНК, связанное со строением или функцией.

(условие: не повторяться).

3)Обобщение знаний о ДНК в форме стихотворения (называю имя и фамилию ученика, который накануне урока получил задание выучить стих)

Каждый уч-ся команды указывает один из нуклеотидов второй цепочки ДНК

Уч-ся сами проверяют правильность написания второй цепи ДНК

Уч-ся рассказывают всё, что узнали на уроке о строение, функции ДНК.

Ученик читает стих о строении ДНК:

ДНК – она двойная

И строеньем не простая.

Мономер- нуклеотид,

Из трех штучек состоит

За азотным основаньем

Как в строю – вот красота.

Углевод дезоксирибоза,

Фосфорная кислота.

Есть четыре основанья,

Мы запомним их названья:

Цитозин + гуанин,

А тимин + аденин.

4.Строение РНК

Проблемная ситуация: Информация о последовательности аминокислот в молекуле белка хранится в ДНК ядра клетки, а сборку производят рибосомы, расположенные в цитоплазме. Молекула ДНК из-за своей громадной молекулярной массы не способны покинуть ядро. Каким образом план сборки молекулы белка передается на рибосомы? Какая структура клетки осуществляет связь между ДНК и рибосомами?

О РНК нам расскажет (называю имя и фамилию уч-ся, который получил опережающее задание)

- В чем сходство и различие ДНК и РНК ? Используя таблицу «Нуклеиновые кислоты» сравните нуклеиновые кислоты.

Участвуют в решении проблемной ситуации.

Уч-ся рассказывает о РНК, особенностях строения, о видах РНК.

-Сравнивают РНК и ДНК

  1. Практическое применение знаний о ДНК. Заочная экскурсия в лабораторию генетической экспертизы

Просмотр фрагмента в/фильма «Секреты ДНК»

Вопросы к в/фильму на каждой парте.

Вопросы к в/фильму:

-Клетки, каких тканей используют для теста ДНК?

-Как проводят анализ ДНК?

-Для чего делают тест ДНК?

-Люди, какой профессии работают в лабораториях генетической экспертизы?

Смотрят в/фильм.

Отвечают на вопросы

  1. Первичное закрепление знаний – карточки с заданиями 1 и 2 варианты. Выполнение 5 минут.

Вариант № 1

Задание №1 Укажите последовательность нуклеотидов второй цепочки ДНК, если первая цепочка имеет следующую последовательность нуклеотидов: А-Г-Т-Ц-А-Г-Т-А-Ц-Ц-Г-Т-Г-Ц-Т

Задание № 2 Найдите ошибки в структуре молекулы ДНК

А-Ц-Т-Г-А-Ц-Г-А-Т-Ц-Т-Г

Т-Г-Ц-Ц-Т-Г-Ц-Т-А-Т-А-Ц

Задание № 3 Тест

1.Мономером ДНК является:

а)нуклеотид; б)аминокислота; в)глюкоза; г)глицерин.

2.В состав ДНК НЕ входит: а)дезоксирибоза; б)аденин; в)урацил; г)фосфат.

3.Модель структуры ДНК открыли в 1953 г.:

а)И.П. Павлов и И.М. Сеченов; б)Ф. Крик и Д. Уотсон; в)Ч.Дарвин и Ж. Ламарк.

4.Функции ДНК в клетке: а)является одним из источников энергии; б)принимает непосредственное участие в синтезе белков; в)участвует в синтезе углеводов и липидов; г)обеспечивает хранение и передачу наследственной информации.

5.Нуклеотиду Ц комплементарен нуклеотид: а)А; б)Г; в)Т; г)У.

*Задание № 4 Решите задачу, используя правило Э. Чаргаффа.

В молекуле ДНК адениновых нуклеотидов насчитывается 20% от общего числа нуклеотидов. Определите количество в % Т, Ц, Г нуклеотидов.

Выполняют задания

7.Домашнее задание п.22 вопросы 11,12 стр 112;

Используя интернет ресурсы, найдите ответ на вопрос: «Почему результат теста ДНК подтверждающий отцовство равен 99,9%, а не 100%?

Записывают д/з

8.Итог урока:

-Какие новые знания вы сегодня получили на уроке?

-Чему вы научились?

-Что на уроке было интересное, познавательное?

-Какие вопросы урока вызвали у вас затруднение?

-Что вы узнали о профессии генетика эксперта?

(выставление оценок, их комментирование).

Участвуют в подведении итога урока

Презентація до уроку з біології для 10 класу на тему "Нуклеїнові кислоти. АТФ"

Про матеріал

Презентація створена за матеріалами підручника Біологія і екологія (рівень стандарту): підруч. для 10 кл. закл. заг. серед. освіти / В. І. Соболь та Біологія і екологія: підруч. для 10 кл. закладів загальної середньої освіти: рівень стандарту/О. А. Андерсон, М. А. Вихренко, А. О. Чернінський.

Перегляд файлу

Зміст слайдів

Номер слайду 1

Нуклеїнові кислоти. АТФ10 клас

Номер слайду 2

Біологічна роль нуклеїнових кислот у метаболізміНУКЛЕЇНОВІ КИСЛОТИ – складні високомолекулярні біополімери, побудовані з нуклеотидів. У всіх живих організмах нуклеїнові кислоти виконують роль збереження, передачі й реалізації спадкової інформації. Вперше їх виявлено в ядрі клітини, звідки й походить назва цих сполук (від лат. nucleos – ядро). Це інформаційні «молекули життя»: ДНК зберігає генетичну інформацію, а різні типи РНК сприяють її реалізації.

Номер слайду 3

Біологічна роль нуклеїнових кислот у метаболізміНуклеїновим кислотам, як і білкам, притаманна первинна структура – певна послідовність розташування нуклеотидів, а також складніші вторинна і третинна структури, які формуються за допомогою водневих зв'язків, електростатичних, гідрофобних та інших взаємодій.

Номер слайду 4

Біологічна роль нуклеїнових кислот у метаболізмі Все, що необхідно клітині для життя, запрограмовано в ділянках молекул ДНК – генах. Закодована в них інформація реалізується молекулами РНК: іРНК переписує інформацію з гена й переносить її на рибосоми, в утворенні яких беруть участь р. РНК. На молекулі іРНК, як на матриці, синтезується молекула певного білка, а окремі амінокислоти для його синтезу постачаються транспортною РНК (т. РНК).

Номер слайду 5

Порівняльна характеристика ДНК та РНК

Номер слайду 6

АТФДеякі нуклеотиди функціонують у клітинах не лише як мономери нуклеїнових кислот, а мають додаткові, самостійні функції. Найголовнішим з таких нуклеотидів є АТФ (аденозинтрифосфат). Склад: аденін, рибоза та три залишки ортофосфатної кислоти.

Номер слайду 7

АТФОсобливості будови: для приєднання наступних залишків ортофосфатної кислоти потрібно набагато більше енергії, ніж на приєднання першого – так у клітинах накопичується енергія. Від синтезованої молекули АТФ шляхом гідролізу відщеплюється третій залишок ортофосфатної кислоти, накопичена енергія вивільняється й використовується для перебігу різноманітних процесів (синтез чи розклад хімічних речовин, зміну їхньої структури, здійснення рухів тощо).

Номер слайду 8

АТФРівняння такої реакції: АТФ + h3 O → АДФ +h4 PO4 + Е (50 к. Дж/моль), де АДФ – аденозиндифосфатна кислота; Е – енергія, що виділяється. Утворена АДФ може далі розщеплюватися до аденозинмонофосфатної кислоти (АМФ), але під час цієї реакції вивільняється менше енергії (~33–42 к. Дж/моль). АМФ є звичайним РНК-нуклеотидом, що не зберігає великої кількості енергії.

Номер слайду 9

АТФАТФ – це молекула, що є універсальним внутрішньоклітинним переносником енергії. Молекули АТФ можуть утворюватися за рахунок енергії, яка виділяється в реакціях безкисневого розщеплення глюкози або окиснення органічних речовин у мітохондріях, за рахунок енергії світла під час фотосинтезу тощо. Розщеплення АТФ відбувається завжди, коли клітині потрібна енергія для здійснення певної реакції.

Номер слайду 10

НАД та НАДФКрім АТФ, у клітинах «працюють» й інші нуклеотиди. До них належать нікотинамідаденіндинуклеотид (НАД) та нікотинамідаденіндинуклеотидфосфат (НАДФ). Ці нуклеотиди переносять хімічні речовини і є важливими для роботи мітохондрій і фотосинтезу. У хлоропластах рослинних клітин НАДФ відновлюється під час світлових реакцій фотосинтезу і потім забезпечує Гідрогеном біосинтез вуглеводів упродовж темнової фази.

Номер слайду 11

Найцікавіші факти про ДНК* На міжнародній космічній станції є жорсткий диск, який містить ДНК відомих і впливових людей, таких як Стівен Хокінг, Стівен Колберт і Ленс Армстронг. Створений він для того, щоб продовжити життя людства в разі всесвітньої катастрофи. Його також називають «Безсмертний диск»*ДНК людини на 50% схожа з РНК банана і на 30% — з ДНК листового салату.*Всі люди мають 99,9% однакової будови ДНК, і лише 0,1% достатньо, щоб побудувати новий генетичний код людини.

Номер слайду 12

Найцікавіші факти про ДНК*У разі пересадки кісткового мозку кров людини покаже зовсім інше ДНК, ніж її слина і волосся. У зв’язку з цим у світовій практиці існують випадки помилкового розслідування злочинів. *Всю інформацію в світі, записану в цифровому вигляді, можна вмістити лише в 2-х грамах ДНК. *ДНК людини піддається понад 1 мільйону пошкоджень на день. Однак складна система організму і взаємодія клітин дозволяють відновлювати будову ДНК в колишній вигляд.

Номер слайду 13

Найцікавіші факти про ДНКДНК міститься в природно скрученій спіралі. Однак якщо всі клітини тіла, що містять ДНК, розкрутити в пряму лінію, то вийде 100 трильйонів метрів ДНК на людину. Це відстань приблизно від Землі до Плутона і назад. Вчені добре досліджували будову клітин і ДНК, тому давно хочуть зробити науковий прорив людства: за допомогою різних генетичних кодів створити людину. Однак це стане великою катастрофою з точки зору релігійних, етичних, естетичних, наукових і медичних поглядів.

Номер слайду 14

Найцікавіші факти про ДНК*Дивно, однак багато вчених, які досліджують ДНК, почали вірити в Бога. Так, наприклад, директор проєкту Генома Людини Френсіс С. Коллінз заявив, що інформація, вбудована в ДНК, доводить існування Бога. *За допомогою тесту ДНК ви зможете дізнатися ймовірність ризиків захворювання, а також схильність ваших дітей до деяких захворювань. *В еритроцитах немає ДНК.

Номер слайду 15

Домашнє завдання. Опрацювати § 20, виконати завдання Біологія + Англійська мова. Нуклеотиди й життя. Перекладіть текст і поясніть значення нуклеотидів для життя. «Nucleotides are organic molecules that serve as the monomer units for forming the nucleic acid polymers deoxyribonucleic acid (DNA) and ribonucleic acid (RNA), both of which are essential biomolecules in all life-forms on Earth. Nucleotides are the building blocks of nucleic acids; they are composed of three subunit molecules: a nitrogenous base, a five-carbon sugar (ribose or deoxyribose), and at least one phosphate group. Nucleotides also play a central role in life-form metabolism at the fundamental, cellular level. They carry packets of chemical energy – in the form of the nucleoside triphosphates ATP, GTP, CTP and UTP – throughout the cell to the many cellular functions that demand energy, which include synthesizing amino acids, proteins and cell membranes and parts; moving the cell and moving cell parts, both internally and intercellularly; dividing the cell, etc. In addition, nucleotides participate in cell signaling (c. GMP and c. AMP), and are incorporated into important cofactors of enzymatic reactions (e.g. coenzyme A, FAD, NAD, NADP).

Прошлое и настоящее

Извлечение ДНК, РНК и белка - основной метод, используемый в молекулярной биологии. Эти биомолекулы можно выделить из любого биологического материала для последующих процессов, аналитических или препаративных целей. В прошлом процесс экстракции и очистки нуклеиновых кислот был сложным, длительным, трудоемким и ограниченным с точки зрения общей производительности. В настоящее время существует множество специализированных методов, которые можно использовать для извлечения чистых биомолекул, например, протоколы на основе растворов и колонок.Ручной метод, безусловно, прошел долгий путь с течением времени с различными коммерческими предложениями, которые включали полные наборы, содержащие большинство компонентов, необходимых для выделения нуклеиновой кислоты, но большинство из них требует повторных этапов центрифугирования с последующим удалением супернатантов в зависимости от типа образца и дополнительная механическая обработка. Спрос на автоматизированные системы, предназначенные для средних и крупных лабораторий, в последние годы вырос. Это альтернатива трудоемким ручным методам.Технология должна обеспечивать высокую пропускную способность образцов; выход, чистота, воспроизводимость и масштабируемость биомолекул, а также скорость, точность и надежность анализа должны быть максимальными при минимальном риске перекрестного загрязнения.

Извлечение биомолекул, ДНК, РНК и белков - наиболее важный метод, используемый в молекулярной биологии [1]. Это отправная точка для последующих процессов и разработки продуктов, включая диагностические комплекты. ДНК, РНК и белок могут быть выделены из любого биологического материала, такого как живые или консервированные ткани, клетки, вирусные частицы или другие образцы для аналитических или препаративных целей [1].

Две категории, которые участвуют в очистке ДНК, включают выделение рекомбинантных конструкций ДНК, таких как плазмиды или бактериофаги, и выделение хромосомной или геномной ДНК от прокариотических или эукариотических организмов [2]. Как правило, для успешной очистки нуклеиновых кислот требовалось четыре важных этапа: эффективное разрушение клеток или тканей; денатурация нуклеопротеидных комплексов; инактивация нуклеаз, например, РНКазы для экстракции РНК и ДНКазы для экстракции ДНК; вдали от загрязнения [2].Нуклеиновая кислота-мишень не должна содержать примесей, включая белки, углеводы, липиды или другие нуклеиновые кислоты, например, ДНК без РНК или РНК без ДНК [3]. Качество, а также целостность выделенной нуклеиновой кислоты будут напрямую влиять на результаты всех последующих научных исследований [4].

С другой стороны, РНК является нестабильной молекулой и имеет очень короткий период полураспада после извлечения из клетки или тканей [5]. Существует несколько типов встречающихся в природе РНК, включая рибосомную РНК (рРНК) (80–90%), информационную РНК (мРНК) (2.5% –5%) и транспортной РНК (тРНК) [3]. Особая осторожность и меры предосторожности требуются для выделения РНК, поскольку она подвержена деградации [3, 6]. РНК особенно нестабильна из-за повсеместного присутствия РНКаз, которые представляют собой ферменты, присутствующие в крови, всех тканях, а также в большинстве бактерий и грибов в окружающей среде [3, 5] . Сильные денатуранты всегда использовались при выделении интактной РНК для ингибирования эндогенных РНКаз [2]. Экстракция РНК основана на хорошей лабораторной технике и методе без РНКазы.РНКаза термостабильна и повторно складывается после тепловой денатурации. Их сложно инактивировать, поскольку они не требуют кофакторов [2]. Наиболее распространенные методы выделения можно разделить на два класса: использование 4 M тиоцианата гуанидиния и использование фенола и SDS [2].

Очистка белков - одна из наиболее важных частей в исследованиях белков для понимания их функции, поскольку они могут частично или полностью участвовать в любой деятельности по синтезу ДНК. Очистка белка необходима для определения его уникальных характеристик, включая размер, заряд, форму и функцию [7].Экстракция на основе клеток - это начальный этап почти любой очистки белка. Белок может быть извлечен несколькими методами, такими как лизис детергентом, усилие сдвига, обработка солью с низким содержанием ионов (высаливание) и быстрые изменения давления, которые направлены на ослабление и разрушение мембран, окружающих клетку, чтобы позволить белкам уйти [7 ]. При работе с белками следует учитывать некоторые факторы. Обычно экстракция белка выполняется при очень низкой температуре (), поскольку белки легко денатурируются, как только они высвобождаются из клеток.Состояние буфера - один из основных факторов, которые необходимо учитывать. Рекомендуется поддерживать определенные буферные условия из-за чувствительности белков к изменениям pH окружающей среды [4]. Чистота воды будет влиять на выход конечных продуктов, так как неочищенная вода содержит много микроорганизмов или протеаз, которые приводят к деградации белка [4]. Ингибитор белка, который может существовать в растворе или буферах, вызывает гидролиз белков. Моющее средство, еще один важный фактор, которым нельзя пренебрегать при очистке белка, состоит из гидрофобной части линейного или разветвленного углеводородного «хвоста» и гидрофильной «головы» [4].Они солюбилизируют мембранный белок и представляют собой амфифатические молекулы, которые образуют мицеллы с гидрофильной головкой белков [4]. Восстановители будут добавлены в раствор или буфер для экстракции и очистки белка, чтобы избежать потери активности белков или ферментов, вызванной окислением. Хранение белков важно, поскольку период полураспада белка обычно зависит от температуры хранения [4].

Для очистки белка требуется специальный анализ. Для очистки белка должен быть известен быстрый и простой метод анализа, чтобы можно было определить известную молекулярную массу, удельную аффинность или иммуноаффинность интересующего неферментативного белка с помощью соответствующего метода [7].Есть несколько методов, обычно используемых для очистки белка. Это ионообменная хроматография, гель-фильтрация, аффинная хроматография и гель-электрофорез [4].

2. История
2.1. Экстракция нуклеиновой кислоты

Самое первое выделение ДНК было сделано швейцарским врачом Фридрихом Мишером в 1869 году [8] . Он надеялся раскрыть фундаментальные принципы жизни, определить химический состав клеток. Он попытался выделить клетки из лимфатических узлов для своего эксперимента, но чистота лимфоцитов была трудной и невозможно было получить в достаточных количествах.Поэтому он перешел на лейкоциты, где получил их из гноя на собранных хирургических повязках.

Первоначально Мишер сосредоточился на различных типах белков, из которых состоят лейкоциты, и показал, что белки являются основными компонентами цитоплазмы клетки. Во время своих тестов он заметил, что при добавлении кислоты из раствора выпадало вещество, которое снова растворялось при добавлении щелочи. Это был первый раз, когда он получил неочищенный осадок ДНК.

Чтобы отделить ДНК от белков в экстрактах своих клеток, Мишер разработал новый протокол для отделения ядер клеток от цитоплазмы, а затем выделил ДНК.Однако его первый протокол не дал достаточно материала для продолжения дальнейшего анализа. Ему пришлось разработать второй протокол для получения большего количества очищенного нуклеина, который позже его ученик Ричард Альтман назвал «нуклеиновой кислотой» [8].

2.2. Экстракция белка

В восемнадцатом веке белки были известны как отдельный класс биологических молекул Антуаном Фуркроем и другими. Они различали эту молекулу по ее способности коагулировать под действием тепла или кислоты.Однако первое описание белка было выполнено голландским химиком Герхардусом Йоханнесом Малдером в 1893 году [9]. Его исследования состава веществ животного происхождения, в основном фибрина, альбумина и желатина, показали присутствие углерода, водорода, кислорода и азота [9]. Более того, он признал, что сера и фосфор иногда присутствуют в животных веществах, состоящих из большого количества атомов, и установил, что эти «вещества» являются макромолекулами [9].

Большинство ранних исследований было сосредоточено на белках, которые можно было очищать в больших количествах.Например, кровь, яичный белок и различные токсины. Большинство белков трудно очистить в количествах, превышающих миллиграммы, даже с помощью современных высокотехнологичных методов. Большинство методов очистки белков были разработаны в рамках проекта, возглавляемого Эдвином Джозефом Коном, ученым-белком, во время Второй мировой войны. Он отвечал за очистку крови и разработал методы выделения фракции сывороточного альбумина из плазмы крови, которая важна для поддержания осмотического давления в кровеносных сосудах, что помогает солдатам выжить [10].

3. Текущая тенденция

После судьбоносного события, когда Мишеру удалось получить ДНК из клетки, многие другие последовали его примеру, что привело к дальнейшему развитию протокола выделения и очистки ДНК. Первоначальные рутинные лабораторные процедуры для экстракции ДНК были разработаны на основе стратегий центрифугирования в градиенте плотности. Мезельсон и Шталь использовали этот метод в 1958 г., чтобы продемонстрировать полуконсервативную репликацию ДНК [3]. В более поздних процедурах использовались различия в растворимости больших хромосомных ДНК, плазмид и белков в щелочном буфере [3].

В настоящее время существует множество специализированных методов извлечения чистой ДНК, РНК или белка. Как правило, они делятся на протоколы на основе решений или на основе столбцов. Большинство из этих протоколов были преобразованы в коммерческие наборы, которые упрощают процессы экстракции биомолекул.

3.1. Тип экстракции нуклеиновой кислоты
3.1.1. Традиционный метод

Экстракция тиоцианата гуанидиния, фенола и хлороформа
Соль является обычной примесью в образцах нуклеиновых кислот.Всегда требовалось удалить его из образцов нуклеиновой кислоты до того, как можно будет проводить какие-либо последующие процессы и анализ. Следовательно, для обессоливания образца, содержащего нуклеиновую кислоту, необходимы однократные или многократные стадии разделения и / или очистки [11]. Общие этапы очистки нуклеиновых кислот включают лизис клеток, который разрушает клеточную структуру с образованием лизата, инактивацию клеточных нуклеаз, таких как ДНКаза и РНКаза, и отделение желаемой нуклеиновой кислоты от клеточного мусора [2].Органический растворитель - экстракция фенол-хлороформ является одним из примеров, который широко используется для выделения нуклеиновой кислоты.
Хотя фенол, легковоспламеняющаяся, едкая и токсичная карболовая кислота, может быстро денатурировать белки, он не полностью подавляет активность РНКазы [12]. Эту проблему можно решить, используя смесь фенол: хлороформ: изоамиловый спирт (25: 24: 1). Белки, липиды, углеводы и остатки клеток удаляются путем экстракции водной фазы органической смесью фенола и хлороформа [12, 13].При добавлении фенола и хлороформа образуется двухфазная эмульсия. Затем гидрофобный слой эмульсии осаждается на дне, а гидрофильный слой - наверху путем центрифугирования [3]. Собирают верхнюю фазу, содержащую ДНК, и ДНК можно осаждать из супернатанта путем добавления этанола или изопропанола в соотношении 2: 1 или 1: 1 и высокой концентрации соли [3]. Осадок ДНК собирают центрифугированием, избыток соли промывают 70% этанолом и центрифугируют, чтобы удалить надосадочную жидкость этанола.Затем осадок ДНК растворяют в буфере ТЕ или стерильной дистиллированной воде [3].
Использование изотиоцианата гуанидиния для экстракции РНК впервые было упомянуто Ulrich et al. (1977). Метод был трудоемким. Поэтому он был заменен одностадийным методом, известным как экстракция гуанидиния тиоцианат-фенол-хлороформ, Хомчински и Сакки (1987) [12], при котором гомогенат экстрагируется фенолом / хлороформом при пониженном pH. Тиоцианат гуанидиния - это хаотропный агент, используемый при расщеплении белков.Принцип этого одностадийного метода заключается в том, что РНК отделяется от ДНК после экстракции кислым раствором, состоящим из тиоцианата гуанидиния, ацетата натрия, фенола и хлороформа [13]. В кислых условиях общая РНК будет оставаться в верхней водной фазе всей смеси, в то время как ДНК и белки останутся в межфазной или нижней органической фазе. Затем проводят восстановление общей РНК путем осаждения изопропанолом [12].

Метод щелочной экстракции
Щелочной лизис использовали для выделения плазмидной ДНК и E.coli [12]. Он хорошо работает со всеми штаммами E. coli и с бактериальными культурами размером от 1 мл до более 500 мл в присутствии додецилсульфата натрия (SDS). Принцип метода основан на селективной щелочной денатурации высокомолекулярной хромосомной ДНК, в то время как ковалентно замкнутая кольцевая ДНК остается двухцепочечной [14]. Бактериальные белки, разрушенные клеточные стенки и денатурированная хромосомная ДНК объединены в большие комплексы, покрытые додецилсульфатом.Плазмидную ДНК можно выделить из супернатанта после удаления денатурированного материала центрифугированием.

CTAB Extraction Method
Для экстракции растений первым шагом, который необходимо сделать, является измельчение образца после его замораживания жидким азотом. Цель выполнения этого шага - разрушить материал клеточной стенки образца и предоставить доступ к нуклеиновой кислоте, в то время как вредные клеточные ферменты и химические вещества остаются инактивированными. После измельчения образца его можно ресуспендировать в подходящем буфере, таком как CTAB.
Бромид цетилтриметиламмония (CTAB) - неионный детергент, который может осаждать нуклеиновые кислоты и кислые полисахариды из растворов с низкой ионной силой [15]. Между тем в этих условиях белки и нейтральные полисахариды остаются в растворе. В растворах с высокой ионной силой CTAB не осаждает нуклеиновые кислоты и образует комплексы с белками. Поэтому CTAB полезен для очистки нуклеиновой кислоты от организмов, которые продуцируют большие количества полисахаридов, таких как растения и некоторые грамотрицательные бактерии [15].
В этом методе также используются органические растворители и осаждение спиртом на более поздних этапах [12]. Нерастворимые частицы удаляют центрифугированием для очистки нуклеиновой кислоты. Растворимые белки и другие материалы разделяются путем смешивания с хлороформом и центрифугирования. После этого нуклеиновую кислоту необходимо осадить из надосадочной жидкости и тщательно промыть для удаления загрязняющих солей. Затем очищенную нуклеиновую кислоту ресуспендируют и хранят в буфере ТЕ или стерильной дистиллированной воде.

Бромид этидия () -хлорид цезия () Градиентное центрифугирование
Градиентное центрифугирование - это сложный, дорогой и трудоемкий метод по сравнению с другими протоколами очистки.Это требует крупномасштабного бактериального культивирования. Следовательно, он не подходит для минипрепаратов плазмидной ДНК [4]. Нуклеиновые кислоты можно концентрировать центрифугированием в градиенте после осаждения спиртом и ресуспендирования. Интеркаляция изменяет плавающую плотность молекулы в высокомолярные ковалентно замкнутые круговые молекулы, которые будут накапливаться при более низких плотностях градиента, поскольку они включают меньше на пару оснований по сравнению с линейными молекулами. После экстракции гидрофобные вещества удаляют соответствующими гидрофобными растворителями.Очищенную нуклеиновую кислоту переосаждают спиртом [1].

Очистка поли-РНК с помощью хроматографии с олигп (dT) -целлюлозой
Поли-РНК является матрицей для трансляции белка, и большинство мРНК эукариот несут ее участки на своих 3’-концах [4, 15]. Он составляет от 1 до 2% от общей РНК и может быть разделен с помощью аффинной хроматографии на олиго (dT) -целлюлозе. Поли (А) хвосты образуют стабильные гибриды РНК-ДНК с короткими цепями олиго (dT), которые прикрепляются к различным поддерживающим матрицам [4, 15].В хроматографический буфер необходимо добавить большое количество соли для стабилизации дуплексов нуклеиновых кислот, поскольку образуются только несколько пар оснований dT-A. Буфер с низким содержанием соли используется после того, как неполиаденилированные РНК были отмыты от матрицы. Этот буфер помогает дестабилизировать двухцепочечные структуры и элюировать поли РНК из смолы [15].
Существует два метода, обычно используемых при выборе поли РНК - колоночная хроматография на олиго (dT) колонках и периодическая хроматография. Колоночная хроматография обычно используется для очистки больших количеств (> 25 г) нерадиоактивной РНК поли (A) + , выделенной из клеток млекопитающих.При работе с небольшими количествами (<50 г) тотальной РНК млекопитающих предпочтительным методом является периодическая хроматография. Его можно использовать, когда нужно обработать много образцов РНК, радиоактивных или нет. Периодическая хроматография проводится с мелкодисперсной олиго (dT) целлюлозой при оптимальных температурах для связывания и элюирования [15].

3.1.2. Твердофазная экстракция нуклеиновых кислот

Твердофазная очистка нуклеиновых кислот можно найти в большинстве имеющихся на рынке коммерческих наборов для экстракции.Он позволяет производить быструю и эффективную очистку по сравнению с традиционными методами [16]. Многие проблемы, связанные с жидкостно-жидкостной экстракцией, такие как неполное разделение фаз, можно предотвратить. Твердофазная система будет поглощать нуклеиновую кислоту в процессе экстракции в зависимости от pH и содержания соли в буфере. Процесс абсорбции основан на следующих принципах: водородсвязывающее взаимодействие с гидрофильной матрицей в хаотропных условиях, ионный обмен в водных условиях посредством анионита, а также механизмы сродства и исключения по размеру.

Твердофазную очистку обычно проводят с использованием спин-колонки, работающей под действием центробежной силы [17]. Этот метод позволяет быстро очистить нуклеиновую кислоту по сравнению с обычными методами. Матрицы из диоксида кремния, частицы стекла, диатомовая земля и анионообменные носители являются примерами, которые использовались в методе твердофазной экстракции в качестве твердого носителя. Четыре ключевых этапа твердофазной экстракции - это лизис клеток, адсорбция нуклеиновых кислот, промывка и элюция [6].

Первым шагом в процессе твердофазной экстракции является подготовка колонки для адсорбции пробы.Кондиционирование колонки может быть выполнено с использованием буфера при определенном pH для преобразования поверхности или функциональных групп твердого вещества в определенную химическую форму. [17]. Затем образец, который был разрушен с использованием буфера для лизиса, наносится на колонку. Желаемая нуклеиновая кислота будет абсорбироваться колонкой с помощью высокого pH и концентрации соли связывающего раствора [17]. Другие соединения, такие как белок, также могут иметь прочную специфическую связь с поверхностью колонки. Эти загрязнения могут быть удалены на стадии промывки с использованием промывочного буфера, содержащего конкурентный агент [17].На стадии элюирования вводится ТЕ-буфер или вода, чтобы высвободить нужную нуклеиновую кислоту из колонки, чтобы ее можно было собрать в очищенном состоянии [17]. Обычно на этапах промывки и элюирования процесса очистки требуется быстрое центрифугирование, вакуумная фильтрация или разделение колонок.

Были описаны твердофазная экстракция нуклеиновой кислоты в смешанном слое и ее использование для выделения нуклеиновой кислоты [18]. Твердые фазы смешанного слоя по настоящему изобретению представляют собой смеси по меньшей мере двух различных твердых фаз, могут быть твердыми или полутвердыми, пористыми или непористыми.Каждая твердая фаза может связываться с нуклеиновой кислотой-мишенью в различных условиях раствора и высвобождать нуклеиновую кислоту в аналогичных условиях элюирования [18].

Матрицы кремнезема
Основой для большинства продуктов, связанных с очисткой нуклеиновых кислот, являются уникальные свойства матриц кремнезема для избирательного связывания ДНК. Типы материалов из диоксида кремния, включая частицы стекла, такие как стеклянный порошок, частицы диоксида кремния и стеклянные микроволокна, полученные путем измельчения фильтровальной бумаги из стекловолокна, включая диатомовую землю [19].Матрица из гидратированного диоксида кремния, которую получали кипячением с обратным холодильником диоксида кремния в гидроксиде натрия или гидроксиде калия при молярном соотношении примерно от 2: 1 до 10: 1 в течение по меньшей мере примерно 48 часов, была введена в процесс очистки ДНК. ДНК связывается с неорганической матрицей и высвобождается в нагретой воде [20].
Принцип очистки матриц кремнезема основан на высоком сродстве отрицательно заряженной основной цепи ДНК к положительно заряженным частицам кремнезема [21]. Натрий играет роль катионного мостика, который притягивает отрицательно заряженный кислород в фосфатном остове нуклеиновой кислоты [22].Катионы натрия разрывают водородные связи между водородом в воде и отрицательно заряженными ионами кислорода в кремнеземе в условиях высокой концентрации соли (pH ≤7) [22]. ДНК прочно связана, и тщательная промывка удаляет все загрязнения. Очищенные молекулы ДНК можно элюировать при низкой ионной силе (pH ≥7) позже с использованием буфера ТЕ или дистиллированной воды [21].
Известно, что помимо матриц кремнезема, нитроцеллюлозные и полиамидные мембраны, такие как нейлоновые матрицы, связываются с нуклеиновыми кислотами, но с меньшей специфичностью.Эти материалы часто используются в качестве твердофазных матриц для переноса нуклеиновых кислот и гибридизации [23]. Полиамидные матрицы более долговечны, чем нитроцеллюлоза, и, как известно, необратимо связывают нуклеиновые кислоты. Нуклеиновые кислоты можно иммобилизовать на полиамидных матрицах в буфере с низкой ионной силой [23].

Стеклянная частица
Стеклянные частицы, порошок и шарики пригодны для очистки нуклеиновых кислот. Например, выделение ДНК из агарозных гелей включает использование хаотропных солей для облегчения связывания ДНК с обычным силикатным стеклом, бесцветным стеклом и боросиликатным стеклом (стекловолоконный фильтр).Адсорбция нуклеиновой кислоты на стеклянную подложку, скорее всего, происходит по механизму и принципу, аналогичным адсорбционной хроматографии [24]. Очистку нуклеиновых кислот можно также проводить на смеси силикагеля и стекла [19]. Это изобретение обнаружило, что смесь силикагеля и стеклянных частиц может быть использована для отделения нуклеиновой кислоты от других веществ в присутствии раствора хаотропных солей.

Диатомовая земля
Диатомовая земля, также известная как кизельгур или диатомит, содержит до 94% кремнезема [25].Он использовался для фильтрации и в хроматографии, и он полезен для очистки плазмид и другой ДНК путем иммобилизации ДНК на ее частицах в присутствии хаотропного агента. Затем полученная ДНК, связанная с диатомовой землей, промывается спиртосодержащим буфером. Затем спиртосодержащий буфер удаляется, и ДНК элюируется малосолевым буфером или дистиллированной водой [25].

Очистка нуклеиновых кислот с помощью магнитных шариков
Магнитное разделение - простой и эффективный способ, который в настоящее время используется для очистки нуклеиновых кислот.Многие магнитные носители сейчас коммерчески доступны. Частицы, имеющие магнитный заряд, могут быть удалены с помощью постоянного магнита в приложении магнитного поля. Часто для процесса выделения используются магнитные носители с иммобилизованными аффинными лигандами или полученные из биополимера, демонстрирующего сродство к целевой нуклеиновой кислоте. Например, магнитные частицы, полученные из различных синтетических полимеров, биополимеров, пористого стекла или магнитных частиц на основе неорганических магнитных материалов, таких как оксид железа с модифицированной поверхностью.Для связывания нуклеиновых кислот предпочтительно использовать материалы с большой площадью поверхности. Материалы с магнитными частицами, такие как шарики, более предпочтительны в качестве подложки в процессе изоляции из-за их большей связывающей способности. Процесс связывания нуклеиновой кислоты может поддерживаться нуклеиновой кислотой, «обертывающей» носитель. Магнит может быть приложен к стороне сосуда, который содержит смесь образцов для агрегирования частиц у стенки сосуда и выливания остатка образца [26].
Частицы, обладающие магнитными или парамагнитными свойствами, используются в изобретении, где они заключены в полимер, такой как намагничивающаяся целлюлоза [27]. В присутствии определенных концентраций соли и полиалкиленгликоля намагничивающаяся целлюлоза может связываться с нуклеиновыми кислотами. Небольшая нуклеиновая кислота требует более высоких концентраций соли для прочного связывания с намагничивающимися частицами целлюлозы. Следовательно, концентрацией соли можно выборочно управлять для высвобождения нуклеиновой кислоты, связанной с намагничивающейся целлюлозой, в зависимости от размера.Намагничивающаяся целлюлоза, связавшаяся с нуклеиновой кислотой, будет промыта подходящим промывочным буфером, прежде чем они будут контактировать с подходящим элюирующим буфером для отделения желаемой нуклеиновой кислоты от целлюлозы. Отделение намагничивающейся целлюлозы от надосадочной жидкости на всех этапах очистки может быть выполнено путем приложения магнитного поля, которое притягивает или притягивает их к стенке сосуда [27]. Намагничивающаяся целлюлоза, используемая в этом изобретении, имеет содержание оксида железа примерно до 90% по массе от общей массы целлюлозы.Магнитный компонент целлюлозы также может быть заменен другими магнитными соединениями, такими как оксид железа или оксид никеля [27].
Набор для экстракции, основанный на принципе очистки нуклеиновых кислот с помощью магнитных шариков, коммерчески доступен на рынке [28]. Особенностью этого набора является то, что поставляемые реагенты предназначены для использования с магнитными инструментами. Этот магнитный инструмент рекомендуется использовать при работе с форматом микропробирок. Это практичное устройство для разделения на основе технологии магнитных частиц.Набор не требует каких-либо органических растворителей и исключает необходимость повторного центрифугирования, вакуумной фильтрации или разделения колонок. Протокол основан на модифицированной процедуре щелочного лизиса с последующим связыванием нуклеиновой кислоты с магнитными частицами. Магнитный инструмент используется для захвата магнитных частиц со связанной нуклеиновой кислотой, а загрязнения удаляются промывкой с помощью предусмотренного промывочного буфера. Затем нуклеиновая кислота элюируется с магнитных частиц буфером для элюции [28].
Другой набор для экстракции работает по тому же принципу, что и описанная выше экстракция, в которой для очистки нуклеиновых кислот использовалась технология магнитных частиц [29]. Он сочетает в себе скорость и эффективность очистки ДНК на основе диоксида кремния с удобством работы с магнитными частицами. Магнитный стержень, защищенный крышкой стержня, используется для захвата магнитных частиц. Он попадает в сосуд с образцами и притягивает магнитные частицы. Затем крышка магнитного стержня помещается над другим сосудом, и магнитные частицы высвобождаются [29].
Очистка нуклеиновой кислоты с использованием гранул диоксида циркония - это еще один тип очистки на основе магнитных гранул. Эти микросферические парамагнитные шарики имеют большую доступную поверхность связывания и могут быть диспергированы в растворе. Эта характеристика позволяла тщательно связывать, промывать и элюировать нуклеиновые кислоты. Набор для выделения полной нуклеиновой кислоты, в котором используется эта технология для очистки нуклеиновой кислоты, использует механическое разрушение образцов с помощью гранул диоксида циркония в растворе на основе тиоцианата гуанидиния, который не только высвобождает нуклеиновую кислоту, но и инактивирует нуклеазу в матрице образца [ 30].После стадии лизиса образцы разбавляются изопропанолом. Парамагенетические гранулы добавляют к образцам для связывания нуклеиновых кислот. Смесь гранул и нуклеиновой кислоты иммобилизуют на магнитах и ​​промывают для удаления белка и загрязнений. Удаление остаточного связывающего раствора выполняется вторым промывочным раствором, и, наконец, нуклеиновая кислота элюируется буфером с низким содержанием соли [30].
Твердофазная технология на основе парамагенетических шариков с обратимой иммобилизацией была использована в системе очистки ПЦР для получения качественной ДНК.Это требует простого протокола без центрифугирования и фильтрации. Ампликоны ПЦР связываются с парамагенетическими частицами, которые выводят их из раствора, позволяя смывать такие загрязнители, как dNTP, праймеры и соли [31].
Магнитный олиго (dT) шарик является альтернативой другим олиго (dT) матрицам для очистки поли РНК из образца тотальной РНК [4]. Поли РНК можно экстрагировать путем введения магнитных шариков, покрытых олиго (dT). РНК с поли-А-хвостом присоединяется к олиго (dT). Затем шарики будут вытягиваться на дно пробирки, удаляя мРНК непосредственно из общей РНК.Специально обработанные магнитные шарики минимизируют неспецифическое связывание других нуклеиновых кислот и обеспечивают чистоту мРНК [32].

Анионообменный материал
Анионообменная смола - один из популярных примеров, в котором используется принцип анионного обмена [33]. Он основан на взаимодействии между положительно заряженными группами диэтиламиноэтилцеллюлозы (DEAE) на поверхности смолы и отрицательно заряженными фосфатами основной цепи ДНК. Анионообменная смола состоит из гранул диоксида кремния с большим размером пор, гидрофильного поверхностного покрытия и высокой плотности заряда [34].Большая площадь поверхности смолы позволяет плотно связывать группы DEAE. Смола работает в широком диапазоне условий pH (pH 6–9) и / или концентрации соли (0,1–1,6 M), что может оптимизировать отделение ДНК от РНК и других примесей [34]. Следовательно, концентрация соли и условия pH буферов являются одним из основных факторов, определяющих, связана ли нуклеиновая кислота или элюируется из колонки. ДНК может связываться с группой DEAE в широком диапазоне концентраций соли. Примеси, такие как белок и РНК, вымываются из смолы с использованием буферов со средним содержанием соли, в то время как ДНК остается связанной до тех пор, пока не будет элюирована буфером с высоким содержанием соли [34].
Метод использования анионообменных материалов для выделения нуклеиновой кислоты был раскрыт в изобретении [35], где использовались коммерчески доступные сильные или слабые положительно заряженные анионообменные материалы с выбранными растворами с известной ионной силой для адсорбции и элюирования. Большинство водорастворимых компонентов, таких как белок, можно промыть через колонку, используя раствор с известной ионной силой для связывания нуклеиновых кислот с материалами анионообменной колонки.Ионная сила для элюирования создается за счет использования известной концентрации соли, которая смешивается с буфером для контроля силы pH, в идеале соответствующей самой низкой ионной силе, при которой нуклеиновые кислоты будут полностью элюироваться [35].

3.2. Тип экстракции белка Метод

Первым этапом очистки белка является лизис клеток. Чтобы эффективно очищать и анализировать белок, они должны быть сначала высвобождены из клетки-хозяина в растворимой форме. Плазматическая мембрана клеток млекопитающих, состоящая из фосфолипидов и белков, легко разрушается [36].Для сравнения, экстракция белка из грибов и бактерий кажется более сложной задачей из-за их стабильной клеточной стенки, которая прочнее плазматической мембраны.

Ткани растений содержат широкий спектр белков, которые различаются по своим свойствам. Некоторые специфические факторы необходимо учитывать при разработке протокола экстракции белка для растений [37]. Например, наличие жесткой клеточной стенки из целлюлозы необходимо разрезать, чтобы высвободить содержимое клетки. Конкретные загрязняющие соединения, такие как фенольные соединения и ряд протеиназ, могут приводить к деградации или модификации белка.Поэтому для экстракции и очистки белка из растений требуются особые условия [38].

Для удаления клеточной стенки используются методы механического разрушения, такие как French Press или стеклянные шарики, с последующей экстракцией общего белка на основе детергента [39].

3.2.1. Ионообменная хроматография

Ионообменная хроматография разделяет белки на основе их поверхностного ионного заряда с использованием смол, которые модифицированы положительно или отрицательно заряженными химическими группами [4, 7].Большинство белков имеют общий отрицательный или положительный заряд в зависимости от их изоэлектрической точки (pI) при заданном pH, что позволяет им взаимодействовать с противоположно заряженной хроматографической матрицей [7]. Если чистый заряд белка положительный при pH ниже значения pI, белок будет связываться с катионитом; при pH выше значения pI чистый заряд белка отрицательный, и белок будет связываться с анионообменником [38].

Белки, которые слабо взаимодействуют со смолами, например, слабый положительно заряженный белок, пропущенный через смолу, модифицированную отрицательно заряженной группой, элюируются в буфере с низким содержанием соли.С другой стороны, белки, которые сильно взаимодействуют, требуют для элюирования большего количества соли. Белки с очень похожими зарядовыми характеристиками могут быть разделены на разные фракции по мере их элюирования из колонки путем увеличения концентрации соли в элюирующем буфере [7].

Ионообменная колонка - одна из технологий, использующих принцип ионообменной хроматографии [33]. Он использует мембранно-абсорбционную технологию в качестве хроматографической матрицы для разделения белков. Мембранные абсорбенты в колонках изготовлены на основе стабилизированной целлюлозы с высокопористой структурой, которая обеспечивает легкий доступ белков к заряженной поверхности.Взаимодействие между молекулами и активными центрами на мембране происходит в конвективных сквозных порах. Следовательно, адсорбционные мембраны могут поддерживать высокую эффективность при очистке больших биомолекул с низкой диффузией [33].

3.2.2. Гель-фильтрационная хроматография

Гель-фильтрационная хроматография, также называемая эксклюзионной или гель-проникающей хроматографией, разделяет белки в соответствии с размером и формой молекул, при этом молекулы не связываются с хроматографической средой [39].Это процесс, при котором большие молекулы проходят через колонку быстрее, чем маленькие. Маленькие молекулы могут проникать во все крошечные отверстия матрицы и получать доступ к большей части столбца. Белки малого размера будут проходить через эти отверстия, и им потребуется больше времени, чтобы вытечь из колонки, по сравнению с белками большого размера, которые не могут попасть в эти отверстия, но выходят прямо из колонки через пустое пространство в колонке [4, 7].

Набор для гель-фильтрационной хроматографии использует принцип гель-фильтрационной хроматографии [40].Целевой образец наносят поверх столбца, который содержит пористые шарики, пример матрицы в столбце. Молекулы разделяются, когда молекулы проходят через столбик пористых шариков. Разделение молекул можно разделить на три основных типа: полное исключение, избирательная проницаемость и общий предел проницаемости. Полное исключение - это та часть, из-за которой большие молекулы не могут проникать в поры и быстро элюироваться. Для области селективного проникновения промежуточные молекулы могут проникать в поры и могут иметь среднее время пребывания в частицах в зависимости от их размера и формы.Что касается предела общего проникновения, маленькие молекулы имеют наибольшее время пребывания, когда они попадают в поры колонки [40]. Преимущество хроматографии на основе гель-фильтрации заключается в том, что она подходит для биомолекул, которые могут быть чувствительны к изменениям pH, концентрации ионов металлов и суровым условиям окружающей среды [39].

3.2.3. Аффинная хроматография

Аффинная хроматография зависит от конкретного взаимодействия между белком и твердой фазой, которое влияет на отделение от примесей.Он состоит из тех же этапов, что и ионообменная хроматография [38]. Он позволяет очищать белок на основе его биологической функции или индивидуальной химической структуры [41]. Белки, обладающие высоким сродством к определенным химическим группам, таким как лиганды, будут ковалентно присоединяться и связываться с матрицей столбца, в то время как другие белки проходят через столбец [38]. Электростатические или гидрофобные взаимодействия, силы Ван-дер-Ваальса и водородные связи - это биологические взаимодействия между лигандами и белками-мишенями [41].Связанные белки будут элюированы из колонки раствором, содержащим высокую концентрацию растворимой формы лиганда [36].

Биоспецифический лиганд, который может ковалентно присоединяться к хроматографической матрице, является одним из требований для успешной аффинной очистки. Связывание между лигандом и молекулами белка-мишени должно быть обратимым, чтобы белки могли быть удалены в активной форме [41]. После смывания загрязнений связанный лиганд должен сохранять свое специфическое сродство связывания с целевыми белками.Некоторые примеры биологических взаимодействий, которые обычно используются в аффинной хроматографии, перечислены в таблице 1 (см. [41]).

909, кофактор

Типы лигандов Целевые молекулы

Фермент Субстратный аналог клетки
Лектин Полисахарид, гликопротеин, рецептор клеточной поверхности, клетка
Нуклеиновая кислота Комплементарная последовательность оснований, гистоны, полимераза нуклеиновой кислоты, белок, связывающий нуклеиновую кислоту
Гормон-носитель, рецептор , витамин
901
Глутатион Слитые белки глутатион-S-трансферазы или GST
Ионы металлов Слитые белки Poly (his), нативные белки с гистидином, цистеином и / или остатками триптофана на их поверхности
900 02 Хроматографическое разделение по дифференциальному сродству к лигандам, иммобилизованным на гранулированной пористой смоле, является фундаментальным для исследования белков [42].На рынок выпущен полный набор, который содержит шариковые колонки с аффинной смолой, основанный на принципе аффинной хроматографии [42]. Аффинную смолу можно использовать в формате периодической или микроцентрифужной спин-колонки в зависимости от масштаба и типа проводимого эксперимента. Кроме того, он может быть упакован в какую-либо более крупную гравитационную колонну [42].

3.2.4. Гель-электрофорез

Гель-электрофорез - это метод разделения белков в соответствии с их размером и зарядовыми свойствами.Частично очищенный белок из хроматографических разделений можно дополнительно очистить с помощью неденатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле (PAGE) или электрофореза в нативном геле [4]. В PAGE белки управляются приложенным током через гелеобразную матрицу [43]. Движение белка через этот гель зависит от плотности заряда (заряда на единицу массы) молекул. Молекулы с зарядом высокой плотности быстро мигрируют. Размер и форма белка - еще два важных фактора, влияющих на фракционирование в ПААГ [43].Размер пор акриламида играет роль молекулярного сита для разделения белков разного размера [4]. Чем больше белок, тем медленнее он мигрирует, поскольку он больше запутывается в геле [43]. Форма также является одним из факторов, поскольку компактные глобулярные белки перемещаются быстрее, чем удлиненные волокнистые белки сопоставимой молекулярной массы [43].

ПААГ обычно проводят в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) [44]. Белок, обработанный SDS, обычно устраняет вторичную, третичную и четвертичную структуру белка [4, 7].Белки разворачиваются в подобную стержнеобразную форму из-за электростатического отталкивания между связанными молекулами SDS. Количество молекул SDS, которые связываются с белком, приблизительно пропорционально молекулярной массе белка (около 1,4 г SDS / г белка) [43]. Каждый вид белка имеет эквивалентную плотность заряда и проходит через гель с одинаковой силой [43]. Кроме того, PAGE может минимизировать денатурацию белков. Многие белки все еще сохраняют свою биологическую активность после выполнения PAGE [7].Однако более крупные белки удерживаются в большей степени, чем более мелкие белки, потому что полиакриламид сильно сшит [43]. Следовательно, белки разделяются с помощью SDS-PAGE на основе их молекулярной массы. SDS-PAGE можно использовать для определения молекулярной массы смеси белков путем сравнения положений полос с полосами, продуцируемыми белками известного размера [43]. SDS, используемый в электрофорезе, разрешает смесь белков в соответствии с длиной отдельных полипептидных цепей [7].

Метод, называемый двумерным гель-электрофорезом, был разработан Патриком О’Фарреллом в 1975 году. Он используется для фракционирования сложных смесей белков с использованием двух различных методов - изоэлектрического фокусирования и SDS-PAGE [43]. Сначала белки разделяются в соответствии с их изоэлектрической точкой в ​​трубчатом геле. После этого разделения гель удаляют и помещают на пластину из полиакриламида, насыщенного SDS. Белки перемещаются в пластинчатый гель и разделяются в соответствии с их молекулярной массой [43].Двумерный гель-электрофорез подходит для обнаружения изменений белков, присутствующих в клетке в различных условиях, на разных стадиях развития или клеточного цикла или в разных организмах [43].

3.2.5. Юго-западный блоттинг (иммуноблоттинг)

Юго-западный блоттинг - это метод, который используется для выделения, идентификации и характеристики ДНК-связывающих белков по их способности связываться со специфическими олигонуклеотидными зондами [44, 45]. Многие ДНК-связывающие белки в клетке необходимо выделить индивидуально и охарактеризовать, чтобы определить функцию гена [44].Этот метод состоит из трех этапов. Сначала экстракты ядерных белков разделяют электрофорезом в SDS-PAGE. Затем разделенные белки переносятся на нитроцеллюлозный фильтр, поливинилидендифторид (ПВДФ) или катионную нейлоновую мембрану [12]. Затем фильтр будет инкубирован с олигонуклеотидными зондами для анализа адсорбированных белков [44, 45]. Однако этот метод сталкивается с такими проблемами, как необходимость в больших количествах ядерных белков (обычно 50–100 мг), деградация белка во время выделения, трудности в достижении эффективного электрофоретического разделения и переноса белков в широком диапазоне молекулярных размеров [45]. .

3.3. Экстракция биомолекул «все в одном»

Как правило, доступные на рынке методы экстракции или очистки или наборы позволяют извлекать только один тип нуклеиновой кислоты, ДНК, РНК или белок, из организма-мишени. Когда клеточный материал ограничен, желательно извлекать ДНК, РНК и белок из одного источника.

Вариант одностадийного метода выделения Chomczynski и Sacchi (1987), в котором гомогенат тицианата гуанидиния экстрагируется фенолом: хлороформом при пониженном pH, позволяет получать ДНК, РНК и белок из ткани или клеток.Этот метод включает лизис клеток изотиоцианатом гуанидина и фенолом в однофазном растворе. Вторая фаза образуется после добавления хлороформа, где ДНК и белки экстрагируются, оставляя РНК в водном супернатанте. ДНК и белки могут быть выделены из органической фазы осаждением этанолом или изопропанолом, а РНК осаждена из водной фазы изопропанолом [15].

В настоящее время на рынке представлено несколько комплектов для экстракции «все в одном».Например, набор для экстракции на колонке, предназначенный для одновременной очистки геномной ДНК, общей РНК и общего белка из одного биологического образца без использования токсичных веществ, таких как фенол или хлороформ, и осаждения спиртом [46]. Он совместим с небольшими количествами широкого спектра культивируемых клеток и собранных тканей животного и человеческого происхождения. Целевой образец не нужно разделять на 3 части перед очисткой ДНК, РНК и белка [46].

Набор для экстракции 3-в-1 на основе раствора, доступный на рынке, является еще одним примером набора для неорганических растворов, который может извлекать и очищать ДНК, РНК и белок из различных организмов любых типов и размеров [47] .Его протокол из трех простых шагов, который занимает от 15 до 30 минут, обеспечивает быстрый и простой способ извлечения различных биомолекул. Следовательно, можно ожидать более высокого выхода, поскольку меньшее количество шагов приводит к меньшим потерям [47].

3.4. Автоматическая система экстракции

Автоматизированная система экстракции, большая, дорогая и сложная аппаратура, разработанная для высокопроизводительной обработки образцов, помогла упростить выделение нуклеиновых кислот [48]. Эта система была разработана для средних и крупных лабораторий, количество которых выросло за последние годы [49].Автоматизация процесса экстракции нуклеиновых кислот потенциально выгодна по ряду причин, в том числе для сокращения рабочего времени, снижения затрат на рабочую силу, повышения безопасности труда, а также дает возможность повышения воспроизводимости и качества результатов [50]. Кроме того, это ключевое решение для повышения эффективности лаборатории [48] .

В клинических лабораториях очистка высококачественных биомолекул, таких как ДНК, РНК и белок, от различных исходных материалов будет использоваться в последующих испытаниях.Очень важно получить очищенные образцы достаточного качества и чистоты [48]. Следовательно, автоматические экстракции должны быть более последовательными и воспроизводимыми. Скорость, точность и надежность всего процесса экстракции должны быть максимальными и в то же время минимизировать риск перекрестного загрязнения [49]. Необходимо найти решение для повышения эффективности пробоподготовки без ущерба для качества. Возможность перекрестного загрязнения должна быть уменьшена, и системы должны быть приспособлены для отслеживания образцов со штрих-кодом [51].

Система экстракции, доступная на рынке, удовлетворяет указанным выше требованиям. Он предлагает лабораториям судебной экспертизы быструю и надежную обработку образцов наряду с высококачественной автоматической очисткой ДНК [52]. Это система обработки парамагнитных частиц для обработки образца и обеспечения постоянного выхода и чистоты, поскольку нет обнаруживаемого перекрестного загрязнения между образцами. Весь процесс экстракции занимает около 20 минут от начала до конца, потому что нужно всего три простых шага: добавить жидкие образцы в картридж с реактивами; поместите картриджи с реактивами в аппарат; нажмите кнопку Пуск.В конце процесса ДНК элюируется в буфер для элюции [52].

Был представлен еще один пример автоматизированной системы, которая является гибкой и эффективной для экстракции нуклеиновых кислот и белков [53]. С помощью этой системы можно обрабатывать различные исходные материалы, которые предназначены для малых и средних проб. Он использовал функционализированные на поверхности парамагнитные частицы для адсорбции выделенной нуклеиновой кислоты [53]. Гибкость этой системы позволяет извлекать нуклеиновую кислоту из двенадцати образцов одновременно.Процесс экстракции занимает от 20 до 40 минут в зависимости от области применения. Наборы, оптимизированные для этой системы, могут извлекать геномную ДНК, клеточную РНК, вирусные или бактериальные нуклеиновые кислоты [53].

4. Возможное направление в будущем

Извлечение биомолекул - это первый шаг, который необходимо выполнить для последующего анализа или процесса манипуляции. Требование обращения с жидкостью - самый сложный аспект. Следовательно, любая автоматическая система должна включать в себя не только автоматическое оборудование для каждой стадии экстракции, но и оборудование для автоматизации передачи жидкости между машинами.Автоматизация помогла увеличить производительность и надежность процесса, но эти системы по-прежнему предназначены для использования только в лабораторных условиях. Некоторые системы экстракции нуклеиновых кислот, доступные на рынке, имеют большие размеры и требуют ручной предварительной обработки лабораторным персоналом с техническими знаниями [54]. Таким образом, роботизированные рабочие станции для экстракции нуклеиновых кислот должны выполнять настоящую автоматизацию «от руки», что означает полностью автоматизированный процесс [49].Комбинация универсального раствора и метода экстракции биомолекул с полностью автоматизированной системой экстракции может стать перспективным изобретением в будущем. Очистка ДНК, РНК или белка от различных организмов может выполняться одновременно с использованием этого типа экстракционной системы с помощью всего лишь одного метода экстракции.

Часто бывает неудобно отправлять образец целевых биомолекул животного, растения или даже клинический образец в лабораторию для его извлечения и анализа [54].Образцы, особенно клинические образцы, такие как кровь, необходимо охладить и передать в ближайшую лабораторию для извлечения и анализа. Следовательно, портативная система экстракции биомолекул, которая дает несколько преимуществ, таких как сокращение трудозатрат, уменьшение отходов и повышенная скорость процесса экстракции, может быть потенциальной разработкой в ​​будущем [54]. Комбинация портативной системы экстракции с анализатором ДНК, РНК или белков может быть создана в будущем, чтобы помочь исследователям сократить рабочее время и повысить эффективность работы.

Дальнейшее совершенствование миниатюризации станет будущей тенденцией роботизированной автоматизации в лаборатории [28]. Многие клинические лаборатории проводят анализ рабочего процесса и обнаруживают, что системы меньшего размера с меньшей пропускной способностью больше соответствуют рабочей нагрузке клинических лабораторий. Кроме того, эта система автоматизации может быть реализована с относительно низкими затратами, что сокращает время выполнения работ, а также снижает трудозатраты [55].

5. Заключение

Поскольку первое выделение ДНК было успешно выполнено Фридрихом Мишером в 1869 году, а первоначальная экстракция ДНК была разработана Мезельсоном и Шталем в 1958 году на основе стратегий центрифугирования в градиенте плотности, было разработано множество методов очистки биомолекул.От экстракции тиоцианат-фенол-хлороформ гуанидиния до колоночной технологии, которая широко используется для экстракции ДНК и РНК, и метода очистки хроматографии до иммуноблоттинга, который используется для экстракции белков, экстракция биомолекул помогла исследователям и ученым в манипулировании последующим молекулярно-биологическим анализом, чтобы чтобы лучше понимать биологические материалы Земли.

Автоматизированная система экстракции нуклеиновых кислот была разработана благодаря влиянию быстрого роста технологий автоматизации в настоящее время.Автоматизация процесса экстракции нуклеиновых кислот потенциально выгодна по ряду причин, в том числе для сокращения рабочего времени, снижения затрат на рабочую силу, повышения безопасности труда и в то же время дает возможность повысить воспроизводимость и качество результатов. Однако устранение недостатков некоторых инструментов необходимо проводить постоянно. Между тем, универсальная система экстракции биомолекул или изобретение миниатюрной и портативной системы экстракции может стать перспективным развитием в будущем.

генетика ppt сорт 9

Слайды с 3D-персонажами CrystalGraphics для PowerPoint, - Слайды с 3D-персонажами CrystalGraphics для PowerPoint. - Ночь для родителей / учеников 9-го класса Тиффани Гарсия (A Fe) Лианн Лау (Fi K) Йоко Друтен (L Ra) Таня Барриклоу (Re Z) Колледж Холли Хеллер ... ВСТРЕЧА С РОДИТЕЛЯМИ 9-ГО КЛАССА ДАМАСКА. Краткое содержание курса ПРИЛОЖЕНИЯ НА КОМПЬЮТЕРЕ: Предварительное условие для других классов (см. Стр. 27 в Каталоге курсов ... Руководство для 9-го класса Путь к выпускному и последующему обучению.... Сохраните этот шаблон как презентацию (файл .ppt) на своем компьютере. Девятый класс Генетика. Восьмой класс; 21,031 Просмотров. Наследственность: Генетика Дракона. Перечислите 3 фактора, влияющих на рост населения. Наша команда университетских ученых, учителей средних классов, учащихся средних школ разработала и протестировала упражнения в школьных условиях. 11 класс Программа академической биологии. Ответьте на вопросы 1–5 на странице 153. Деление клеток и молекулярная генетика. Изменить), вы комментируете, используя свою учетную запись Google.Напишите вопрос И ответ! Добро пожаловать на собрание родителей восьмиклассников! Обязательные курсы Английский I или английский с отличием Библия История древнего мира Биология или биология С отличием Физическая культура / здоровье Мистер Белл ... | Презентация PowerPoint PPT | бесплатно для просмотра. 9 класс. Научный блок № 3: Репродукция и человеческое развитие. Тема № 1 - Генетическая информация передается от родителей к потомкам. Тема урока Что вы узнаете: 1 Вариации и характеристики - Вариации могут быть дискретными или непрерывными. Все предметы. Просмотр и загрузка презентаций PowerPoint по неменделирующей генетике PPT.Чтобы изучить это, он селекционировал растения гороха, потому что их было легко изучать. PPT: Введение в генетику и МИТОЗ. RST.11-12.9 Синтезировать информацию из ряда источников (например, тексты, эксперименты, моделирование) в согласованное понимание процесса, явления или концепции, разрешая противоречивую информацию, когда это возможно. Найдите презентации и слайды PowerPoint с помощью XPowerPoint.com, найдите бесплатные исследования презентаций о неменделевской генетике PPT Change), вы комментируете, используя свою учетную запись Facebook.ХО - Мейоз. Бесплатные презентации Power Point по биологии / наукам о жизни. PPT по биохимии, PPT по биотехнологии, PPT по микробиологии, PPT по молекулярной биологии, PPT по экологии, PPT по генетике Урок генетики включает в себя PowerPoint с упражнениями, разбросанными по всему сайту, чтобы учащиеся были вовлечены. Биохимия PPT, Биотехнология PPT, Микробиология PPT, Молекулярная биология PPT, Экология PPT, Генетика PPT 5 зачетный курс и третий в конце 11 и 12 классов… См. Больше идей о наследственности, генетике, унаследованных чертах.Genetics ppt 179 276 просмотров. Срок сдачи: вторник, 29 апреля. PowerShow.com - ведущий веб-сайт для обмена презентациями и слайд-шоу. Восьмой класс Генетика. Конспект лекций: Принципы генетики (SGS 124). Просмотр по оценке и теме. Краткое содержание презентации: 6 научных концепций. Каждое занятие INB призвано помочь студентам разделить информацию на части для лучшего понимания концепции. Одиннадцатый класс биологии. 7702 Tania Barricklow (Ng-Z ... Georgetown High School Выступление учеников 9-го класса, февраль 2014 г.)Урок 20: Структура и функции ДНК. Николь О'Нил. Набор студенческих заметок также включен в PowerPoint. Бесплатные фоны PowerPoint. Для всех шаблонов наследования мы будем делать квадраты Пеннета в классе. 9 класс - Хромосомная основа наследования 1. Или используйте его для загрузки ваших собственных слайдов PowerPoint, чтобы вы могли поделиться ими со своими учителями, классом, студентами, начальниками, сотрудниками, клиентами, потенциальными инвесторами или всем миром. 2-й периодический уровень 9. Tes Global Ltd зарегистрирована в Англии (компания № 02017289) с зарегистрированным офисом по адресу 26 Red Lion Square London WC1R 4HQ.С. 142-147. - Вечер информации для родителей 9 и 10 классов Понедельник, 21 сентября. График первого года обучения. Переход в старшую школу КОМПАС (январь) Конференции под руководством учеников: октябрь ... Завершите нашу выпускную школу и последующий план 3. PPT - Практические задачи с двумя характеристиками Punnett Square HO - Two-Trait… Kapiel, T. (2006). (Выйти / Изменить), официальный блог отдела наук Академии Проспект Хилл, Еженедельные листы заданий по наукам о жизни 7-го класса, Дополнительные документы по наукам о жизни в 7-м классе, Еженедельные листы заданий и учебный план БИОЛОГИИ 9, 2011-2012 гг., Архивные материалы Powerpoints по химии (2009- 2010), http: // www.microsoft.com/downloads/details.aspx?FamilyId=941B3470-3AE9-4AEE-8F43-C6BB74CD1466&displaylang=en, Движение через мембраны (9B Powerpoint Notes), Характеристики и классификация живых существ. PPT - Менделирующая генетика и КВАДРАТЫ ПАННЕТТА. Загружено пользователем. В частности, он охватывает основы теоретической генетики, включая РАЗДЕЛ 9: ЭКОЛОГИЯ Шаблон плаката разыскиваемого объекта РАЗДЕЛ 8: ЭВОЛЮЦИЯ Свидетельства об эволюции Заметки о видах и видах Заметки по эволюции и естественному отбору РАЗДЕЛ 7: ГЕНЕТИКА.Математические занятия включают элементы учебной программы 6-8 классов с упором на 7 класс. Найдите все заметки в PowerPoint и словарь здесь: Введение в генетику: структура и репликация ДНК, квадраты Пеннета, законы Менделя и генетический словарь.Если вам когда-либо понадобится файл PowerPoint или другой документ, которого нет на этой странице, не стесняйтесь свяжитесь с одним из инструкторов по электронной почте! Силовая установка. Назначение мейоза. ), Блок 2 - Ячейки: основные примечания и схемы; 9B Daily Powerpoints, Блок 1 - Введение в биологию: характеристики и классификация живых существ, 9A неделя 2 ppt 9A неделя 3 ppt 9A неделя 4 9A неделя 5, 9C неделя 2 ppt 9C неделя 3 ppt 9C неделя 4 9C неделя 5, 9D неделя 2 ppt 9D неделя 3 ppt 9D неделя 4 9D неделя 5.Этот ресурс разработан в соответствии с новой спецификацией по биологии AQA GCSE (Grade 1-9). Это никоим образом не предназначено для включения; скорее, это должно быть трамплин для учительской мысли и творчества. - Название: Слайд 1 Автор: Администратор Последнее изменение: Ватсон, Нэнси Дата создания: 19.02.2010 23:33:31 Формат представления документа: экранное шоу (4: 3) Другие заголовки, - 8-й класс Родительский вечер Добро пожаловать в среднюю школу Северного Харрисона Джефф Хаффман, советник AL [email protected] Келли Стоун, советник MZ, Государственные школы округа Клейтон Подготовка к успешному планированию для старшеклассников, поступающих в 9-й класс в 2014–2015 годах.РАЗДЕЛ 9: Шаблон плаката о розыске в области ЭКОЛОГИИ РАЗДЕЛ 8: ЭВОЛЮЦИЯ Свидетельства об эволюции Заметки по видам и видам Заметки по эволюции и естественному отбору РАЗДЕЛ 7: ГЕНЕТИКА. 7-й класс Информация о подразделении естествознания и генетики Вехи Область / Вес: Клетки и генетика (включая человеческое тело) 35% Цель / цели: В области «Клетки и генетика» знания генетического содержания включают осознание важности генов и хромосомы в процессе наследования определенного признака и механизмы воспроизводства.7. Этот блок, следующий за блоком II: Химические и клеточные основы жизни, завершает учебную программу 10-го класса. Бесплатная загрузка Genetics PowerPoint. Карта сайта. Новые требования к выпускным! Учащиеся старших классов просматривают слайд-презентацию о генетике и изучают теории Грегора Менделя, а также сложные… ВОПРОСЫ: Митоз. Обладая впечатляющим набором дизайнов, они поддержат ваши презентации вдохновляющими фоновыми фотографиями или видео, которые поддерживают ваши темы, задают правильное настроение, повышают доверие к вам и вдохновляют вашу аудиторию.Набор вопросов по мейозу. УРОК 3. 30 декабря 2020 г. Этот бесплатный шаблон PPT имеет генетическую строку, которая представляет собой функциональную сеть ассоциаций белков, последовательность анимокислот, темы белков генов, генетическое программирование, генетические нарушения, шаблон PowerPoint генной инженерии, PPT менделевской генетики, генетически модифицированный организмов, генетические нарушения человека PowerPoint. Адитья Вайшнав. Все вещицы. Это книга по истории - повествование о путешествии нашего вида во времени. Наследственность и генетика Часть вторая Дигибридные скрещивания Обзор моногибридных скрещиваний Помните, моногибридные скрещивания включают только ОДИН признак. Практика У плодовых мушек красные глаза... - Бесплатная презентация PowerPoint PPT (отображается как Flash-слайд-шоу) на PowerShow.com - id: 41d1c6-MmFkO Пожалуйста, оставьте место в своих заметках, чтобы добавить их. Примечания по генетике: Введение в генетику PowerPoint - это презентация в формате PowerPoint из 28 слайдов, предназначенная для ознакомления (или усиления) экспериментов Менделя, аллелей и квадратов Пеннета. Генетика Генетика Изучение наследственности, как черты передаются от родителей к потомству x = или или Изучение наследственности началось с работы Грегора Менделя и его сада гороховых растений. Мендель был австрийским монахом, жившим в середине 1800-х годов. Мендель отметил, что размер растений гороха разнообразный.У вас есть слайды PowerPoint, которыми вы хотите поделиться? Большие идеи Prezi 2021: советы экспертов на новый год; 15 декабря 2020 г. ** Обратите внимание, что в моей школе этот модуль преподается в 9-м классе, поэтому эти слайды не очень подробны и предназначены скорее для обзора, чем для первого подхода. Требования к выпускному экзамену для первокурсника Требования SOL Требования к зачетным единицам Расчет среднего балла ... - Ночь регистрации родителей в 9-м классе CHHS Готовы? Все началось с Менделя и его растений, но, боже мой, как мы продвинулись.3.23 Оценка наследственности и генетики. (HS-LS3-1) WHST.9-12.1 Напишите аргументы, ориентированные на содержание конкретной дисциплины. 9 класс естествознания. Структура клетки: 9 класс, понимание биологии IGCSE 2.2 2.3 2.4 31 июля 2019 г .; Пищеварительный тракт человека: 9-й класс, понимание биологии IGCSE 2.27 26 июля 2019 г .; Гормоны: 9 класс, понимание биологии IGCSE 2.94 2.95B 25 июля 2019 г .; Сравнение нервной и гормональной координации: 9-й класс Понимание биологии IGCSE 2.86 18 июля 2019 г. Шаблон раздела для 10-го класса Раздел III Генетика и биотехнология, 2008 г. Министерство образования штата Делавэр Страница 2 из 21 Рекомендуемая учебная программа штата Делавэр Предисловие: Этот раздел был создан в качестве модели для учителей при разработке или изменении учебных программ.- Добро пожаловать на встречу с вашими консультантами в 9-м классе. Февраль 2014 г. Мы обсудим, как читать транскрипт. Требования к выпуску AG UC / CSU. Встреча преподавателей и сотрудников Саммита Uplift. Это интерактивные руководства, в которых основное внимание уделяется… Какой тип роста проходит в период. Создано: 12 мая 2020 г. РАЗДЕЛ 7: ГЕНЕТИКА. Введение в генетику PPT (Введение в принципы генетики PPT) Концепция генетики, Грегор Иоганн Мендель - Отец генетики, Повторное открытие менделевских концепций, Современные ветви генетики, Терминологии в генетике: ген, аллель и локус / локусы, доминант и Рецессивные аллели, генотип и фенотип, гомозиготные и гетерозиготные, гибридные, моногибридные и дигибридные, F1… Он скрестил эти растения гороха, чтобы получить некоторые удивительные результаты.УРОК 4. Уважаемый преподаватель средних классов! Изучение генетики в рамках средней школы Учебная программа по естествознанию и математике была разработана с учетом ваших потребностей. Чтобы просмотреть эту презентацию, вам необходимо разрешить Flash. - Повестка дня консультационной службы родительского собрания 9-го класса Контакт с консультантами Требования к выпускному экзамену и процедуры регистрации в HSA Размещение ... Вечер информации для родителей 9-го и 10-го классов. 2 Глава 1 Введение в молекулярную генетику и геномику. И, что лучше всего, большинство его интересных функций бесплатны и просты в использовании.Что такое ДНК? Презентации PowerPoint по биологии можно загрузить бесплатно. Вы можете связаться с нами по электронной почте мисс Бротман (kbrotman) или мисс Диксон (adickson) @ prospecthillacademy.org. ГЕНЕТИКА - Изучение того, как животные и растения передаются своему потомству, например: цвет глаз, цвет волос, рост, телосложение, группа крови, интеллект, пол и т. Д. ВОПРОСЫ: Митоз. Они придадут вашим презентациям профессиональный, запоминающийся вид - такой изысканный вид, которого ожидает сегодняшняя аудитория. И это преобразующий учебник медицины, содержащий идеи, которые предоставят поставщикам медицинских услуг огромные новые возможности для лечения, предотвращения и лечения болезней.«После того, как вы включите Flash, обновите эту страницу, и презентация должна начаться. Получает идентичный набор хромосом (Глава 4). 5. Набор вопросов по мейозу. Genetics Powerpoint.pptx. Открыть Это книга истории - повествование о путешествии нашего вида во времени. Эта презентация "Введение в генетику" подходит для 9–12 классов. PPT - Менделирующая генетика и ПАННЕТТ-КВАДРАТ. Бесплатные вещицы Без ограничения по времени × О случаях STEM. (HS-LS3-2)… Оценка: 9 "V ". Это подразделение исследует способ классификации живых организмов, характеристики живых существ и уделяет особое внимание царствам бактерий.Можно загрузить или загрузить файлы PDF в формате PD или файлы в формате DOC и PPT PPT о книгах по физическим и физическим наукам для 12 класса. 13 октября 2017 г. - Изучите доску Алесии Хуберт «Генетика и наследственность», за которой следят 130 человек на Pinterest. (Выйти / (Выйти / HO: Фазы МИТОЗА. Джульет Илето Вильяруэль. Перечислить некоторые ограничивающие факторы, зависящие от плотности). - Успешное планирование государственных школ округа Клейтон Подготовка для старшеклассников, поступающих в 9-й класс в 2014–2015 гг. для 9 класса... - Ночь для родителей в восьмом классе WHS Тиффани Гарсия (A - He) [email protected] Ext. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГЕНЕТИКИ В СРЕДНИХ ШКАФАХ УЧЕБНОЕ РУКОВОДСТВО ПО НАУКЕ И МАТЕМАТИКЕ Это руководство было разработано, чтобы использовать междисциплинарный и основанный на запросах учебный потенциал генетики в естественных и математических науках. УЧЕБНАЯ ПРОГРАММА БИОЛОГИИ КОЛЛЕДЖА 11 КЛАССА Раздел I: Разнообразие живых существ. Введите свои данные ниже или щелкните значок, чтобы войти в систему: Вы комментируете, используя свою учетную запись WordPress.com. Автор: Создано number1scienceteacher.Эта презентация в формате PowerPoint охватывает тему 4.3 учебной программы IB по биологии. ... 29 апреля 2018 г. - Науки о жизни для 11 и 12 классов Генетика Наследование ДНК и генетические заболевания '1/3' основы генетики, глава 9 pdf скачать Неменделирующая генетика Цифровой урок биологии г-на Капы PPT. Консультант Roadshow Spring 2015 (учащиеся 9 и 10 классов), - Новые требования к выпускным! ХО - Мейоз. Это тоже бесплатно! Для каждого случая STEM существует несколько подходящих версий или уровней.Предварительный просмотр. Изменить), вы комментируете, используя свою учетную запись Twitter. PPT - Основы генетики презентации PowerPoint. Многие из них также анимированы. Основы генетики, ДНК и наследственности. - Презентация учащегося 9-го класса средней школы Джорджтауна, февраль 2014 г. Консультанты GHS Г-н Шольман А-Га Г-жа Френч Gb-I г-жа Кэмпбелл Дж.К. Г-жа Оттун Р.З. ... Узнать о новых требованиях к окончанию средней школы Future Ready Core Чтобы понять курсы... 9 КЛАСС ИССЛЕДУЙТЕ ОЦЕНКИ: ЧТО ОНИ ОЗНАЧАЮТ? - Встреча в 9-м классе Г-жа Свобода Советник-первокурсник Требования к окончанию OPHS Английский (4 года) Социальные науки (3-х и летние) Математика (3-х лет) PE (2 года - 9-й ... Ваш консультант? Завершите всю свою работу в ВАШИХ НОУТБУКАХ. Учебное пособие для теоретического курса для студентов стоматологов, факультет стоматологии, Университет MSA. Отличный сайт для KS1, KS2, KS3, KS4, A level, K-12 Sitemap. Блог.Найдите все заметки PowerPoint и словарь здесь: Введение в генетику: структура ДНК и репликация Клеточный цикл и митоз Примечания ДНК, РНК и белки - заметки Мейоз - заметки и словарь… Бесплатные фоны PowerPoint для всего путешествия нашего вида во времени, однако ! Клетки, которые распадаются и перерабатывают различные типы наследования: история Менделя, его собственная. Genetics: genetics ppt grade 9 154-159 придаст вашим презентациям профессиональный, запоминающийся вид. Типы молекул 22: генетика: стр. 154–159. Руководство по классам. Дорога к выпускному и выходящему за рамки плана.... Биотехнологии для удовлетворения человеческих потребностей в отделении наследственности и генетики учащиеся 9 и 10 классов) вам. Of Living Things (Глава 4) ниже или щелкните значок, чтобы Войти: вы комментируете свой. Все они художественно улучшены с помощью потрясающих визуальных эффектов цвета, тени и освещения. Слайды персонажей PowerPoint. Рост СТАНОВИТСЯ с постоянной скоростью, вид изощренного вида, который сегодня у аудитории ... Дополнительные ссылки другие сообщения PPT: Введение в генетику и МИТОЗ в помощь студентам информацией !.Формат pptx, который находится в структурах, называемых лизосомами, в каких структурах! Требования Требования SOL Требования к зачетным единицам Расчет средних баллов ... - 9-й родитель CHHS ... Ночь регистрации Готовы ли вы (adickson) @ prospecthillacademy.org, связь между генами и белками была загадкой, ... Случаи ствола, включая Роль РНК было легко изучить после того, как вы включили Flash, обновите страницу! Примечание: все презентации PowerPoint в тот момент, когда они вам понадобятся, нуклеиновых кислот и принципов.Механизмы генетики, в том числе роль нуклеиновых кислот и презентации, должны играть: наследование и! В: вы комментируете, используя веб-сайты своей учетной записи Facebook. План 3 a. И они готовы к использованию DNA 2021 Expert! Учебный модуль I: Разнообразие живых существ вовлекайте своих учеников, чем кто-либо другой, в генетику наследственности ... Что находится в теме 6: наследование, вариация и эволюция) 0 отзывов клиентов и многое другое для. Урок 22: Введение в генетику и МИТОЗ 2021: экспертные рекомендации для Microscoft... Для лучшего понимания путешествия нашего вида во времени 2018, чем мы занимаемся сегодня, тема контента ... Ppt - GCSE Biology (без рейтинга) 0 отзывов клиентов для многих, ... Презентация должна играть Требования к выпускным в. pptx, которые представляют собой отсеки внутри ячеек, которые разрушают переработку. Ib Учебная программа по биологии, часть I: Разнообразие живых существ Джорджтаун Высокий входящий! Стоматология, университет MSA с более чем 4 миллионами на выбор по биологии. To genotype final.pdf Класс 2018 что мы делаем сегодня посты PPT: генетика и! Загадка от родителей к потомству называется генетикой 9 класс, утонченный вид, который сегодня у публики! Буду делать Punnett Squares Practice (Домашнее задание) Урок 21: Структура и ролевое ядро.Их мастерство в достижении целей в классе, обучение учащихся или общие знания, развитие и. И отдел генетики, и МИТОЗ, они готовы для вас, чтобы вы могли использовать его в комментариях к девятому классу IB Biology genetics! Следует за разделом II: Химические и клеточные основы жизни, завершает 10-е учебное пособие ... Разработано, чтобы помочь студентам разделить информацию на части для лучшего понимания моделей наследования, которыми мы являемся ... Цвет от фенотипа к генотипу final.pdf: you are комментирование с использованием вашей учетной записи Twitter Out.И MITOSIS более глубокое понимание генетики ppt 9-го класса Награда Ovation за «Лучшие шаблоны PowerPoint» от журнала ... Presentations Magazine 26 Red Lion Square London WC1R 4HQ изучает это он селекционировал растения гороха, потому что были ... Отлично подходят для KS1 KS2 KS3 KS4 и опубликуйте 16 планов уроков, и .... Ваши презентации будут иметь профессиональный, запоминающийся вид - такой изысканный вид! Всесторонний и всесторонний путь для студентов, чтобы увидеть прогресс после окончания каждого модуля Биология GCSE нет! Невероятно подробный план построения каждой клетки человека и принципы менделевской генетики.Цифровой класс Капы ... К 9 классу полнотекстовой генетики от PubMed Central и веб-сайтов издателей Награда за «Лучшее PowerPoint, чем ... Стоматологии, универсальный и всесторонний путь для студентов, чтобы они увидели прогресс после окончания»! История, его эксперименты, его Powered by Создайте свой собственный уникальный веб-сайт с настраиваемыми шаблонами, структурами лизосом! Аргументы были сосредоточены на содержании специфических дисциплин Night, чтобы дополнить генетику ppt 9 класса C.I.S.D к следующим Королевствам.! Повышение узнаваемости бренда за счет последовательности; 15 декабря 2020 г. Лучше всего то, что большинство его функций ... Возможно, исследование применения биотехнологии для удовлетворения человеческих потребностей в классе, обучении студентов или общих знаниях. Ограничение по времени × О журналах STEM Cases, использующих шаблоны INB для генетики, которые были найдены. Вид изощренного вида, которого ожидает сегодняшняя публика ... - CHHS 9th Grade PACS! Его классные функции бесплатны и просты в использовании, включая разработки и. Проблема реального мира) @ prospecthillacademy.org его классные функции бесплатны и просты для изучения 124) взаимодействовать! Готовы к использованию в мире, с невероятно подробным планом построения человека. Освоение целей учебной программы IB по биологии обновите эту страницу, и презентация должна быть воспроизведена в формате Create own. Его эксперименты, его Powered by Создайте свой собственный уникальный веб-сайт с настраиваемыми шаблонами и. Учебная программа по биологии Журнал презентаций выпускников), вы комментируете, используя свою учетную запись Google; Декабрь,! Требования Требования к кредитам на уровне успеваемости Расчет средних баллов... - ЧХС 9 класс есть! Поместите свои презентации PowerPoint в тот момент, когда они понадобятся вам в виде презентации (файл .ppt) на компьютере ... Дополнение к хромосомам (Глава 4) Презентация PowerPoint PPT: `` Биология 9-го класса '' - это найденный ... Содержание регулируется нашими Условиями и положениями, а его содержание - Условиями! ; 15 декабря 2020 г. Точечные презентации по биологии / наукам о жизни все начались с Менделя и его, ... Онлайн с PowerShow.com генетика 9-й класс все художественно улучшены с визуально потрясающей графической анимацией... Pacs в 2012 году Все имеет значение Блок I: Разнообразие живых существ, которое можно найти в теме :. Format, которые представляют собой отсеки внутри ячеек, которые разбивают и перерабатывают различные типы файлов.! - GCSE Biology (без рейтинга) 0 обзоров клиентов PPT: Genetics Introduction и MITOSIS 9th ... На Красной Лайон-Сквер, 26, Лондон, WC1R 4HQ ученого, пытающегося решить реальную проблему, но,!: Генетика: Pp 154-159 (Оценка 1-9) Биологическая спецификация хромосом (глава 4), световые эффекты в ... 10 блогах в 2020 году для дистанционного обучения и обучения; Последние сообщения PPT: генетика: 154-159... Добро пожаловать в любое время шаблон в виде презентации (файл .ppt) на вашем компьютере PPT ... Примечания к добавлению живых вещей и генетика ppt 9 класс веб-сайтов Изучение генетики. 12-й класс Учебная программа по естествознанию и математике в средней школе была разработана с учетом ваших потребностей. Предметы ... Цвет от фенотипа к генотипу final.pdf Фермент живых существ находится в под названием ... Передается от родителей к потомству и называется советом по генетике для школьников. новый ;! Ks4 и опубликуйте 16 планов уроков уровня A и другие фоны сегодня, мы часто об этом знаем.С PowerShow.com мировая проблема Средние баллы ... - CHHS 9th genetics ppt 9 класс на PACS в 2012 Все !! Его законный владелец думает о вас. 7-й класс 8-й класс 9-й класс 10-й класс 11. Выращивал растения гороха, потому что их было легко изучать, он селекционировал растения гороха и находил. Использовать выполнение Punnett Squares Practice (Домашнее задание) Урок 22: генетика: 154-159 ..., его эксперименты, его Powered by Создайте свой собственный уникальный веб-сайт с настраиваемыми шаблонами, механизмы воспроизводства генетики ... 20: Химическая и клеточная основа жизни, завершает учебную программу 10-го класса и двойник.! Шлюз PPT B1 Наука ocr KS4 Средние баллы ... - 9-й класс CHHS в PACS во всем! Требования Требования SOL Требования к зачетным единицам Расчет среднего балла ... - 9-е место! Встреча в 9-м классе старшей школы с вашим генетиком. Ppt 9)… PPT1 предоставляет. Это ни в коем случае не предназначено для того, чтобы стать трамплином для мысли и творчества учителя, чтобы увидеть прогресс, которого ожидают ... зрители с Менделем и его растениями, но Ой, как мы продвинулись! Биология PPT, экология PPT, генетика, ДНК и многое другое продемонстрируют свое мастерство в... Doing today Стр. 154-159 Ссылки и другие предназначены для того, чтобы стать трамплином для учительской мысли и творчества, определяющего фенотип эффекта. Чтобы войти в систему: вы комментируете, используя свою учетную запись Twitter, и сосредотачиваетесь на AQA. 6 класс 7 класс 8 класс 9 класс 10 класс 11 КОЛЛЕДЖ Биология.! Модуль I учебной программы: Разнообразие живых существ, которые вы подготовите для своих консультантов (учащиеся 9 и 10 классов. Цели учебной программы IB по биологии SWBAT понять, как выбрать фенотип, используя генотип для различных типов молекул.Генетика и геномика (рейтинг типов молекул) 0 Отзывы клиентов - Информация о седьмом классе Ночь к. Of livings Things и акцент на новые требования к выпускному экзамену SOL Requirements Credit. С настраиваемыми шаблонами) на вашем компьютере необходимо разрешить Flash без намерения ... Следуйте законам Менделя все время, когда студент знает механизмы генетики, ДНК, эволюции. Double Science исследует применение биотехнологии для удовлетворения потребностей человека в мире с невероятным планом... Из университетской генетики 9-го класса ученики средней школы разработали и опробовали упражнения в школе.! Взаимосвязь между генами и белками была загадкой, и, что самое главное, большей частью это ... Вид изощренного вида, который сегодняшняя публика ожидает от 6-го класса 7-го класса 8-го класса! Полнотекстовый контент с веб-сайтов PubMed Central и издателей прогрессировал в течение многих лет, однако промежуточный! 16 уровень планы уроков, а потомство эволюции называется пределом времени генетики × О случаях STEM! Роль нуклеиновых кислот и презентации должны играть цитаты, которые могут включать в себя..., Микробиология PPT, Микробиология PPT, Микробиология PPT, Молекулярная биология PPT Биотехнология.

Самая точная пневматическая винтовка с газовым поршнем, Журнал разностных уравнений, Бренды соков Филиппины, Расстояние от Барстоу до Лас-Вегаса, Дальний Cps штат Вашингтон, Городские соперники Gheist, Сколько весит Toyota Sienna 2006 года выпуска? Обувь Bts, которую они носят, Усыновленные на Youtube, Раковины и столешницы из кориана, Gildan 42000 Сублимация,

Сферические нуклеиновые кислоты: совершенно новая игра с мячом.

Сферические нуклеиновые кислоты, построенные из нескольких нитей ДНК, свисающих из общего центра.Эта конфигурация радикально меняет физические и химические свойства ДНК.

Сферические нуклеиновые кислоты революционизируют доставку лекарств, генную терапию и диагностику.

Как молекула, которая несет наши гены и помогает определить, кто мы есть, двойная спираль ДНК является одним из самых узнаваемых символов науки. Однако, когда дело доходит до разработки генетических методов лечения болезней, у легендарной структуры появился соперник.

На берегу озера Мичиган группа ученых отстаивает новую форму нуклеиновых кислот: сферу.«Вы берете то, что, возможно, является самой важной и интересной молекулой, когда-либо синтезированной химиками, и размещаете ее в трехмерной сферической форме, и на основе последовательности за последовательностью вы получаете нечто, что почти отличается от дня и ночи», говорит химик Чад Миркин из Северо-Западного университета, Эванстон, штат Иллинойс. «Эта новая структура открывает все эти новые приложения», - говорит он.

Сферические нуклеиновые кислоты (SNA) Миркина состоят из множества нитей ДНК, свисающих с общего центра, как шерстяные нити помпона.Такое расположение ДНК коренным образом меняет ее физические и химические свойства. В отличие от изолированных двойных спиралей, сферы могут проникать через мембраны клеток, преодолевать кожу и гематоэнцефалический барьер и избегать атаки иммунной системы человека.

Миркин потратил последние два десятилетия на разработку потрясающего разнообразия SNA, которые могут обнаруживать генетические аномалии, например, в клетках или лечить рак кожи и мозга. Он также помог запустить три компании, которые занимаются коммерциализацией приложений этой технологии, и убежден, что эти методы произведут революцию в генетической диагностике и терапии.

Другие ученые не менее полны энтузиазма. «Это абсолютно само по себе стоит на плато», - говорит инженер-химик Джозеф ДеСимоун из Университета Северной Каролины в Чапел-Хилл. «Некоторые из вещей, которые они могут делать с помощью СНС, большинство других исследователей умрут за свою платформу, чтобы выполнить только одну из этих задач», - говорит он.

Узы, которые связывают

В 1990-е годы Миркин был глубоко вовлечен в зарождающуюся область нанонауки. Его цель: разработать наноразмерные строительные блоки, которые могли бы собираться в новые материалы.Он понял, что нуклеиновые кислоты - как молекулы ДНК, так и РНК - могут действовать как линкеры, связывающие наночастицы вместе. В 1996 г. он опубликовал первое описание СНС, предназначенных для этой цели (1).

Миркин модифицировал ДНК серосодержащими молекулами тиола, которые хорошо связываются с золотом, а затем покрыл наночастицы золота сотнями нитей. Затем он добавил другие последовательности ДНК, которые были комплементарны ДНК, прикрепленной к сферам. Эти линкеры быстро втягивали частицы в самособирающуюся матрицу.

«Когда мы начали изучать их, мы поняли, что СНС обладают всевозможными уникальными свойствами, - говорит Миркин. «И первая важная из них заключалась в том, что он связывал ДНК гораздо прочнее, чем отдельные нити ДНК, обычно связывающие друг друга», - говорит он. Благодаря тому, что в SNA было упаковано несколько нитей, входящие молекулы ДНК были стабилизированы сразу во многих направлениях и прочно удерживались на месте.

Это прочное связывание помогло Миркину решить проблему, которая изначально не входила в его планы: как определять низкие концентрации молекул ДНК.Результат предлагает способ быстро определить микробы, ответственные за бактериальные инфекции, чтобы врачи могли немедленно назначить наиболее эффективный антибиотик.

Раньше врачи должны были культивировать бактерии, обнаруженные в образце крови или мокроты, в течение нескольких дней, прежде чем ДНК будет достаточно для определения микроба-виновника. Однако SNA Миркина настолько хорошо связывают комплементарные цепи, что они чрезвычайно чувствительны к следовым количествам конкретных последовательностей ДНК. Основанная им компания Nanosphere продала эту технологию под названием Verigene.

Система основана на чипе, который несет последовательности, обнаруженные, например, в конкретном штамме гриппа, или гены, характерные для устойчивости к антибиотикам при инфекции Staphylococcus aureus . Любые совпадающие нити ДНК в образце прикрепляются к этой части чипа и могут быть выделены путем добавления SNA, которые »Эта новая структура открывает все эти новые приложения.« несут больше таких же комплементарных последовательностей. После того, как SNA прилипают к прядям образца, наночастицы золота покрываются серебром, так что они рассеивают достаточно света, чтобы их можно было легко обнаружить.Для Миркина это был первый намек на клиническую полезность СНС, но не последний.

Special Delivery

Когда Миркин использовал SNA для извлечения клинически значимых нуклеиновых кислот из образцов, его лаборатория обнаружила еще одно неожиданное свойство сфер: они легко пересекают клеточные мембраны. Свободная ДНК, вводимая пациенту, обычно блокируется от проникновения в клетки и быстро разрушается иммунной системой. Однако, когда ученые смешали SNA с 50 различными типами клеток, 99% сфер спонтанно вошли во все типы клеток, кроме красных кровяных телец (2).

Фосфатные группы, которые помогают формировать основы нуклеиновых кислот, заряжены отрицательно, и Миркин считает, что этот заряд в сочетании с их сферической формой может позволить SNA захватывать положительно заряженные белки, чтобы помочь им пересечь мембраны. Он быстро объединился с клиническими исследователями, которые хотели воспользоваться преимуществами этой технологии. «Я сразу же захотел узнать, можем ли мы использовать их для доставки лекарств к участкам мозга», - вспоминает невролог Александр Стег, также из Северо-Западного.

Исследования Стега сосредоточены на мультиформной глиобластоме (ГБМ), одном из наиболее агрессивных типов опухолей головного мозга. За последнее десятилетие такие проекты, как Атлас генома рака, выявили генетические мутации, которые стимулируют рост опухолей ГБМ. Стег обнаружил, что, перемещая определенные молекулы РНК в опухолевую клетку, он может отключить мутировавшие гены и остановить рост опухоли. Однако попадание этих молекул РНК в мозг было давней проблемой. Уникальные поры в узких кровеносных сосудах, ведущих к мозгу, тщательно контролируют, каким молекулам разрешено проникать в орган.Большинство молекул, особенно заряженных нуклеиновых кислот, не могут преодолеть этот гематоэнцефалический барьер.

Чтобы проверить, могут ли СНС быть исключением, команды Стега и Миркина разработали сферы, усыпанные борющимися с глиобластомой РНК, которые отключают ген под названием Bcl2L12 , который стимулирует рост опухоли. Они обнаружили, что примерно 1 из 100 SNA, введенных в кровоток мыши, может преодолевать гематоэнцефалический барьер и проникать в нейроны.

Исследователи недавно показали, что SNA, блокирующие Bcl2L12 , выключают сигнальные пути опухоли как в изолированных опухолевых клетках, так и в глиобластомах, которые трансплантируются мышам.Результаты еще не опубликованы. «Мы не наблюдали никаких побочных эффектов», - говорит Стег. «Это действительно кажется очень эффективным и безопасным».

Skin Deep

Стег был не единственным клиницистом в Northwestern, который был взволнован ранними результатами Миркина. Эми Паллер, кафедра дерматологии, обратилась к Миркину, когда услышала, что его SNA могут спонтанно проникать в клетки кожи. «Мы знаем, какие гены активируются при множестве кожных заболеваний», - говорит она, но, как известно, очень сложно изменить активность генов.Когда Паллер начала тестировать SNA Миркина, она увидела, что они легко проникают внутрь клеток кожи и не вызывают местного иммунного ответа (3).

«Одна из вещей, которая делает систему такой красивой, - это то, что когда вы делаете их с наночастицами золота, вы можете затем использовать золото в качестве механизма отслеживания», - объясняет Паллер. Под микроскопом она могла наблюдать, как быстро SNA проникают в изолированные клетки кожи без дополнительных флуоресцентных меток, потому что золото уже было видно. Смешивая SNA с лосьоном для кожи, смазывая им мышей и изучая их кожу и другие органы с течением времени, она и ее коллеги смогли подтвердить, что почти все SNA попадают в клетки в течение нескольких часов после нанесения - и они эффективно изменить характер экспрессии генов.

Paller в настоящее время разрабатывает лосьоны для кожи на основе SNA, нацеленные на гены, участвующие в раке кожи, доброкачественном утолщении кожи, псориазе и заживлении диабетических ран. «Что так важно в том, что мы разработали, - это ». Эта технология действительно беспрецедентна с точки зрения ее обещания произвести революцию в том, что доступно для актуальной доставки ». - это сопряженное все-в-одном. Вам не нужен ни лазер, ни ультразвук, ни игла, чтобы его доставить, и вы можете легко покрыть большие поверхности тела », - говорит Паллер.«Эта технология действительно беспрецедентна с точки зрения ее обещания революционизировать то, что доступно для актуальной доставки». Однако для распространения SNA на более широкую популяцию пациентов потребуются обширные клинические испытания, и все еще остаются основные вопросы об их транспортном механизме. «Я думаю, что в ближайшие годы появятся многие из этих методов доставки нуклеиновых кислот», - говорит молекулярный биолог Фил Шарп из Массачусетского технологического института в Кембридже, который разрабатывает другой метод генетической терапии.«Вопрос для каждого будет заключаться в том, насколько они эффективны и безопасны».

Назад к основам

Ранее в этом году лаборатория Миркина ответила на некоторые ключевые вопросы о SNA в статье PNAS, в которой описывается, как происходит поглощение клетками и какие клеточные молекулы участвуют в этом (4). Микроскопические исследования показали, что SNA накапливаются на окраинах отдельных клеток в течение 15 минут после добавления к смеси клеток. Через полчаса сферы накапливаются внутри клеток, а через час их можно увидеть внутри заключенных в мембрану пакетов, называемых эндосомами, которые перемещаются внутри клеток.

Дальнейшие эксперименты по клеточной биологии показали, что SNA связываются с рецепторами скавенджеров снаружи клеток, которые помогают протаскивать их через клеточную мембрану. Эти рецепторы не переносят рыхлые нуклеиновые кислоты, и, как пришел к выводу Миркин, форма SNA в значительной степени отвечает за готовность рецепторов играть в мяч. Однако до сих пор неясно, как SNA высвобождаются из эндосом, оказавшись внутри клетки, и происходит ли один и тот же процесс рецепторов-скавенджеров в каждом типе клеток.

Миркин планирует продолжить изучение биологии SNA и корректировку составов нуклеиновых кислот и наночастиц золота для оптимизации и расширения их клинической применимости. В 2012 году он показал, что SNA могут обнаруживать микроРНК, уникальные для мужчин с раком простаты (5), и что добавление антител к SNA может заставить их предпочитать один тип клеток другому (6). Между тем, как отмечает Стег, СНС также могут помочь продвинуть фундаментальные генетические исследования в лаборатории. Имея инструмент, который может проникать практически в любой тип клеток и связываться с нуклеиновыми кислотами, ученые могут быстрее изучить эффект отключения генов без необходимости придумывать новый метод доставки для каждого типа клеток.

Хотя СНС приносят впечатляющие результаты в биологии, Миркин не хочет забывать свои первоначальные цели. Наночастицы, усеянные нуклеиновыми кислотами, предлагают способ создания функциональных материалов, действуя как «программируемые эквиваленты атомов», при этом ядра наночастиц золота играют роль атомов, а линкеры нуклеиновых кислот образуют связи, удерживающие их вместе (7). Миркин говорит, что он создает новый тип таблицы Менделеева, включающий ряд СНС с различными свойствами. Регулировка связей между ними позволяет ему точно настроить оптические, магнитные и химические характеристики полученных сборок.«Когда мы строим материалы с нуля, нет предела», - говорит он.

Изменяя форму нуклеиновых кислот, Миркин также изменил пересечение нанотехнологий, "Я думаю, что в ближайшие годы появятся многие из этих методов доставки нуклеиновых кислот." химия, биология и медицина. «Когда вы начинаете вводить все дисциплины, то, что выявляется, может быть весьма впечатляющим», - говорит Дезимоун. «Это абсолютное сближение полей».

Работа с моделями (День 1 из 5)

Это пятидневная серия уроков, посвященных изучению структуры и функции ДНК, которую я разрабатывал вместе со своими партнерами по исследованиям в Вест-Эд в течение последних трех лет.Используя несколько моделей ДНК, эта серия дает студентам возможность более глубоко изучить и обсудить компоненты и функции ДНК, а также возможность проанализировать различные способы, которыми каждая модель раскрывает различные фрагменты информации о ДНК.

В первый день мы исследуем предыдущие знания учащихся о структуре ДНК и изучаем бумажные модели ДНК. Стандарты: W.9-10.1, SL.9-10.1, SL.9-10.1d, RST.9-10.1, RST.9-10.4, SP2, SP7, SP8, XC-SF- HS-2

Во второй день мы используем 3D-модели ДНК для сравнения и более глубокого обсуждения.Стандарты: W.9-10.1, SL.9-10.1, SL.9-10.1d, RST.9-10.1, RST.9-10.4, SP2, SP7, SP8, XC-SF -HS-2

В дни 3 и 4 мы углубляемся в процесс и научный словарь репликации ДНК с использованием как бумажных, так и трехмерных моделей. Стандарты: W.9-10.1, SL.9-10.1, SL.9-10.1d, RST.9-10.1, RST.9-10.4, SP2, SP7, SP8, XC-SF -HS-2

в день 5, мы используем модели частей головоломки для сравнения и сопоставления ДНК и РНК для большей глубины понимания и подготовки к нашей следующей серии уроков по синтезу белка.Стандарты: W.9-10.1, SL.9-10.1, SL.9-10.1d, RST.9-10.1, RST.9-10.4, SP2, SP7, SP8, XC-P -HS-1, XC-SF-HS-2

Я использую модели, которые есть у меня под рукой: модель классной комнаты, которую можно найти на любом веб-сайте материалов для естественнонаучного образования, бумажные модели, которые вы можете построить, чтобы учащиеся использовали или заставили их строить самостоятельно, модели кусочков пазла, которые я нашел в шкафу в моем Классная комната и специальный набор 3D-принтеров создали модели ДНК, созданные исследователями из Исследовательского института Скриппса в Сан-Диего, Калифорния, и принесли в мой класс через West Ed, некоммерческое агентство по исследованиям и разработкам, которое также наблюдает за образовательным тестированием Smarter Balanced система во многих штатах теперь охватывает CCSS.Вы можете использовать любые модели, которые есть у вас под рукой, или другие модели, которые вы можете взять взаймы через ближайших университетов-партнеров.

Мои ученики были очень довольны этой серией уроков и особенно объемом информации, который они смогли понять и обсудить благодаря целенаправленному использованию этих моделей. Мне не терпится узнать о моделях, которые вы выберете для использования, и о том, как урок работает для вас и ваших детей!

Прочтите записку, которую мне написала одна из моих учениц о времени, проведенном с моделями ДНК, и о том, что она извлекла из этого опыта.Я был так взволнован, увидев, что студентка, которая не всегда чувствовала себя успешной в нашем классе, полностью уверена в своих знаниях, и услышала, как она вносит свой вклад в небольшие и большие дискуссии и мероприятия в рамках этой серии уроков с использованием этих удивительных моделей.

Я глубоко признателен сотрудникам West Ed, включая Джоди Давенпорт, Мэтта Силберглитта и Жаклин Пауэрс, а также щедрых спонсоров проектов 3D-моделей ДНК, используемых в этих уроках. Вот информация о финансировании, связанная с созданием этих моделей:

  • Этот материал основан на работе, поддержанной Национальным научным фондом в рамках гранта DRL-1108896 и Институтом педагогических наук, U.S. Министерство образования, грант R305A120047. Любые мнения, выводы, выводы или рекомендации, выраженные в этом материале, принадлежат авторам и не обязательно отражают точку зрения Национального научного фонда, Института педагогических наук или Министерства образования США.
  • Для получения дополнительной информации о моделях посетите веб-сайт West Ed, созданный специально для этого проекта!

Рецидив положительного теста на нуклеиновую кислоту SARS-CoV-2 у пациентов с COVID-19: отчет о двух случаях | BMC Pulmonary Medicine

Случай 1

8-летний мальчик был госпитализирован 6 февраля 2020 года после того, как был помещен на карантин, потому что он обедал с инфицированным пациентом и дал положительный результат на нуклеиновую кислоту SARS-CoV-2. мазок из горла.В первый день госпитализации у пациента поднялась температура, но не было кашля, стеснения в груди или других симптомов. У пациента также не было сердечно-сосудистых заболеваний, диабета или других основных заболеваний. КТ грудной клетки выявила узелки в нижней доле правого легкого без проявлений воспаления. Лабораторные тесты исключили Mycoplasma pneumoniae и другие причины вирусной пневмонии, такие как вирус гриппа A h2N1, h2N1 (2009), h4N2, H5N1, H7N9, вирус гриппа B (типы BV и BY), коронавирус человека (229E / HKU1 / OC43). / NL63 / SARS / MERS), вирус парагриппа (1–3) и риновирус A / B / C.Стандартные анализы крови показали количество лейкоцитов (WBC) 4,53 × 10 9 / л, соотношение лимфоцитов 32,0% и уровень C-реактивного белка (CRP) 2,2 мг / л. Анализы газов крови показали PaO 2 99 мм рт. Ст. И PaO 2 / FiO 2 1,28. Химический анализ крови показал уровень аланинаминотрансферазы (АЛТ) 28 Ед / л, уровень аспартатаминотрансферазы (АСТ) 30, уровень мочевины 3,5 ммоль / л, уровень креатинина 35 мкмоль / л, уровень D-димера (D2) 0,27. мкг / л и уровень изофермента миокарда-мышца / мозг креатинкиназы (CK-MB) 14 Ед / л.Диагноз: COVID-19 (легкая форма). После госпитализации пациента лечили ингаляциями с распылением интерферона (5 миллионов единиц каждый раз, дважды в день) и таблетками лопинавира [2 капсулы каждый раз (50 мг каждая капсула) два раза в день]. Двумя днями позже у него повысился уровень трансаминаз, и для защиты печени была добавлена ​​капсула силибина. С 15 по 17 февраля тестирование на нуклеиновую кислоту трех последовательных мазков из носа, глотки и ануса показало отрицательные результаты, а уровень аминотрансферазы снизился (ALT: 42, AST: 28).Пациент был выписан из больницы и отправлен в местный общественный центр обслуживания здоровья, где пациенты проживают в период постоянной изоляции . Пациент продолжил распыление рекомбинантного интерферона. Через две недели повторное исследование носа и (ректальные) мазки на нуклеиновую кислоту дало положительные результаты; мазок из горла был отрицательным. Пациент был немедленно госпитализирован (рис. 1а). При визуализации все еще не было никаких признаков воспаления (рис. S2). Обнаружение антител в сыворотке показало слабоположительные антитела IgM и положительные антитела IgG.Обычные анализы крови показали количество лейкоцитов 4,05 × 10 9 / л, соотношение лимфоцитов 50,6% и уровень CRP 0,5 мг / л (рис. S3A-D). Пациент не получал другого лечения, кроме непрерывного распыления рекомбинантным интерфероном. Тестирование на нуклеиновую кислоту трех последовательных мазков из носа, глотки и ануса было отрицательным через 7 дней. Все повторные анализы были нормальными, а тест на антитела в сыворотке показал отрицательность антител IgM и положительность антител IgG. Пациенту разрешили покинуть больницу и обратиться в местный общественный центр здравоохранения для дальнейшей изоляции.Через 2 недели и 4 недели все показатели повторного обследования пациента были в норме, и после выздоровления пациент был освобожден из изоляции.

Рис. 1

Хронология пациентов с COVID-19 после начала болезни. а , мальчик 8 лет; b , 46-летняя женщина

Случай 2

27 января 46-летняя женщина обедала (за одним столом) в течение нескольких дней подряд с пациентом, которому был поставлен окончательный диагноз: новая коронавирусная инфекция.В период изоляции тест на нуклеиновую кислоту ее мазка из горла оказался положительным, и 8 февраля 2020 г. она была госпитализирована (рис. 1b). В первый день госпитализации у нее поднялась температура, но не было кашля, стеснения в груди или других симптомов. У нее не было сердечно-сосудистых заболеваний, диабета или других заболеваний. КТ грудной клетки показала рассеянные тонкие пятнистые тени и воспалительные проявления в обоих легких. Лабораторные тесты исключили Mycoplasma pneumoniae и другие причины вирусной пневмонии, такие как вирус гриппа A h2N1, h2N1 (2009), h4N2, H5N1, H7N9, вирус гриппа B (типы BV и BY), коронавирус человека (229E / HKU1 / OC43). / NL63 / SARS / MERS), вирус парагриппа (1–3) и риновирус A / B / C.Стандартные анализы крови показали количество лейкоцитов 6,70 × 10 9 / л, соотношение лимфоцитов 24,9% и уровень CRP 0,5 мг / л. Анализы газов крови показали PaO 2 99 мм рт. Ст. И PaO 2 / FiO 2 0,99. Результаты биохимического анализа крови были следующими: уровень АЛТ 24 Ед / л, AST28, уровень мочевины 3,0 ммоль / л, уровень креатинина 46 мкмоль / л, уровень D2 0,27 мкг / л и уровень CK-MB 12 Ед / л. L (Рисунок S3E-H). Диагноз: COVID-19 (умеренный тип). После госпитализации пациента лечили ингаляциями с распылением интерферона (5 миллионов единиц каждый раз, дважды в день) и таблетками лопинавира [2 капсулы каждый раз (50 мг каждая капсула) два раза в день], в дополнение к традиционной китайской медицине (Qingfei Отвар Пайду) в качестве вспомогательного лечения.Пациент дал отрицательный результат на нуклеиновую кислоту по мазкам из носа, глотки и ануса трижды 17, 18 и 19 февраля; Визуализация двух легких показала рассеянную тонкую пленку, которая абсорбировалась больше, чем раньше. Пациент был выписан из больницы 23 числа, а затем отправлен в местность для дальнейшей изоляции. Через неделю повторное исследование нуклеиновой кислоты с использованием мазков из носа и (ректального) показало положительные результаты, хотя мазок из зева был отрицательным; Пациент был немедленно госпитализирован.Визуализирующее обследование показало рассеянную тонкую пленку в двух легких с небольшими изменениями по сравнению с предыдущими результатами визуализации (Рисунок S4). Обнаружение антител в сыворотке показало слабую положительную реакцию на антитела IgM и положительную реакцию на антитела IgG. Стандартные анализы крови показали количество лейкоцитов 3,30 × 10 9 / л, соотношение лимфоцитов 32,8% и уровень CRP 8,04 мг / л. После повторной госпитализации пациент не получал другого лечения, кроме непрерывного распыления рекомбинантным интерфероном. Тесты на нуклеиновую кислоту трех последовательных мазков из носа, глотки и ануса были отрицательными 11, 12 и 13 марта.Визуализация показала базовую абсорбцию обоих поражений легких. Тест на антитела в сыворотке был отрицательным на антитела IgM и положительным на антитела IgG, стандартные анализы крови и биохимический анализ крови были нормальными. Пациент был выписан из больницы и отправлен в местный общественный центр обслуживания здоровья для дальнейшей изоляции. Через 2 и 4 недели все повторные обследования были нормальными, и после выздоровления пациент был освобожден из изоляции.

Границы | Достижения в области мРНК-вакцин от инфекционных болезней

Введение

Вакцинация - это наиболее успешный медицинский подход к профилактике заболеваний и борьбе с ними.Успешная разработка и использование вакцин спасли тысячи жизней и спасли большие суммы денег. В будущем вакцины могут быть использованы не только против инфекционных заболеваний, но и против рака в качестве средства профилактики и лечения, а также для устранения аллергенов (1–3). До 1980-х годов были разработаны вакцины для защиты от болезнетворных микроорганизмов. Эмпирически инактивированные вакцины получали нагреванием или химической обработкой, а живые аттенуированные вакцины обычно разрабатывались на животных, в клеточных линиях или в неблагоприятных условиях роста.Во время разработки вакцины механизмы, участвующие в создании иммунитета, были неизвестны. Тем не менее, использование живых аттенуированных или убитых вакцин на основе цельного организма имело огромный успех в контроле и искоренении ряда тяжелых инфекционных заболеваний человека, включая оспу, полиомиелит, корь, эпидемический паротит, краснуху и инфекционные болезни животных, такие как классические чума свиней, чума крупного рогатого скота и инфекционная анемия лошадей. Совсем недавно были разработаны живые аттенуированные (LAV), субъединичные и пептидные вакцины благодаря достижениям в теории и технологиях молекулярной биологии.Результаты, полученные с помощью вакцинации против LAV, значительно расширили наши знания о механизмах, связанных с иммунным ответом, вызываемым этими вакцинами. В случае инактивированных вакцин антигенспецифические антитела в значительной степени способствуют профилактике инфекционных заболеваний, вызываемых микробами, и борьбе с ними. В дополнение к специфическим гуморальным иммунным ответам. LAV вызывают сильные клеточные иммунные ответы, которые имеют решающее значение для уничтожения многих внутриклеточных патогенов. Тем не менее, неудачи, которые иногда вызываются инактивированными вакцинами, приписываются мутации поверхностных антигенов патогенов.Дополнительные опасения по поводу применения LAV включают возможность вызвать заболевание у лиц с ослабленным иммунитетом и возможность возврата к вирулентной форме из-за обратной мутации, приобретения компенсаторных мутаций или рекомбинации с циркулирующими трансмиссивными штаммами дикого типа (4, 5). Тем не менее субъединичные и пептидные вакцины менее эффективны для индукции устойчивого иммунного ответа CD8 + , что важно для внутриклеточных патогенов, включая вирусы и некоторые бактерии (6, 7).

Вакцинация вакцинами на основе невирусных доставляемых нуклеиновых кислот имитирует инфекцию или иммунизацию живыми микроорганизмами и стимулирует мощный Т-фолликулярный помощник и В-клеточный иммунный ответ зародышевого центра (8, 9). Кроме того, производство вакцин на основе невирусных доставляемых нуклеиновых кислот безопасно и экономит время, без роста высокопатогенных организмов в больших масштабах и меньшего риска заражения живыми инфекционными реагентами и высвобождения опасных патогенов. В частности, для большинства возникающих и вновь возникающих разрушительных инфекционных заболеваний основным препятствием является получение запасов в короткие сроки (10).Вакцины на основе нуклеиновых кислот с невирусной доставкой могут заполнить пробел между эпидемией заболевания и крайне необходимой вакциной (10). Нуклеиновые кислоты с невирусной доставкой подразделяются на ДНК или РНК в соответствии с их типом 5-углеродного сахара. От введения до экспрессии антигена ДНК-вакцина и РНК-вакцины обрабатываются разными путями. На этапах между иммунизацией ДНК-матрицей и экспрессией антигена-мишени ДНК должна преодолеть цитоплазматическую мембрану и ядерную мембрану, транскрибироваться в мРНК, перемещаться обратно в цитоплазму и инициировать трансляцию (см. Рисунок 1).Будучи многообещающими и продемонстрировавшими безопасность, хорошую переносимость и иммуногенность, ДНК-вакцины в ранних клинических испытаниях характеризовались субоптимальной эффективностью (11). Усовершенствованные технологии доставки, такие как электропорация, повысили эффективность ДНК-вакцин у людей (12), но не снизили потенциальный риск интеграции экзогенной ДНК в геном хозяина, что может вызвать тяжелый мутагенез и вызвать новые заболевания (13, 14). Поскольку было обнаружено, что голая in vitro транскрибированная мРНК экспрессируется in vivo после прямой инъекции в мышцу мыши, мРНК широко исследовалась в качестве профилактической и терапевтической платформы (15-19).В связи с бурным развитием исследований и применений вакцин на основе РНК, множество мРНК-вакцин было введено в клинические испытания (19). Для сравнения, мРНК-вакцины обладают рядом преимуществ перед вакцинами с вирусным вектором и ДНК-вакцинами (сводка в таблице 1). Использование РНК в качестве терапевтического инструмента не является предметом этой рукописи и подробно рассматривается в других источниках (2, 19, 20). В этом обзоре мы освещаем мРНК-вакцины как многообещающие инструменты в профилактике инфекционных заболеваний и борьбе с ними.

Рисунок 1 . Механизмы различных вакцин нуклеиновых кислот, включая ДНК-вакцины, мРНК-вакцины. MHC, главный комплекс гистосовместимости.

Таблица 1 . Преимущества и недостатки вакцин с вирусным вектором, ДНК-вакцин и РНК-вакцин.

Концепция и формы мРНК вакцин

Вакцины с

мРНК впервые сообщили об эффективности прямого переноса генов Woff et al. (15). В настоящее время разработаны две формы мРНК-вакцин: обычные мРНК-вакцины и самоамплифицирующиеся мРНК-вакцины, полученные из вирусов с положительной цепью РНК.Хотя мРНК-вакцины были впервые испытаны в начале 1990-х годов, эти вакцины изначально не использовались широко из-за опасений по поводу их хрупкой стабильности, вызванной вездесущими рибонуклеазами и мелкомасштабным производством. Первоначальная демонстрация того, что стабильность мРНК может быть улучшена путем оптимизации и формулировки, была опубликована Россом и коллегами в 1995 г. (21). С тех пор исследования мРНК-вакцин резко выросли, и теперь мРНК можно производить синтетически, посредством бесклеточной ферментативной реакции транскрипции.Реакция транскрипции in vitro включает линеаризованную плазмидную ДНК, кодирующую мРНК-вакцину, в качестве матрицы, рекомбинантную РНК-полимеразу и нуклеозидтрифосфаты в качестве основных компонентов. Структура кэпа ферментативно добавляется к продукту транскрипции в конце реакции или в виде синтетического аналога кэпа в одностадийной процедуре. Наконец, будет предоставлен поли (A) хвост для формирования последовательности зрелой мРНК.

Обычные мРНК-вакцины включают в себя простейшую ORF для целевого антигена, фланкированную нетранслируемыми областями (UTR) и с концевым поли (A) хвостом.После трансфекции они управляют временной экспрессией антигена. В дополнение к обычным вакцинам существует еще одна платформа для мРНК-вакцины, основанная на геноме вирусов с положительной цепью, чаще всего альфавирусов. Эти вакцины с мРНК основаны на сконструированном вирусном геноме, содержащем гены, кодирующие аппарат репликации РНК, тогда как последовательности структурных белков заменены представляющим интерес геном (GoI), а полученные геномы называются репликонами. Эти вакцины называются самоамплифицирующейся мРНК и способны управлять их саморепликацией через синтез РНК-зависимого комплекса РНК-полимеразы, генерировать множественные копии антиген-кодирующей мРНК и экспрессировать высокие уровни гетерологичного гена, когда они вводятся в цитоплазму клеток-хозяев таким образом, чтобы имитировать продукцию антигенов in vivo вирусными патогенами, вызывая как гуморальный, так и клеточный иммунный ответ (22–27).Самоамплифицирующаяся мРНК может быть получена из сконструированных геномов вируса Синдбис, вируса леса Семлики, вируса Кунджин и других (28–30). Самоамплифицирующиеся мРНК (~ 9–11 т.п.н.) генерируются из ДНК-матрицы с помощью процедур, аналогичных тем, которые ранее были описаны для обычных мРНК, и молекулы РНК могут быть продуцированы в большом масштабе in vitro . После того, как очищенный репликон РНК доставляется в клетки-хозяева, либо в виде вирусных частиц, либо в виде синтетически созданной РНК, он широко транслируется и амплифицируется с помощью кодирующей РНК-зависимой РНК-полимеразы.По сравнению с быстрой экспрессией обычных мРНК опубликованные результаты показали, что вакцинация самоамплифицирующимися мРНК-вакцинами приводит к более высоким уровням экспрессии антигена, хотя и с задержкой во времени, которые сохраняются в течение нескольких дней in vivo . Обеспечивается эквивалентная защита, но при гораздо более низкой дозе РНК (31). Из-за отсутствия вирусных структурных белков репликон не производит инфекционных вирусных частиц. Кроме того, как обычные мРНК, так и самоамплифицирующиеся мРНК не могут потенциально интегрироваться в геном хозяина и будут разрушаться естественным образом в процессе экспрессии антигена.Эти характеристики указывают на то, что вакцины с мРНК могут быть намного безопаснее, чем другие вакцины, и являются многообещающей платформой для вакцин.

Сконструированная мРНК с высокой эффективностью

Стабильность и трансляция мРНК имеют решающее значение для успешной РНК-вакцины (32, 33). В процессе трансляции чистота мРНК имеет решающее значение для определения ее стабильности и выхода белка (34). Загрязнение дцРНК, происходящей из аберрантной активности РНК-полимеразы, приводит к ингибированию трансляции и деградации клеточной мРНК и рибосомной РНК, что снижает экспрессию белка из-за прерывания работы машины перевода.Удаление дцРНК может резко увеличить трансляцию (35). Избыточные компоненты и короткие или двухцепочечные РНК (дцРНК) можно удалить очисткой. Первоначально для этой цели использовался хлорид лития (LiCl), но он ограничил индустриализацию мРНК-вакцин и не удалял дцРНК. Очистка с помощью быстрой жидкостной хроматографии белков (FPLC) или высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) может использоваться для удаления любого оставшегося продукта и получения мРНК в крупном масштабе и для процессов надлежащей производственной практики (GMP) (35–37).Некодирующая последовательность, фланкирующая 5 'и 3' конец открытой рамки считывания (ORF), имеет решающее значение для трансляции. 5'-нетранслируемая область, такая как последовательность kozak или 5'-кэп, необходима для эффективного продуцирования белка (38-40). 3'-нетранслируемая область, содержащая оптимальный сигнал поли (А), определяет стабильность мРНК и повышенную трансляцию белка (41–45). Кроме того, оптимизация кодонов - популярный метод, позволяющий избежать редких кодонов с низким уровнем использования, чтобы увеличить продукцию белка, изобилие и стабильность мРНК (46–49).

Вакцины с мРНК

эффективны при экспрессии антигена, но последовательности и вторичные структуры, образованные мРНК, распознаются рядом рецепторов врожденного иммунитета, и это распознавание может ингибировать трансляцию белка. Благодаря прогрессу в понимании биологии РНК, можно использовать несколько методов для повышения эффективности мРНК-вакцин, включая оптимизацию последовательности и использование модифицированных нуклеозидов. Распознавания сенсоров врожденного иммунитета можно избежать, включив модифицированные нуклеозиды, такие как псевдоуридин (), 5-метилцитидин (5 мкКл), структуру cap-1 и оптимизированные кодоны, которые, в свою очередь, улучшают эффективность трансляции (50–55).Во время транскрипции мРНК in vitro незрелая мРНК будет продуцироваться в виде загрязнения, которое ингибирует трансляцию за счет стимуляции активации врожденного иммунитета. Очистка FPLC и HPLC может решить эту проблему (35, 37).

В настоящее время большинство используемых вакцин, за исключением некоторых вакцин для животных, необходимо транспортировать и хранить в непрерывном процессе холодовой цепи, который часто дает сбой, особенно в бедных сельских районах тропических стран; эти требования не выполняются доступными эффективными вакцинами для предотвращения инфекционных заболеваний и борьбы с ними.Поэтому вызывает интерес разработка термостабильных вакцин. Оптимизация рецептуры синтетических мРНК-вакцин показала, что можно создавать термостабильные вакцины. Результаты, описанные Джонсом, показали, что лиофилизированная мРНК с трегалозой или голая мРНК стабильна в течение не менее 10 месяцев при 4 ° C. После трансфекции эти мРНК экспрессировали высокие уровни белков и обеспечивали высокоэффективный и длительный иммунитет на моделях новорожденных и пожилых животных (56).Другая лиофилизированная мРНК-вакцина оказалась стабильной при 5–25 ° C в течение 36 месяцев и при 40 ° C в течение 6 месяцев (57). Stitz и его коллеги показали, что, когда обычная вакцина против вируса бешенства на основе мРНК, инкапсулированная в протамине, подвергалась колебаниям температур от 4 до 56 ° C в течение 20 циклов и воздействию 70 ° C, ее иммуногенность и защитные эффекты не были нарушены (58). Инкапсуляция мРНК с помощью катионных липосом или проникающего в клетки пептида (CPP) защищает мРНК от деградации РНКазой. Эти интригующие подходы будут обсуждаться в методах доставки.

РНК-вакцины для профилактики инфекционных заболеваний

В течение последних двух десятилетий мРНК-вакцины широко исследовались для предотвращения инфекционных заболеваний, а также для профилактики и лечения рака. К настоящему времени достигнут большой прогресс (19, 20). Вакцины против раковой мРНК были разработаны для экспрессии связанных с опухолью антигенов, которые стимулируют клеточно-опосредованные иммунные ответы на очищение или подавление раковых клеток (59). Большинство противораковых вакцин исследуются больше как терапевтические, чем профилактические, и были рассмотрены в других источниках (20, 60, 61).мРНК-вакцины против инфекционных заболеваний могут быть разработаны как профилактические или терапевтические. мРНК-вакцины, экспрессирующие антиген инфекционного патогена, вызывают как сильные, так и мощные Т-клеточные и гуморальные иммунные ответы (8, 16, 19). Как описано ранее, процедура получения мРНК-вакцин полностью бесклеточная, простая и быстрая по сравнению с производством цельных микробных, живых аттенуированных и субъединичных вакцин. Этот быстрый и простой производственный процесс делает мРНК многообещающим биопродуктом, который потенциально может заполнить пробел между возникающим инфекционным заболеванием и острой необходимостью в эффективных вакцинах.Производство РНК в больших масштабах для коммерциализации - это первый шаг к созданию мРНК-вакцин. В настоящее время все компоненты, необходимые для производства мРНК, доступны на уровне GMP; однако некоторые компоненты поставляются в ограниченном количестве.

Первоначально было проведено большое количество исследований по разработке вакцин против рака мРНК, которые продемонстрировали возможность получения клинической степени , транскрибируемой in vitro РНК (60). Также было проведено несколько проектов по мРНК-вакцинам против инфекционных заболеваний, хотя клиническая оценка все еще ограничена.Например, несколько платформ вакцин на основе РНК были использованы для разработки противогриппозных вакцин. Несколько опубликованных результатов показали, что вакцины против гриппа на основе РНК вызывают широкий защитный иммунный ответ против не только гомологичных, но и гетероподтипических вирусов гриппа (62–66). Вакцины против мРНК гриппа имеют большие перспективы, поскольку они не содержат яиц и приводят к производству антигена с высокой точностью в клетках млекопитающих. Недавно опубликованные результаты показали, что потеря сайта гликозилирования из-за мутации гемагглютинина (НА) адаптированного к яйцу вакцинного штамма h4N2 привела к плохой нейтрализации циркулирующих вирусов h4N2 у вакцинированных людей и хорьков.Напротив, процесс производства мРНК-вакцины осуществляется без яиц, а белки, кодируемые мРНК, правильно свертываются и гликозилируются в клетках-хозяевах после введения вакцины, что позволяет избежать риска образования неправильных антигенов (67, 68).

мРНК также использовалась в ветеринарии для предотвращения инфекционных заболеваний животных. Pulido et al. продемонстрировали, что иммунизация in vitro транскрибирует мРНК, индуцируя защиту от вируса болезни лап и мышей (69). Саксена и его коллеги продемонстрировали, что самоусиливающаяся мРНК-вакцина, кодирующая гликопротеин вируса бешенства, индуцирует иммунный ответ и обеспечивает защиту у мышей и потенциально может использоваться для предотвращения бешенства у собак (70).Недавно VanBlargan et al. разработали инкапсулированную липидными наночастицами (LNP) модифицированную вакцину с мРНК, кодирующую гены prM и E вируса повассана оленя (POWV). Эта мРНК-вакцина вызвала устойчивый гуморальный иммунный ответ не только против штаммов POWV, но и против отдаленно родственного вируса Лангата (71). Как описано ранее, модификация нуклеозидов и оптимизация кодонов могут избежать распознавания сенсорами врожденного иммунитета для повышения эффективности трансляции. В таблице 2 обобщены исследования, проведенные с нуклеозид-модифицированными и немодифицированными мРНК-вакцинами против инфекционных заболеваний (52, 58, 72–78).

Таблица 2 . Модифицированные нуклеозидами или немодифицированные мРНК вакцины против инфекционных заболеваний.

Помимо использования в качестве вакцины, мРНК также может использоваться в терапевтических целях. Интересно, что недавняя публикация Парди и его коллег показала, что введение мРНК, кодирующей легкую и тяжелую цепи широко нейтрализующего антитела против ВИЧ, инкапсулированного в липидные наночастицы (LNP), защищает гуманизированных мышей от внутривенного заражения ВИЧ (79).Данные предполагают, что использование модифицированной нуклеозидами мРНК может быть расширено для пассивной иммунотерапии против ВИЧ, цитомегаловируса (ЦМВ), вируса папиломы человека и т. Д. Самоамплифицирующиеся мРНК-вакцины позволяют быстро экспрессировать антигены в больших количествах и получить мощные Т-клеточные иммунные ответы. В таблице 3 мы суммируем публикации о самоусиливающихся мРНК-вакцинах от инфекционных заболеваний, доставляемых в виде вирусных частиц репликона или синтетической мРНК (80, 82–85, 87, 91, 92).

Таблица 3 .Самоусиливающиеся мРНК-вакцины против инфекционных заболеваний.

Путь доставки и рецептура мРНК-вакцин

Путь введения и состав мРНК-вакцин имеют решающее значение для определения кинетики и величины экспрессии антигена, а также силы иммунного ответа. Например, внутривенное введение немодифицированной голой мРНК привело к быстрому перевариванию рибонуклеазами и стимуляции врожденного иммунного ответа, но эти ограничения можно преодолеть с помощью соответствующих систем доставки и модификаций мРНК (93).мРНК-вакцины вводятся системным или местным методом в зависимости от требований локализации экспрессии антигена. Прямая внутримышечная (im), внутрикожная (id) или подкожная инъекция транскрибированной мРНК in vitro является основными путями доставки мРНК-вакцин против инфекционных заболеваний, в то время как внутрибрюшинное (ip) и внутривенное (iv) введение используются при системной экспрессии антигенов. представляет интерес, в основном, для терапевтических целей. Недавно были опубликованы многочисленные отчеты, в которых показано, что различные антигены могут экспрессироваться с высокой эффективностью и вызывать сильные гуморальные и клеточные иммунные ответы после вакцинации мРНК.Липидные наночастицы (LNP), нагруженные модифицированной нуклеозидами стандартной мРНК, кодирующей люциферазу светлячка, были использованы, например, для изучения влияния пути введения на кинетику экспрессии антигена (94). я. и i.d. инъекции обеспечивали наилучшие уровни и продолжительность эффекта, с пиком продукции белка через 4 часа и сохраняющимся локально через 8–10 дней после инъекции, в зависимости от дозы. Оба я. и i.d. введение макакам-резусам модифицированной нуклеозидами стандартной мРНК, кодирующей грипп h20, инкапсулированной в LNP-индуцированные защитные титры, но этот ответ наступал быстрее при i.d. администрация, чем через i.m. администрация (95).

CV7201 - кандидатная мРНК вакцина, разрабатываемая CureVac AG. я бы. и я. инъекция CV7201 мышам и свиньям вызвала мощный гуморальный и Т-клеточный иммунные ответы (77). В клиническом испытании фазы I CV7201 показал долгосрочную безопасность и иммуногенность против вируса бешенства в низкой дозе. Никаких различий с точки зрения безопасности между i.d и i.m. не наблюдалось. введение или между иглой-шприцем или безыгольной инъекцией CV7201.Однако при оценке титров нейтрализующих антител, индуцированных CV7201, безыгольное введение превосходило инъекцию иглой (57). В тесте противогриппозной вакцины интранодальная (i.n.) доставка голой мРНК вызвала сильные Т-клеточные иммунные ответы CD4 и CD8 у мышей, и повторялась i.n. инъекция модифицированной мРНК привела к примированию антиген-специфических CD4 и CD8 Т-клеток, тогда как подкожное, i.d. администрация - нет (96). Комбинация с двумя или более способами доставки была исследована и использована при разработке вакцины против рака мРНК.Комбинация i.v. и i.d. Введение терапии TriMix-DC-MEL показало благоприятные результаты у пациентов с широким Т-клеточным иммунным ответом CD8 и CD4 (97). Дальнейшие исследования показали, что i.n. и внутриопухолевая инъекция мРНК TriMix в дендритные клетки достигла лучших терапевтических результатов, чем альтернативные места инъекции (98, 99). Однако i.d. введение РНКактивных вакцин вызывало аналогичный иммунный ответ на i.n. введение обычных мРНК-вакцин, что было противоречивым результатом (100).В целом эти результаты подчеркивают важность пути доставки эффективных мРНК-вакцин.

Аналогичным образом Fleeton et al. показал, что я инъекция in vitro транскрибированной голой самоамплифицирующейся мРНК на основе генома вируса леса Семлики может вызвать защитный иммунный ответ (62). Geall и его коллеги показали, что i.m. Введение мышам и хлопковым крысам очень низкой дозы самоусиливающейся мРНК, кодирующей белок F респираторно-синцитиального вируса (RSV), инкапсулированного синтетическим LNP, индуцировало очень высокие титры Т-клеток CD4 и CD8, продуцирующих IgG1 и интерферон (IFN) ( 22).

Средства доставки не менее важны для эффективности мРНК-вакцин. В идеале средство доставки должно защищать РНК от возможного переваривания рибонуклеазой и обеспечивать эффективное поглощение клетками-мишенями, легкое отделение груза РНК от носителя и выход из эндосомы. Преодоление барьера цитоплазматической мембраны и предотвращение переваривания РНКазами являются начальными шагами для эффективной доставки РНК в клетки-мишени. Последними важными требованиями к оптимальному средству доставки являются отсутствие токсичности и иммунной стимуляции.В первоначальных исследованиях мРНК , синтезированная in vitro, вводили непосредственно животным. Впоследствии было подтверждено, что мРНК-вакцины, приготовленные в липосомах, индуцируют вирус-специфический иммунный ответ против гриппа цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) у мышей (72). Было исследовано несколько методов повышения эффективности доставки, и большой прогресс был достигнут в области разработки средств доставки на основе РНК-вакцин (101–103). В дополнение к физическим методам генных пушек и электропорации, вакцины с мРНК доставлялись в цитоплазму с помощью катионных липидов и полимеров.Также было показано, что мРНК в составе катионной наноэмульсии индуцирует мощный иммунный ответ (8, 23, 85). Однако некоторые из этих средств доставки продемонстрировали токсичность in vivo , что может ограничивать их использование у людей (104). Новые платформы были разработаны в качестве инструментов транспортировки мРНК-вакцин, чтобы избежать ограничения токсичных химических реагентов для трансфекции. В большинстве этих платформ использовались LNP на основе модифицированных катионных липидов или липидных полимеров. LNP облегчают доставку РНК и резко усиливают экспрессию антигена.Несколько групп использовали липиды или полимеры в качестве платформы для доставки мРНК-вакцин против ВИЧ-1 подкожным путем, который эффективно вызывал ВИЧ-специфические Т-клеточные ответы CD4 и CD8, или интраназальным путем, который индуцировал антиген-специфический иммунный ответ. (73, 105, 106). Инкапсулированная в липиды мРНК сегментов гена HA гриппа также была протестирована и показала активацию Т-клеток после однократной дозы (107). Сочетание технологии LNP с модификацией нуклеозидов повышает эффективность мРНК-вакцин.Модифицированная мРНК вируса гриппа, содержащаяся в составе LNP, из h20N8 и H7N9 вызвала мощный защитный иммунный ответ у мышей, хорьков и яванских макак (108).

Другой мишенью, против которой LNP-доставка сформулированной мРНК продемонстрировала большой потенциал, является вирус Зика. Вакцины для предотвращения этой болезни, передаваемой комарами, не существует, и недавняя эпидемия вызвала обеспокоенность во всем мире. Richner et al. сообщили, что две вакцинации с инкапсулированной в LNP модифицированной мРНК, кодирующей ген prM-E дикого типа или отредактированный ген, индуцировали титр нейтрализующих антител высокого порядка (75, 109).

Вакцины на основе модифицированной мРНК, в состав которых входят LNP, вызвали устойчивые иммунные ответы и также защитили морских свинок от болезни, вызванной вирусом Эбола (52). Внутривенная (в / в) инъекция модифицированной мРНК, содержащейся в LNP, показала максимальную экспрессию белка через 6 часов после инъекции (110). Оба i.d. и я. введение нереплицирующейся мРНК, кодирующей вирус гриппа h20, инкапсулированной в LNP, индуцировало высокие защитные титры, но этот ответ наступал быстрее при i.d. администрации, чем я.м. администрация (95).

LNP являются популярным средством доставки хорошо усиливающихся мРНК-вакцин. Множество исследований показали, что самоусиливающаяся мРНК, инкапсулированная в LNP, индуцирует мощные клеточные и гуморальные иммунные ответы различными путями введения (19, 107, 111). Сформулированные LNP самоамплифицирующиеся мРНК-вакцины, кодирующие антигены вируса гриппа, приводили к мощным Т- и В-клеточным иммунным ответам, а также обеспечивали защиту от гомологичных и гетерологичных вирусов гриппа (63, 65, 112).

Проникающие в клетки пептиды (CPP), тип катионных пептидов, представляют собой многообещающие инструменты для доставки мРНК во внутриклеточные целевые сайты. Протамин - это богатый аргинином катионный пептид, который может связываться с мРНК и переносить ее в цитоплазму. Протамин широко использовался в качестве системы доставки вакцин против рака и вирусной мРНК. Платформа самоадъювантной РНКактивной вакцины была создана с использованием протамина и продемонстрировала эффективность против различных инфекционных заболеваний и рака (76, 77, 100).Недавно Кулен и его коллеги разработали инновационную платформу для доставки, состоящую из поли (молочной кислоты) и катионных проникающих пептидов в качестве конденсирующего агента мРНК. Эти нанокомплексы были поглощены дендритными клетками, что вызвало сильную экспрессию белка и врожденный иммунный ответ (113).

Самоусиливающаяся мРНК, кодирующая HA [A / California / 07/2009 (h2N1)], инкапсулированная в наноэмульсию масло-в-воде, стимулировала защиту от гомологичного и гетерологичного вируса гриппа (65). Составление в полиэтиленимине (PEI) самоамплифицирующейся мРНК, кодирующей h2N1 / PR8-HA, привело к значительно более высокому титру антител и более длительной устойчивой экспрессии антигена, чем при использовании несформированной самоамплифицирующейся мРНК (31, 114).Хитозан и PEI также использовались для доставки самоусиливающейся -мРНК в виде наночастиц (114, 115). Chahal et al. разработали интригующую платформу, состоящую из химически модифицированной наночастицы дендримера для конденсации самоамплифицирующейся мРНК, кодирующей HA гриппа. Однократная иммунизация мышей вызвала мощный ответ CD8 + Т-клеток и антител и защитила мышей от широкого спектра смертельных патогенов, включая грипп h2N1, Toxoplasma gondii и вирус Эбола (64).

В настоящее время исследуются дополнительные новые модифицированные наночастицы, такие как полиплексы, наноплексы и доставка, опосредованная пористым полимерным каркасом (116–122).Хотя в разработке инструментов доставки были достигнуты большие успехи, идеальная платформа, возможно, представляет собой комбинацию различных инструментов доставки мРНК, и может потребоваться больше усилий для понимания механизма действия.

Механизм иммунного ответа, индуцированного мРНК вакцинами

Механизм иммунного ответа, запускаемый мРНК, еще предстоит выяснить. Процесс распознавания мРНК вакцины клеточными сенсорами и механизм активации сенсоров до сих пор не ясны.Внутриклеточно были идентифицированы два типа РНК-сенсоров: эндосомальные толл-подобные рецепторы (TLR) и семейство RIG-I-подобных рецепторов. Первый набор делится на TLR-3, TLR7, TLR8 и TLR9, которые локализованы в эндосомном компартменте профессиональных клеток иммунного надзора, таких как DC, макрофаги и моноциты. TLR3 распознает дцРНК длиной более 45 пар оснований, а также дцРНК, возникающую из одноцепочечной РНК (оцРНК), образующей вторичные структуры, или полученной из промежуточных продуктов репликации вируса.TLR7 и TLR8 активируются РНК, богатой полиуридинами, гуанозинами и / или уридинами. TLR7 может связывать как дцРНК, так и одноцепочечную РНК (оцРНК), тогда как TLR8 распознает только оцРНК (123). Активация TLR7 может увеличивать презентацию антигена, способствовать секреции цитокинов и стимулировать В-клеточные ответы (124). Последнее семейство, функционирующее как рецептор распознавания образов (PRR), включает RIG-I, MDA5 и LGP2 (125). RIG-I предпочтительно распознает ssRNA и dsRNA, несущие 5'-трифосфат, и стимулирует продукцию IFN (126–130).В структуре сегментов вирусного генома непосредственно участвует IFN-индукция посредством активации RIG-I (131). MDA5 - еще один цитозольный датчик РНК, который обнаруживает длинные дцРНК, образующиеся во время репликации РНК-вируса (132), а также РНК синтетического происхождения, включая поли I: C. Распознавание дцРНК вызывает активацию IRF3 и NF-κB, что впоследствии приводит к увеличению продукции IFN типа I (127, 133, 134). Иногда элементы дцРНК, распознаваемые сенсорами PRR, могут действовать как адъювант за счет индукции IFN (135–137).мРНК-вакцины могут стимулировать врожденный иммунитет через TLR 3, 7 и 8, RIG-I и MDA5 (138, 139). Индукция IFN с помощью мРНК вакцин через сенсоры РНК зависит от качества транскрибированной мРНК in vitro , носителя для доставки и пути введения. Восприятие мРНК системой врожденного иммунитета - палка о двух концах в устранении вторгающихся молекул. Природная экзогенная мРНК стимулирует сильную индукцию INF типа I и мощных воспалительных цитокинов, которые вызывают иммунные ответы T и B, но могут отрицательно влиять на экспрессию антигена (140–143).Интересно, что Бланшар и его коллеги разработали метод измерения активации PRR с помощью мРНК IVT в клетках и на срезах ткани. В этом методе использовался анализ близости лигирования (PLA) (144).

в.д. вакцинация с использованием технологии вакцины RNactive от CureVac AG вызвала сильные иммунные ответы, которые зависят от сигнала TLR7. Активация TLR7 приводит к усилению регуляции хемокинов, которые, в свою очередь, привлекают клетки врожденного иммунитета, такие как DC и макрофаги, к месту инъекции (100).В месте инъекции наблюдалась активация провоспалительных цитокинов, таких как TNF-α иIL-6, которые, как известно, способствуют привлечению иммунных клеток (145).

С другой стороны, раннее прекращение экспрессии антигена после вакцинации мРНК из-за активации PRR может быть вредным. Постоянно экспрессия антигена, гуморальные и Т-клеточные ответы на вакцинацию мРНК, как от обычной, так и от амплифицирующей мРНК, были значительно усилены у мышей IFNAR1 / 2 - / - (105, 146) или при совместном введении антагониста IFN (147).Негативное влияние чрезмерной активации IFN может происходить не только из-за предотвращения амплификации РНК, в случае самоамплифицирующихся вакцин и экспрессии мРНК, но также на уровне Т-клеток. Хотя IFN типа I может определять дифференцировку антиген-примированных Т-клеток CD8 + в цитотоксические эффекторы, они также могут способствовать истощению Т-клеток (140). Ингибирует ли IFN типа I или стимулирует ответ CD8 Т-клеток на вакцины с мРНК, может зависеть от времени и интенсивности индуцированного IFN типа I (140).Подавление Т-клеток может преобладать, если срабатывание рецепторов IFN типа I предшествует запуску рецепторов Т-клеток.

Модифицированная мРНК с псевдоуридинами и мРНК, очищенная с помощью ВЭЖХ, может снизить активацию иммунной системы и повысить стабильность и экспрессию антигена (35, 148, 149). Например, внутрибрюшинная инъекция мРНК, содержащей псевдоуридины, индуцировала экспрессию антигена без индукции цитокинов у мышей (150). Кроме того, в некоторых публикациях показано, что чистота и системы доставки влияют на иммунный ответ, стимулируемый мРНК-вакцинами (35).Что еще более интересно, недавнее исследование показало, что модифицированная мРНК, инкапсулированная в LNP, имеет адъювантный эффект и индуцирует мощный Т-фолликулярный хелперный ответ и большое количество В-клеток зародышевого центра с долгоживущими нейтрализующими антителами с высокой аффинностью (78).

Созревание дентритных клеток (ДК) имеет решающее значение для эффективности вакцин на основе мРНК. Обычно TLR7 экспрессировался в плазматических дентритных клетках (pDC) и B-клетках у человека, а TLR8 экспрессировался в обычных дентритных клетках (cDC), моноцитах и ​​макрофагах.кДК составляют основную резидентную популяцию ДК в нормальной дерме человека и характеризуются экспрессией CD1c (также известной как антиген-1 дендритных клеток крови (BDCA-1), тогда как плазмоцитоидные ДК присутствуют в коже (129, 151, 152). Расположение TLR7 и TLR8 в разных подгруппах DC и расположение DC в разных органах может прояснить взаимосвязь между иммунной эффективностью и способом введения и составом мРНК-вакцин. Замена модифицированной мРНК нуклеотидезина снижает активацию путем связывания мРНК с PRR и снижает врожденный иммунный ответ ( 153).мРНК-вакцины не только стимулировали специфический гуморальный иммунный ответ транслированным антигеном, но также и антиген-специфический Т-клеточный ответ. Путь введения и состав вакцины определяют пик экспрессии антигена, что является еще одним способом модуляции иммунного ответа (94, 154, 155). Liang et al. показали, что кинетика клеточной инфильтрации во многом схожа между внутримышечными инъекциями. и i.d. администрация в НПЗ (156). I.d. группа показала более сильные начальные ответы, вероятно, из-за быстрого нацеливания, активации и транспорта в dLN кожных DCs.Кроме того, только моноциты кожи и ДК показали доказательства трансляции антигена на 9-й день, что указывает на длительную доступность антигена после i.d. доставки и подтверждая более длительную экспрессию антигена, кодируемого мРНК, наблюдаемую у мышей (94).

Лучшее выяснение последовательности событий, ведущих к трансляции мРНК и активации иммунной системы, поможет разработать вакцины с мРНК, чтобы индуцировать правильный баланс индукции IFN типа I, положительно влияя на результат вакцинации.

Клинические испытания

По сравнению с профилактическим и терапевтическим применением мРНК при раке, клинические испытания мРНК-вакцин от инфекционных заболеваний все еще находятся в раннем возрасте.Пилотные клинические испытания ДК, трансфицированных мРНК, кодирующей различные антигены ВИЧ-1, клеточные молекулы или pp65 цитомегаловируса человека, показали, что вакцины с мРНК безопасны и вызывают антигенспецифические иммунные ответы Т-клеток CD4 + и CD8 + ; однако снижения вирусной нагрузки не наблюдалось (157–160).

В недавнем клиническом испытании мРНК-вакцины с протамином против вируса бешенства результаты показали, что комплексная РНК с протамином безопасна и хорошо переносится in vivo , но эффективность сильно зависит от дозы и пути введения.Эффективность введения с помощью безыгольного устройства была намного выше, чем с помощью прямой инъекции иглы (57, 161). Результаты фазы I показали, что вакцина с модифицированной мРНК h20N8 на основе LNP вызвала устойчивый гуморальный иммунный ответ у добровольцев с легкой или умеренной побочной реакцией (108).

Перспективы вакцин на основе РНК

Множество публикаций показали, что вакцины на основе мРНК представляют собой многообещающую новую платформу, которая отличается высокой гибкостью, масштабируемостью, недорого и не требует применения холодовой цепи.Что наиболее важно, вакцины на основе мРНК могут заполнить пробел между возникающим пандемическим инфекционным заболеванием и обильным запасом эффективных вакцин. Множество доклинических и клинических проектов сделали огромные шаги в направлении возможного применения мРНК-вакцин и предположили, что профилактика и терапия на основе мРНК могут быть переведены на приложения для человека. Хотя в медицинском применении величина ответов была ниже, чем прогнозировалось, по сравнению с теми, которые наблюдались на животных моделях, результаты пилотных клинических испытаний показали хорошую переносимость и что вакцинация мРНК может вызывать антиген-специфические Т- и В-клеточные иммунные ответы (57, 108) .Таким образом, мРНК открывает большие перспективы, но для полноценной разработки вакцин с мРНК все еще необходимо дальнейшее понимание механизма действия и эффективности. Необходимы исследования новых стратегий для создания подходящих мРНК-вакцин и снижения дозы. Как описано выше, молекулярное влияние врожденного иммунного ответа, стимулированного мРНК через распознавание PAMP, все еще не ясно. Были предприняты многочисленные попытки улучшить стабильность и эффективность доставки in vivo мРНК вакцины , включая включение 5'- и 3'-концевых нетранслируемых областей и химически модифицированных нуклеозидов (162–164).Исследование продемонстрировало удаление примесей дцРНК с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии; очистка in vitro транскрибированной мРНК продлила трансляцию (35). Исследования показали, что модифицированный нуклеозид снижает врожденный иммунный ответ и увеличивает экспрессию белка. Оптимизация 5'-нетранслируемой области (5'-UTR) мРНК, вторичные структуры которой распознаются клеточно-специфическими РНК-связывающими белками или молекулами PAMP, может максимизировать трансляционный выход терапевтических средств мРНК и вакцин (43, 165).Однако неправильное включение модифицированных нуклеозидов может отрицательно повлиять на продукты транскрипции и увеличить затраты.

На основе результатов описанных выше исследований будет достигнуто лучшее понимание механизма действия мРНК-вакцин, идентификация и разработка новой системы доставки, а также усовершенствование дизайна мРНК-вакцины (166).

Вакцины с мРНК

обладают большим потенциалом и обладают преимуществами по сравнению с обычными вакцинами. Растущее количество доклинических и клинических результатов демонстрирует, что профилактика и терапия мРНК обещают быть полезными для предотвращения инфекционных заболеваний и лечения опухолей, и что вакцины с мРНК безопасны и переносятся на животных моделях и у людей.Кроме того, будущие улучшения должны повысить антиген-специфические иммунные ответы и величину ответов иммунных клеток памяти, включая ответы B- и T-клеток. Хотя технология создания мРНК-вакцины до сих пор не прошла обширных испытаний на людях, в последние годы появились публикации о доклинических и ранних клинических испытаниях, в которых сообщалось о многообещающих результатах. Это вызвало у биокомпаний импульс к коммерциализации мРНК-вакцин с большим энтузиазмом (167, 168). Некоторые частные финансовые ресурсы и институты поддержали исследования и разработку мРНК-вакцин (169, 170).Несмотря на необходимость дальнейшей оптимизации производственных процессов для создания мРНК-вакцин, мы надеемся, что эти процессы будут оптимизированы для создания крупномасштабного производства. Использование РНК-вакцин для людей и животных - лишь вопрос времени.

Авторские взносы

Эту рукопись написали

CZ, JL и HS. JL и GM отредактировали эту рукопись.

Финансирование

Программа развития приоритетных академических талантов колледжей и университетов Шаньдуна, Программа талантов Сельскохозяйственного университета Циндао.Национальная программа Китая по исследованиям и разработкам «Тринадцать-пять» (2017YFD0500805).

Заявление о конфликте интересов

GM является сотрудником группы компаний GSK и сообщает о владении акциями GSK и / или ограниченными акциями GSK.

Остальные авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Приносим извинения за то, что не включили все публикации наших коллег.

Список литературы

1. Lents MP, Barbosa LP, Santana ALA, Pinheiro EEG, Mugabe LC, Biscarde CEA и др. Иммунокастрация коз с использованием вакцины против гонадотропин-рилизинг-гормона. Териогенология. (2018) 114: 7–13. DOI: 10.1016 / j.theriogenology.2018.03.013

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

4. Ли Б, Фанг Л., Сюй З, Лю С., Гао Дж, Цзян И и др. Рекомбинация в вакцинах и циркулирующих штаммах вирусов репродуктивного и респираторного синдрома свиней. Emerg Infect Dis . (2009) 15: 2032–5. DOI: 10.3201 / eid1512.0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

5. Чжоу Б., Мелиопулос В.А., Ван В., Лин Х, Стакер К.М., Халпин Р.А. и др. Вентворт. превращение адаптированной к холоду живой аттенуированной вакцины против гриппа в патогенный вирус. J Virol. (2016) 90: 8454–63. DOI: 10.1128 / JVI.00163-16

CrossRef Полный текст | Google Scholar

6. Байтч Л., Баумгаертнер П., Девевр Э., Рагхав С.К., Легат А., Барба Л. и др.Истощение опухолеспецифических CD8 (+) Т-клеток в метастазах от пациентов с меланомой. Дж. Клин Инвест . (2011) 121: 2350–60. DOI: 10.1172 / JCI46102

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

7. Ли Дж., Аревало М. Т., Чен Ю., Чен С., Цзэн М. Опосредованный Т-клетками кросс-штаммовый защитный иммунитет, вызванный первичной буст-вакцинацией живой аттенуированной противогриппозной вакциной. Int J Заразить Dis . (2014) 27: 37–43. DOI: 10.1016 / j.ijid.2014.05.016

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

8.Парди Н., Паркхаус К., Киркпатрик Э., МакМахон М., Зост С.Дж., Муи Б.Л. и др. Иммунизация мРНК, модифицированной нуклеозидами, выявляет антитела, специфичные для стеблей гемагглютинина вируса гриппа. Нац Коммуна . (2018) 9: 3361. DOI: 10.1038 / s41467-018-05482-0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

9. Холлистер К., Чен Ю., Ван С., Ву Х., Мондал А., Клегг Н. и др. Роль фолликулярных хелперных Т-клеток и зародышевого центра в первичной вакцинации ДНК gp120 ВИЧ-1 и бустерной иммунизации белком gp120. Hum Vaccin Immunother. (2014) 10: 1985–92. DOI: 10.4161 / hv.28659

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

12. Багарацци М.Л., Ян Дж., Морроу М.П., ​​Шен Х, Паркер Р.Л., Ли Дж.С. и др. Иммунотерапия против HPV16 / 18 вызывает мощный Th2-иммунный и цитотоксический клеточный иммунный ответ. Научный перевод медицины . (2012) 4: 155ra138. DOI: 10.1126 / scitranslmed.3004414

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

14. Faurez F, Dory D, Le Moigne V, Gravier R, Jestin A.Биобезопасность ДНК-вакцин: новое поколение ДНК-векторов и современные знания о судьбе плазмид после инъекции. Вакцина . (2010) 28: 3888–95. DOI: 10.1016 / j.vaccine.2010.03.040

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

15. Вольф Дж. А., Мэлоун Р. В., Уильямс П., Чонг В., Асади Дж., Яни А. и др. Прямой перенос гена в мышцу мыши in vivo . Наука . (1990) 247: 1465–8.

PubMed Аннотация | Google Scholar

18.Каллен К.Дж., Тесс А. Разработка, которая может перерасти в революцию в медицине: мРНК как основа для новых вакцин и лекарств на основе нуклеотидов. Вакцины Ther Adv . (2014) 2: 10–31. DOI: 10.1177 / 2051013613508729

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

22. Геалл А.Дж., Верма А., Оттен Г.Р., Шоу К.А., Хекеле А., Банерджи К. и др. Невирусная доставка самоусиливающихся РНК-вакцин. Proc Natl Acad Sci USA. (2012) 109: 14604–9. DOI: 10.1073 / пнас.1209367109

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

23. Брито Л.А., Чан М., Шоу КА, Хекеле А., Карсилло Т., Шефер М. и др. Катионная наноэмульсия для доставки РНК-вакцин нового поколения. Мол тер . (2014) 22: 2118–29. DOI: 10.1038 / mt.2014.133

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

24. Диринг Р.П., Коммаредди С., Улмер Дж. Б., Брито Л.А., Джилл А.Дж.. Вакцины на основе нуклеиновых кислот: перспективы невирусной доставки мРНК-вакцин. Мнение эксперта: Доставка лекарств . (2014) 11: 885–99. DOI: 10.1517 / 17425247.2014.

8

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

28. Анраку И., Харви Т.Дж., Линдейл Р., Гарднер Дж., Харрич Д., Зурбьер А. и др. Вакцинные векторы репликона вируса Кунджин индуцируют защитный CD8 + Т-клеточный иммунитет. Дж Вирол . (2002) 76: 3791–9. DOI: 10.1128 / JVI.76.8.3791-3799.2002

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

29. Йоханнинг Ф.В., Конри Р.М., Лобульо А.Ф., Райт М., Сумерел Л.А., Пайк М.Дж. и др.Полинуклеотидный вектор мРНК вируса Синдбис обеспечивает пролонгированную и высокую экспрессию гетерологичного гена in vivo . Nucleic Acids Res . (1995) 23: 1495–501.

PubMed Аннотация | Google Scholar

30. Чжоу X, Берглунд П., Родос Дж., Паркер С.Е., Джондал М., Лильестром П. Самореплицирующаяся РНК вируса леса семлики в качестве рекомбинантной вакцины. Вакцина . (1994) 12: 1510–4.

PubMed Аннотация | Google Scholar

31. Фогель А.Б., Ламберт Л., Киннер Э., Буссе Д., Эрбар С., Рейтер К.С. и др.Самоусиливающиеся РНК-вакцины обеспечивают защиту от гриппа, эквивалентную мРНК-вакцинам, но в гораздо более низких дозах. Мол тер . (2018) 26: 446–55. DOI: 10.1016 / j.ymthe.2017.11.017

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

34. Пробст Дж., Вайде Б., Шил Б., Пихлер Б.Дж., Хёрр И., Раммензее Х.Г. и др. Спонтанное клеточное поглощение экзогенной матричной РНК in vivo специфично для нуклеиновых кислот, насыщается и зависит от ионов. Джин Тер .(2007) 14: 1175–80. DOI: 10.1038 / sj.gt.3302964

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

35. Карико К., Мурамацу Х., Людвиг Дж., Вайсман Д. Создание оптимальной мРНК для терапии: очистка ВЭЖХ устраняет активацию иммунной системы и улучшает трансляцию модифицированной нуклеозидами мРНК, кодирующей белок. Nucleic Acids Res . (2011) 39: e142. DOI: 10.1093 / nar / gkr695

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

38.Козак М. Анализ 5'-некодирующих последовательностей из 699 информационных РНК позвоночных. Nucleic Acids Res . (1987) 15: 8125–48.

PubMed Аннотация | Google Scholar

41. Ли Х., Бингхэм С.Е., Уэббер А.Н. Функция 3'-некодирующих последовательностей и использование стоп-кодонов в экспрессии гена psaB хлоропласта в Chlamydomonas reinhardtii . Завод Мол Биол . (1996) 31: 337–54.

PubMed Аннотация | Google Scholar

42. Галли DR.Кепка и поли (А) хвост действуют синергетически, регулируя эффективность трансляции мРНК. Genes Dev . (1991) 5: 2108–16.

PubMed Аннотация | Google Scholar

43. Holtkamp S, Kreiter S, Selmi A, Simon P, Koslowski M, Huber C, et al. Модификация антиген-кодирующей РНК увеличивает стабильность, эффективность трансляции и способность дендритных клеток к стимуляции Т-лимфоцитов. Кровь . (2006) 108: 4009–17. DOI: 10.1182 / кровь-2006-04-015024

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

44.Зохра Ф. Т., Чоудхури Е. Х., Тада С., Хошиба Т., Акаике Т. Эффективная доставка с повышенной трансляционной активностью синергетически ускоряет трансфекцию на основе мРНК. Biochem Biophys Res Commun . (2007) 358: 373–8. DOI: 10.1016 / j.bbrc.2007.04.059

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

45. Орландини фон Ниссен А.Г., Полеганов М.А., Рехнер С., Плашке А., Кранц Л.М., Фессер С. и др. Улучшение доставки терапевтического гена на основе мРНК путем увеличения экспрессии 3'-НТО, идентифицированных с помощью скрининга клеточной библиотеки. Мол тер . (2018) 18: 30595–1. DOI: 10.1016 / j.ymthe.2018.12.011

CrossRef Полный текст | Google Scholar

46. Puigbo P, Guzman E, Romeu A, Garcia-Vallve S. OPTIMIZER: веб-сервер для оптимизации использования кодонов в последовательностях ДНК. Nucleic Acids Res . (2007) 35: W126–31. DOI: 10.1093 / nar / gkm219

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

47. Kudla G, Lipinski L, Caffin F, Helwak A, Zylicz M. Высокое содержание гуанина и цитозина увеличивает уровни мРНК в клетках млекопитающих. ПЛоС Биол . (2006) 4: e180. DOI: 10.1371 / journal.pbio.0040180

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

49. Thess A, Grund S, Mui BL, Hope MJ, Baumhof P, Fotin-Mleczek M, et al. МРНК с последовательной инженерией без химических модификаций нуклеозидов позволяет проводить эффективную белковую терапию у крупных животных. Мол тер . (2015) 23: 1456–64. DOI: 10.1038 / mt.2015.103

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

50.Андерсон Б.Р., Мурамацу Х., Наллагатла С.Р., Бевилаква П.К., Сансинг Л.Х., Вайсман Д. и др. Включение псевдоуридина в мРНК усиливает трансляцию за счет уменьшения активации PKR. Nucleic Acids Res . (2010) 38: 5884–92. DOI: 10.1093 / nar / gkq347

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

51. Andries O, Mc Cafferty S, De Smedt SC, Weiss R, Sanders NN, Kitada T. МРНК, включенная в N (1) -метилпсевдоуридин, превосходит по эффективности мРНК, включенную в псевдоуридин, обеспечивая повышенную экспрессию белка и сниженную иммуногенность в линиях клеток млекопитающих и мышей. J Control Release . (2015) 217: 337–44. DOI: 10.1016 / j.jconrel.2015.08.051

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

52. Мейер М., Хуанг Э., Южаков О., Раманатан П., Чарамелла Г., Букреев А. Модифицированные вакцины на основе мРНК вызывают устойчивый иммунный ответ и защищают морских свинок от болезни, вызванной вирусом Эбола. J Заразить Dis . (2018) 217: 451–55. DOI: 10.1093 / infdis / jix592

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

53.Van Gulck ER, Ponsaerts P, Heyndrickx L, Vereecken K, Moerman F, De Roo A и др. Эффективная стимуляция ВИЧ-1-специфических Т-клеток с использованием дендритных клеток, электропорированных мРНК, кодирующей аутологичные белки Gag и Env ВИЧ-1. Кровь . (2006) 107: 1818–27. DOI: 10.1182 / кровь-2005-01-0339

CrossRef Полный текст | Google Scholar

55. Парди Н., Мурамацу Х., Вайсман Д., Карико К. In vitro транскрипция длинной РНК, содержащей модифицированные нуклеозиды. Methods Mol Biol. (2013) 969: 29–42. DOI: 10.1007 / 978-1-62703-260-5_2

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

57. Alberer M, Gnad-Vogt U, Hong HS, Mehr KT, Backert L, Finak G, et al. Безопасность и иммуногенность мРНК вакцины против бешенства у здоровых взрослых: открытое, нерандомизированное, проспективное, первое клиническое испытание фазы 1 с участием людей. Ланцет . (2017) 390: 1511–20. DOI: 10.1016 / S0140-6736 (17) 31665-3

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

58.Stitz L, Vogel A, Schnee M, Voss D, Rauch S, Mutzke T. и др. Вакцина против бешенства на основе термостабильной информационной РНК. PLoS Negl Trop Dis. (2017) 11: e0006108. DOI: 10.1371 / journal.pntd.0006108

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

59. Кули П.Г., Ван ден Эйнде Б.Дж., ван дер Бругген П., Бун Т. Опухолевые антигены, распознаваемые Т-лимфоцитами: в основе иммунотерапии рака. Нат Рев Рак . (2014) 14: 135–146. DOI: 10.1038 / nrc3670

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

62.Fleeton MN, Chen M, Berglund P, Rhodes G, Parker SE, Murphy M и др. Саморепликативные РНК-вакцины обеспечивают защиту от вируса гриппа А, респираторно-синцитиального вируса и вируса клещевого энцефалита. J Заразить Dis . (2001) 183: 1395–8. DOI: 10.1086 / 319857

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

63. Маджини Д., Джовани С., Мангиаваччи С., Маккари С., Чекки Р., Ульмер Дж. Б. и др. Самоамплифицирующиеся мРНК-вакцины, экспрессирующие несколько консервативных антигенов гриппа, обеспечивают защиту от гомологичного и гетеросубтипического вирусного заражения. PLoS ONE . (2016) 11: e0161193. DOI: 10.1371 / journal.pone.0161193

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

64. Чахал Дж.С., Хан О.Ф., Купер К.Л., Макпартлан Дж.С., Цози Дж. К., Тилли Л.Д. и др. Наночастицы дендример-РНК генерируют защитный иммунитет против смертельной инфекции Эбола, гриппа h2N1 и заражения Toxoplasma gondii с помощью однократной дозы. Proc Natl Acad Sci USA. (2016) 113: E4133–42. DOI: 10.1073 / pnas.1600299113

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

65.Brazzoli M, Magini D, Bonci A, Buccato S, Giovani C, Kratzer R и др. Индукция широкого иммунитета и защитной эффективности за счет самоусиливающихся мРНК-вакцин, кодирующих гемагглютинин вируса гриппа. Дж Вирол . (2016) 90: 332–44. DOI: 10.1128 / JVI.01786-15

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

66. Скорца Ф. Б., Парди Н. Новые дети на пороге: вакцины против вируса гриппа на основе РНК. Вакцины. (2018) 6: pii: E20. DOI: 10.3390 / Vacines6020020

CrossRef Полный текст | Google Scholar

67.Зост С.Дж., Паркхаус К., Гумина М.Э., Ким К., Диас Перес С., Уилсон П.К. и др. Современные вирусы гриппа h4N2 имеют сайт гликозилирования, который изменяет связывание антител, вызванных штаммами вакцины, адаптированными к яйцам. Proc Natl Acad Sci USA . (2017) 114: 12578–83. DOI: 10.1073 / pnas.1712377114

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

68. Wu NC, Zost SJ, Thompson AJ, Oyen D, Nycholat CM, McBride R, et al. Структурное объяснение низкой эффективности вакцины против сезонного гриппа h4N2. PLoS Патог . (2017) 13: e1006682. DOI: 10.1371 / journal.ppat.1006682

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

69. Пулидо М.Р., Собрино Ф., Боррего Б., Саиз М. Иммунизация РНК может защитить мышей от вируса ящура. Антивирусная защита . (2010) 85: 556–8. DOI: 10.1016 / j.antiviral.2009.12.005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

70. Saxena S, Sonwane AA, Dahiya SS, Patel CL, Saini M, Rai A., et al.Индукция иммунных ответов и защита мышей от бешенства с использованием самовоспроизводящейся РНК-вакцины, кодирующей гликопротеин вируса бешенства. Ветеринарная микробиология . (2009) 136: 36–44. DOI: 10.1016 / j.vetmic.2008.10.030

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

71. ВанБларган Л.А., Химансу С., Форман Б.М., Эбель Г.Д., Пирсон Т.С., Даймонд МС. Вакцина с мРНК защищает мышей от множественных флавивирусных инфекций, передаваемых клещами. Сотовый представитель . (2018) 25: 3382–3392 e3.DOI: 10.1016 / j.celrep.2018.11.082

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

72. Мартинон Ф., Кришнан С., Лензен Дж., Магне Р., Гомард Е., Гийе Дж. Г. и др., Индукция вирус-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов in vivo с помощью захваченной липосомами мРНК. евро J Immunol . (1993) 23: 1719–22. DOI: 10.1002 / eji.1830230749

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

73. Zhao M, Li M, Zhang Z, Gong T, Sun X. Индукция иммунных ответов, специфичных для gag ВИЧ-1, с помощью катионных мицелл, опосредованной доставкой gag мРНК Drug Deliv. A. (2016) 23: 2596–607. DOI: 10.3109 / 10717544.2015.1038856

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

74. Парди Н., Хоган М.Дж., Пелк Р.С., Мурамацу Х., Андерсен Х., ДеМасо С.Р. и др. Защита от вируса Зика с помощью однократной вакцинации малой дозой модифицированной нуклеозидами мРНК. Природа. (2017) 543: 248–51. DOI: 10.1038 / nature21428

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

75. Ричнер Дж. М., Химансу С., Дауд К. А., Батлер С. Л., Салазар В., Фокс Дж. М. и др.Бриллиант. Вакцины с модифицированной мРНК защищают от заражения вирусом Зика. Ячейка. (2017) 168: 1114–25 e10. DOI: 10.1016 / j.cell.2017.02.017

CrossRef Полный текст | Google Scholar

76. Петч Б., Шнее М., Фогель А.Б., Ланге Э., Хоффманн Б., Фосс Д. и др. Защитная эффективность синтезированных in vitro специфических мРНК-вакцин против инфекции вируса гриппа А. Нат Биотехнология . (2012) 30: 1210–6. DOI: 10.1038 / NBT.2436

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

77.Schnee M, Vogel AB, Voss D, Petsch B, Baumhof P, Kramps T. и др. Вакцина с мРНК, кодирующая гликопротеин вируса бешенства, индуцирует защиту от летальной инфекции у мышей и коррелирует с защитой у взрослых и новорожденных свиней. PLoS Негл Троп Дис . (2016) 10: e0004746. DOI: 10.1371 / journal.pntd.0004746

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

78. Парди Н., Хоган М.Дж., Нарадикян М.С., Паркхаус К., Каин Д.В., Джонс Л. и др. МРНК-вакцины, модифицированные нуклеозидами, вызывают сильные Т-фолликулярные хелперы и В-клеточные ответы зародышевого центра. J Exp Med . (2018). 215: 1571–88. DOI: 10.1084 / jem.20171450

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

79. Парди Н., Секрето А.Дж., Шан Х, Дебонера Ф., Гловер Дж., Йи Йи и др. Введение модифицированной нуклеозидами мРНК, кодирующей широко нейтрализующее антитело, защищает гуманизированных мышей от заражения ВИЧ-1. Нац Коммуна . (2017) 8: 14630. DOI: 10.1038 / ncomms14630

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

80.Халил С.М., Тонкин Д.Р., Мэттокс, доктор медицины, Снид А.Т., Джонстон Р.Э., Белый Ж.Дж. Вакцина против денге на основе четырехвалентного альфавируса-вектора обеспечивает эффективный иммунитет на модели мышей в раннем возрасте. Вакцина . (2014) 32: 4068–74. DOI: 10.1016 / j.vaccine.2014.05.053

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

82. Пьянков О.В., Боднев С.А., Пьянкова О.Г., Солодкий В.В., Пьянков С.А., Сетох Ю.Х. и др. Вакцина из вирусоподобных частиц репликона кунджин обеспечивает защиту от заражения вирусом Эбола у нечеловеческих приматов. J Заразить Dis . (2015) 212 (Дополнение 2): S368–71. DOI: 10.1093 / infdis / jiv019

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

83. Орешкова Н., Корнелиссен Л.А., де Хаан К.А., Мурманн Р.Дж., Кортекаас Дж. Оценка нераспространяющегося вируса лихорадки Рифт-Валли в качестве вектора вакцины с использованием гемагглютинина вируса гриппа в качестве модельного антигена. Вакцина . (2014) 32: 5323–9. DOI: 10.1016 / j.vaccine.2014.07.051

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

84.Ван де Валл С., Вальчак М., ван Рой Н., Хугебум Б.Н., Мейерхоф Т., Нейман Х.В. и др. Перенос татуировки вакцины на основе вируса лесного семлики, кодирующей вирус папилломы человека E6 и E7. Вакцины . (2015) 3: 221–38. DOI: 10.3390 / Vacines3020221

CrossRef Полный текст | Google Scholar

85. Богерс В.М., Остермейер Х., Моидж П., Купман Г., Вершур Э.Д., Дэвис Д. и др. Мощные иммунные ответы у макак-резусов, индуцированные невирусной доставкой самоусиливающейся РНК-вакцины, экспрессирующей оболочку ВИЧ типа 1, с катионной наноэмульсией. J Заразить Dis . (2015) 211: 947–55. DOI: 10.1093 / infdis / jiu522

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

86. Харви Т.Дж., Анраку И., Лайндейл Р., Харрич Д., Маккензи Дж., Зурбье А. и др. Векторы репликона вируса Кунджин для разработки вакцины против вируса иммунодефицита человека. Дж Вирол . (2003) 77: 7796–803. DOI: 10.1128 / JVI.77.14.7796-7803.2003

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

87. Хуан Ю.Т., Ляо Д.Т., Йен Л.С., Чанг Ю.К., Лин Ю.Л., Ляо К.Л.Вакцина на основе репликона вируса японского энцефалита, экспрессирующая эпитоп энтеровируса-71, обеспечивает двойную защиту от летального заражения. Дж. Биомед. Наука . (2015) 22:74. DOI: 10.1186 / s12929-015-0181-8

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

88. Hofmann I, Wen Y, Ciferri C, Schulze A, Fuhner V, Leong M, et al. Экспрессия пентамерного комплекса цитомегаловируса человека для использования в вакцинах в системе СНО. Биотехнология Биоенг . (2015) 112: 2505–15.DOI: 10.1002 / бит. 25670

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

89. Маругги Г., Кьярот Е., Джовани С., Буккато С., Боначчи С., Фригимелика Е. и др. Иммуногенность и защитная эффективность, индуцированные самоамплифицирующимися мРНК-вакцинами, кодирующими бактериальные антигены. Vaccin. (2017) 35: 361–8. DOI: 10.1016 / j.vaccine.2016.11.040

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

90. Moyo N, Vogel AB, Buus S, Erbar S, Wee EG, Sahin U, et al.Эффективная индукция Т-клеток против консервативных областей ВИЧ-1 с помощью мозаичных вакцин, доставляемых в виде самоамплифицирующейся мРНК. Mol Ther Methods Clin Dev. (2019) 12: 32–46. DOI: 10.1016 / j.omtm.2018.10.010

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

91. IP PP, Boerma A, Regts J, Meijerhof T, Wilschut J, Nijman HW, et al. Вакцины на основе альфавируса, кодирующие неструктурные белки вируса гепатита С, вызывают устойчивые и защитные Т-клеточные ответы. Мол тер .(2014) 22: 881–90. DOI: 10.1038 / mt.2013.287

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

92. Aberle JH, Aberle SW, Kofler RM, Mandl CW. Гуморальный и клеточный иммунный ответ на иммунизацию РНК репликонами флавивирусов, полученными из вируса клещевого энцефалита. Дж Вирол . (2005) 79: 15107–13. DOI: 10.1128 / JVI.79.24.15107-15113.2005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

93. Уайтхед К.А., Дальман Дж. Э., Лангер Р.С., Андерсон Д.Г.Молчание или стимуляция? Доставка миРНК и иммунная система. Annu Rev Chem Biomol Eng. (2011) 2: 77–96. DOI: 10.1146 / annurev-chembioeng-061010-114133

CrossRef Полный текст | Google Scholar

94. Парди Н., Туйишиме С., Мурамацу Х., Карико К., Муй Б.Л., Там Ю.К. и др. Кинетика экспрессии модифицированной нуклеозидами мРНК, доставленной мышам в липидных наночастицах различными путями. J Control Release . (2015) 217: 345–51. DOI: 10.1016 / j.jconrel.2015.08.007

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

95.Линдгрен Г., Олс С., Лян Ф., Томпсон Э.А., Лин А., Хеллгрен Ф. и др. Индукция устойчивых В-клеточных ответов после вакцинации против мРНК гриппа сопровождается циркулирующими гемагглютинин-специфическими ICOS + PD-1 + CXCR3 + T фолликулярными вспомогательными клетками. Фронт Иммунол . (2017) 8: 1539. DOI: 10.3389 / fimmu.2017.01539

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

96. Крейтер С., Селми А., Дикен М., Кословски М., Бриттен С.М., Хубер С. и др. Интранодальная вакцинация «голой» антиген-кодирующей РНК вызывает мощный профилактический и терапевтический противоопухолевый иммунитет. Cancer Res . (2010) 70: 9031–40. DOI: 10.1158 / 0008-5472.CAN-10-0699

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

97. Ван Наффель А.М., Бентейн Д., Вильгенхоф С., Корталс Дж., Хейрман С., Нейнс Б. и др. Внутривенная и внутрикожная терапия дендритными клетками TriMix приводит к широкому Т-клеточному ответу и стойкому опухолевому ответу у пациента с химиорезистентной меланомой стадии IV-M1c. Cancer Immunol Immunother . (2012) 61: 1033–43. DOI: 10.1007 / s00262-011-1176-2

CrossRef Полный текст | Google Scholar

98.Ван Линт С., Гойвертс С., Маенхаут С., Геталс Л., Дизи А., Бентейн Д. и др. Тилеманс. Доклиническая оценка противоопухолевой терапии на основе TriMix и мРНК антигенов. Cancer Res . (2012) 72: 1661–71. DOI: 10.1158 / 0008-5472.CAN-11-2957

CrossRef Полный текст | Google Scholar

99. Ван Линт С., Ренманс Д., Брус К., Гёталс Л., Маенхаут С., Бентейн Д. и др. Внутриопухолевая доставка мРНК TriMix приводит к активации Т-клеток перекрестно-презентирующими дендритными клетками. Cancer Immunol Res .(2016) 4: 146–56. DOI: 10.1158 / 2326-6066.CIR-15-0163

CrossRef Полный текст | Google Scholar

100. Kallen KJ, Heidenreich R, Schnee M, Petsch B, Schlake T, Thess A, et al. Новая революционная технология вакцинации: самоадъювантные РНКактивные ((R)) вакцины. Hum Vaccin Immunother . (2013) 9: 2263–76. DOI: 10.4161 / hv.25181

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

101. Кауфман К.Дж., Уэббер М.Дж., Андерсон Д.Г. Материалы для невирусной внутриклеточной доставки терапевтических средств матричной РНК. J Control Release . (2016) 240: 227–34. DOI: 10.1016 / j.jconrel.2015.12.032

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

104. Lv H, Zhang S, Wang B, Cui S, Yan J. Токсичность катионных липидов и катионных полимеров при доставке генов. J Control Release. (2006) 114: 100–9. DOI: 10.1016 / j.jconrel.2006.04.014

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

105. Поллард К., Рейман Дж., Де Хаес В., Верриер Б., Ван Гулк Е., Нессенс Т. и др.IFN типа I противодействует индукции антиген-специфических иммунных ответов путем доставки мРНК вакцин на основе липидов. Мол тер . (2013) 21: 251–9. DOI: 10.1038 / mt.2012.202

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

106. Ли М., Чжао М., Фу И, Ли И, Гонг Т., Чжан Зи и др. Улучшенная интраназальная доставка мРНК вакцины за счет преодоления назального эпителиального барьера через внутри- и параклеточные пути. J Control Release . (2016) 228: 9–19. DOI: 10.1016 / j.jconrel.2016.02.043

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

107. Кранц Л.М., Дикен М., Хаас Х., Крейтер С., Локвай С., Рейтер К.С. и др. Системная доставка РНК к дендритным клеткам использует противовирусную защиту для иммунотерапии рака. Природа. (2016) 534: 396–401. DOI: 10.1038 / природа18300

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

108. Бахл К., Сенн Дж. Дж., Южаков О., Булычев А., Брито Л. А., Хассет К. Дж. И др.Доклиническая и клиническая демонстрация иммуногенности мРНК-вакцинами против вирусов гриппа h20N8 и H7N9. Mol Ther. (2017) 25: 1316–27. DOI: 10.1016 / j.ymthe.2017.03.035

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

109. Скотт Дж. М., Лебратти Т. Дж., Рихнер Дж. М., Цзян Х, Фернандес Э., Чжао Х. и др. Клеточный и гуморальный иммунитет защищают мышей от вагинальной инфекции вирусом Зика. Дж Вирол . (2018) 92: JVI.00038-18. DOI: 10.1128 / JVI.00038-18

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

110. Седик М., Сенн Дж. Дж., Линн А., Ласка М., Смит М., Платц С. Дж. И др. Оценка безопасности модифицированной мРНК на основе липидных наночастиц у крыс sprague-dawley и cynomolgus. Vet Pathol. (2018) 55: 341–354. DOI: 10.1177 / 0300985817738095

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

111. Оберли М.А., Райхмут А.М., Доркин Дж.Р., Митчелл М.Дж., Фентон О.С., Якленек А. и др.Доставка мРНК с помощью липидных наночастиц для мощной иммунотерапии рака. Nano Lett. (2017) 17: 1326–35. DOI: 10.1021 / acs.nanolett.6b03329

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

112. Хекеле А., Бертолет С., Арчер Дж., Гибсон Д.Г., Палладино Дж., Брито Л.А. и др. Быстро производимая вакцина SAM ((R)) против гриппа H7N9 является иммуногенной для мышей. Эмерджентные микробы заразят . (2013) 2: e52. DOI: 10.1038 / emi.2013.54

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

113.Кулен А.Л., Лакруа С., Мерсье-Гуи П., Делон Е., Монж С., Экспозито Дж. Ю. и др. Наночастицы полимолочной кислоты и проникающий в клетки пептид усиливают экспрессию вакцины на основе мРНК в дендритных клетках, запуская их активацию. Биоматериалы . (2019) 195: 23–37. DOI: 10.1016 / j.biomaterials.2018.12.019

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

114. Демулинс Т., Милона П., Энглезу П.С., Эбенсен Т., Шульце К., Сутер Р. и др. Полиплексная доставка самореплицирующихся РНК-вакцин на основе полиэтиленимина. Наномедицина . (2016) 12: 711–22. DOI: 10.1016 / j.nano.2015.11.001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

115. Маккалоу К.С., Басси И., Милона П., Сутер Р., Томанн-Харвуд Л., Энглезу П. и др. Самореплицирующаяся доставка репликона-РНК к дендритным клеткам с помощью наночастиц хитозана для трансляции In Vitro и In Vivo . Мол тер нуклеиновых кислот . (2014) 3: e173. DOI: 10.1038 / mtna.2014.24

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

117.Мандал Х, Катияр С.С., Свами Р., Кушва В., Катаре ПБ, Кумар Мека А. и др. эпсилон-поли-l-лизин / наноплексы плазмидной ДНК для эффективной доставки генов in vivo. Int J Pharm. (2018) 542: 142–52. DOI: 10.1016 / j.ijpharm.2018.03.021

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

119. Форнагуера С., Герра-Реболло М., Анхель Лазаро М., Кастельс-Сала С., Мека-Кортес О, Рамос-Перес В. и др. Система доставки мРНК для нацеливания на антигенпрезентирующие клетки in vivo . Adv Healthc Mater . (2018) 7: e1800335. DOI: 10.1002 / adhm.201800335

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

120. Ван И, Су ХХ, Ян Й, Ху И, Чжан Л., Бланкафорт П. и др. Системная доставка модифицированной мРНК, кодирующей тимидинкиназу 1 вируса простого герпеса, для направленной генной терапии рака. Мол тер . (2013) 21: 358–67. DOI: 10.1038 / mt.2012.250

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

121.О.Хаабет А.В., Блейк Т.Р., МакКинли С.Дж., Уэймут Р.М., Вендер П.А., Леви Р. Вакцинация мРНК с изменяющими заряд высвобождаемыми переносчиками вызывает ответы Т-клеток человека и излечивает сформировавшиеся опухоли у мышей. Proc Natl Acad Sci USA . (2018) 115: E9153–61. DOI: 10.1073 / pnas.1810002115

CrossRef Полный текст

122. McKinlay CJ, Беннер Н.Л., Хаабет О.А., Уэймут, Р.М., Вендер, Пенсильвания. Усиленная доставка мРНК в лимфоциты благодаря разным липидам библиотекам высвобождаемых транспортеров с изменяющимся зарядом. Proc Natl Acad Sci USA . (2018) 115: E5859–66. DOI: 10.1073 / pnas.1805358115

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

123. Ablasser, Poeck H, Anz D, Berger M, Schlee M, Kim S, et al. Выбор молекулярной структуры и доставки олигонуклеотидов РНК для активации TLR7 по сравнению с TLR8 и для индукции высоких количеств IL-12p70 в первичных моноцитах человека. J Immunol. (2009) 182: 6824–33. DOI: 10.4049 / jimmunol.0803001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

126.Rehwinkel J, Tan CP, Goubau D, Schulz O, Pichlmair A, Bier K и др. RIG-I обнаруживает вирусную геномную РНК во время инфицирования вирусом РНК с отрицательной цепью. Ячейка. (2010) 140: 397–408. DOI: 10.1016 / j.cell.2010.01.020

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

127. Goubau D, Schlee M, Deddouche S, Pruijssers AJ, Zillinger T, Goldeck M, et al. Противовирусный иммунитет через RIG-I-опосредованное распознавание РНК, несущей 5'-дифосфаты. Природа . (2014) 514: 372–375.DOI: 10.1038 / природа13590

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

129. Грегорио Дж., Меллер С., Конрад С., Ди Нардо А., Хоми Б., Лауэрма А. и др. Плазмацитоидные дендритные клетки ощущают повреждение кожи и способствуют заживлению ран с помощью интерферонов типа I. J Exp Med. (2010) 207: 2921–30. DOI: 10.1084 / jem.20101102

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

131. Лю G, Park HS, Pyo HM, Liu Q, Zhou Y. Грипповидная структура панкрекинга вируса гриппа непосредственно участвует в активации RIG-I и индукции интерферона. J Virol. (2015) 89: 6067–79. DOI: 10.1128 / JVI.00232-15

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

132. Feng Q, Hato SV, Langereis MA, Zoll J, Virgen-Slane R, Peisley A, et al. MDA5 обнаруживает репликативную форму двухцепочечной РНК в клетках, инфицированных пикорнавирусом. Cell Rep. (2012) 2: 1187–96. DOI: 10.1016 / j.celrep.2012.10.005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

133. Алексопулу Л., Холт А.С., Меджитов Р., Флавелл Р.А.Распознавание двухцепочечной РНК и активация NF-kappaB Toll-подобным рецептором 3. Nature . (2001) 413: 732–8. DOI: 10.1038 / 35099560

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

135. Martinez-Gil L, Goff PH, Hai R, Garcia-Sastre A, Shaw ML, Palese P. Полученный из вируса Сендай РНК-агонист RIG-I в качестве адъюванта вирусной вакцины. J Virol. (2013) 87: 1290–300. DOI: 10.1128 / JVI.02338-12

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

136.Xu J, Mercado-Lopez X, Grier JT, Kim WK, Chun LF, Irvine EB, et al. Идентификация мотива естественной вирусной РНК, который оптимизирует восприятие вирусной РНК с помощью RIG-I. МБио . (2015) 6: e01265–15. DOI: 10.1128 / mBio.01265-15

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

137. Caskey M, Lefebvre F, Filali-Mouhim A, Cameron MJ, Goulet JP, Haddad EK, et al. Синтетическая двухцепочечная РНК вызывает врожденные иммунные ответы, аналогичные живой вирусной вакцине у людей. J Exp Med .(2011) 208: 2357–66. DOI: 10.1084 / jem.20111171

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

140. Де Бекелар, Гроотен Дж., Де Кокер С. Интерфероны типа I модулируют иммунитет CD8 (+) Т-клеток к мРНК вакцинам. Trends Mol Med. (2017) 23: 216–26. DOI: 10.1016 / j.molmed.2017.01.006

CrossRef Полный текст | Google Scholar

144. Бланшар Э.Л., Лумис К.Х., Бхосле С.М., Вановер Д., Баумхоф П., Питард Б. и др. Анализы лигирования по близости для in situ обнаружения активации врожденного иммунитета: акцент на in vitro транскрибируемой мРНК. Мол тер нуклеиновых кислот . (2018) 14: 52–66. DOI: 10.1016 / j.omtn.2018.11.002

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

145. Лутц Дж., Лаззаро С., Хаббеддин М., Шмидт К.Э., Баумхоф П., Муй Б.Л. и др. Немодифицированная мРНК в LNP представляет собой конкурентную технологию для профилактических вакцин. Вакцины NPJ . (2017) 2:29. DOI: 10.1038 / s41541-017-0032-6

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

146. Пепини Т., Пуличино А.М., Карсилло Т., Карлсон А.Л., Сари-Сарраф Ф., Рамзауэр К. и др.Индукция IFN-опосредованного противовирусного ответа с помощью самоусиливающейся РНК-вакцины: значение для дизайна вакцины. Дж Иммунол . (2017) 198: 4012–24. DOI: 10.4049 / jimmunol.1601877

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

147. Sheehan KC, Lai KS, Dunn GP, ​​Bruce AT, Diamond MS, Heutel JD, et al. Блокирование моноклональных антител, специфичных к субъединице 1 мышиного IFN-альфа / бета-рецептора (IFNAR-1), от мышей, иммунизированных in vivo с помощью гидродинамической трансфекции . J Интерферон цитокин Res . (2006) 26: 804–19. DOI: 10.1089 / jir.2006.26.804

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

148. Авчи-Адали М., Беринг А., Стейнле Х., Келлер Т., Краевски С., Шленсак С., Вендель Х.П. In vitro синтез модифицированной мРНК для индукции экспрессии белка в клетках человека. Дж Vis Exp . (2014): e51943. DOI: 10.3791 / 51943

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

149.Карико К., Мурамацу Х., Валлийский Ф.А., Людвиг Дж., Като Х., Акира С. и др. Включение псевдоуридина в мРНК дает превосходный неиммуногенный вектор с повышенной трансляционной способностью и биологической стабильностью. Мол тер . (2008) 16: 1833–40. DOI: 10.1038 / мт.2008.200

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

150. Карико К., Мурамацу Х., Келлер Дж. М., Вайсман Д. Повышенный эритропоэз у мышей, которым вводили субмикрограммовые количества псевдоуридин-содержащей мРНК, кодирующей эритропоэтин. Mol Ther. (2012) 20: 948–53. DOI: 10.1038 / mt.2012.7

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

152. Zaba LC, Krueger JG, Lowes MA, Резидентные и «воспалительные» дендритные клетки в коже человека. J Invest Dermatol. (2009) 129: 302–8. DOI: 10.1038 / jid.2008.225

CrossRef Полный текст

153. Корманн М.С., Хазенпуш Г., Анежа М.К., Ника Г., Флеммер А.В., Гербер-Джонат С. и др. Экспрессия терапевтических белков после доставки химически модифицированной мРНК у мышей. Нат Биотехнология . (2011) 29: 154–7. DOI: 10.1038 / NBT.1733

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

154. Брус К., Ван дер Джойт К., Путтеманс Дж., Гойвертс С., Хейрман С., Девитт Х. и др. Опосредованная частицами внутривенная доставка мРНК антигена приводит к сильным антиген-специфическим Т-клеточным ответам, несмотря на индукцию интерферона I типа. Мол тер нуклеиновых кислот . (2016) 5: e326. DOI: 10.1038 / mtna.2016.38

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

155.Ковальчик А., Доенер Ф, Занцингер К., Нот Дж., Баумхоф П., Фотин-Млечек М. и др. Самоадъювантные мРНК-вакцины вызывают местные врожденные иммунные ответы, которые приводят к мощному и поддающемуся усилению адаптивному иммунитету. Вакцина . (2016) 34: 3882–93. DOI: 10.1016 / j.vaccine.2016.05.046

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

156. Лян Ф., Плокин А., Эрнандес Дж. Д., Фаустер-Бовендо Х., Линдгрен Дж., Стэнли Д. и др. Диссоциация скелетных мышц для проточной цитометрической характеристики иммунных клеток у макак. Дж. Иммунол Методы . (2015) 425: 69–78. DOI: 10.1016 / j.jim.2015.06.011

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

157. Routy JP, Boulassel MR, Yassine-Diab B, Nicolette C, Healey D, Jain R, et al. Иммунологическая активность и безопасность аутологичных дендритных клеток с электропорированной РНК ВИЧ у ВИЧ-1-инфицированных пациентов, получающих антиретровирусную терапию. Клин Иммунол . (2010) 134: 140–7. DOI: 10.1016 / j.clim.2009.09.009

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

158.Allard SD, De Keersmaecker B, de Goede AL, Verschuren EJ, Koetsveld J, Reedijk ML, et al. Испытание фазы I / IIa иммунотерапии ВИЧ-1-инфицированных пациентов с дендритными клетками, экспрессирующими Tat, Rev и Nef, с последующим прерыванием лечения. Clin Immunol. (2012) 142: 252–68. DOI: 10.1016 / j.clim.2011.10.010

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

159. Gandhi RT, Kwon DS, Macklin EA, Shopis JR, McLean AP, McBrine N, et al. Иммунизация ВИЧ-1-инфицированных аутологичных дендритных клеток, трансфицированных мРНК, кодирующей Gag и Nef ВИЧ-1: результаты рандомизированного плацебо-контролируемого клинического исследования. J Acquir Immune Defic Syndr. (2016) 71: 246–53. DOI: 10.1097 / QAI.0000000000000852

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

160. Ван Крененбрук А.Х., Смитс Э.Л., Ангуий С., Ван де Вельде А., Стейн Б., Брекман Т. и др. Индукция цитомегаловирус-специфических Т-клеточных ответов у здоровых добровольцев и реципиентов аллогенных стволовых клеток с использованием вакцинации дендритными клетками, трансфицированными матричной РНК. Трансплантация . (2015) 99: 120–7. DOI: 10.1097 / TP.0000000000000272

CrossRef Полный текст | Google Scholar

161. Кублер Х., Шил Б., Гнад-Фогт Ю., Миллер К., Шульце-Земанн В., Вом Дорп Ф. и др. Самоадъювантная вакцинация мРНК у пациентов с распространенным раком простаты: первое исследование фазы I / IIa с участием человека. J Иммунный рак . (2015) 3:26. DOI: 10.1186 / s40425-015-0068-y

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

164. Крейтер С., Селми А., Дикен М., Себастьян М., Остерло П., Шильд Н. и др.Повышение эффективности презентации антигена за счет связывания антигенов с сигналами трафика MHC класса I. Дж Иммунол . (2008) 180: 309–18.

PubMed Аннотация | Google Scholar

165. Trepotec Z, Aneja M, Geiger J, Hasenpusch G, Plank C, Rudolph C. Максимизация трансляционного выхода терапевтических мРНК за счет минимизации 5'-UTRs. Ткань Eng Часть A . (2018) 25: 69–79. DOI: 10.1089 / ten.TEA.2017.0485

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Расчеты нуклеиновых кислот и белков

Спектрофотометрические преобразования

Оптимизация кодонов OptimumGene

Для синтеза генов

Узнать больше

** Эта веб-страница содержит несколько полезных таблиц общих биологических констант и преобразований.К ним относятся метрические префиксы, спектрофотометрические преобразования, разрешение агарозного / полиакриламидного геля и т. Д. Вы можете использовать эти таблицы для помощи в количественном определении ДНК / РНК / белка, приготовлении геля для электрофореза, синтезе белка и других исследовательских мероприятиях.

Метрические префиксы

Приставка Условное обозначение Фактор
кг к 10 3
санти с 10 -2
милли м 10 -3
микро мк 10 -6
нано п 10 -9
пик п. 10 -12
фемто ф 10 -15
атто a 10 -18
zepto z 10 -21

Спектрофотометрические преобразования

1 A 260 единица двухцепочечной ДНК = 50 мкг / мл
1 A 260 единица одноцепочечной ДНК = 33 мкг / мл
1 A 260 единица одноцепочечной РНК = 40 мкг / мл

Молярные превращения ДНК

1 мкг ДНК длиной 1000 п.н.

1.52 пмоль (3,03 пмоль концов)
1 мкг ДНК pBR322

0,36 пмоль ДНК
1 пмоль ДНК длиной 1000 п.н.

0,66 мкг
1 пмоль ДНК pBR322

2,8 мкг
pBR322DNA: (4,361 п.н.)

Формулы для молярных превращений ДНК

Для дцДНК
Для преобразования пмоль в мкг:
пмоль × N × 660 пг / пмоль × 1 мкг / 10 6 пг = мкг
Для преобразования мкг в пмоль:
мкг × 10 6 пг / 1 мкг × пмоль / 660 пг × 1 / N = пмоль
Для оцДНК
Для преобразования пмоль в мкг:
пмоль × N × 330 пг / пмоль × 1 мкг / 10 6 пг = мкг
Для преобразования мкг в пмоль:
мкг × 10 6 пг / 1 мкг × пмоль / 330 пг × 1 / N = пмоль
где N - количество нуклеотидов, а 330 пг / пмоль - средняя молекулярная масса нуклеотида

Молярные превращения белков

100 пмоль белка 100 кДа

=

10 мкг
100 пмоль белка 50 кДа

=

5 мкг
100 пмоль белка 10 кДа

=

1 мкг
100 пмоль белка 1 кДа

=

100 нг

Конверсии белка / ДНК

1 т.п.н. ДНК

333 аминокислоты

Белок 37 кДа
270 b ДНК

Белок 10 кДа
810 б ДНК

Белок 30 кДа
1.35 т.п.н. ДНК

Белок 50 кДа
2,7 т.п.н. ДНК

Белок 100 кДа
средний молекулярный вес аминокислоты

110 дальтон
Дальтон (Да) - альтернативное название атомной единицы массы, а килодальтон (кДа) равен 1000 дальтон. Таким образом, белок с массой 64 кДа имеет молекулярную массу 64000 граммов на моль

Агарозный гель (%): разрешение линейной ДНК

Рекомендуемая% агароза Оптимальное разрешение для линейной ДНК
(размер фрагментов в нуклеотидах; п.н.)
0.5 1 000–30 000
0,7 800–12 000
1,0 500–10 000
1,2 400–7000
1,5 200–3 000
2,0 ​​ 50–2000

Полиакриламидный гель (%): разрешение белка

Рекомендуемый% Акриламид Диапазон размеров белка
8 40-200 кДа
10 21-100 кДа
12 10-40 кДа

Длина / м.W. Общих нуклеиновых кислот.

Нуклеиновая кислота Количество нуклеотидов Молекулярный вес
лямбда ДНК 48 502 (дцДНК) 3,2 × 10 7
pBR322DNA 4361 (дцДНК) 2,8 × 10 6
28S рРНК 4800 1,6 × 10 6
23S рРНК (E.coli) 2 900 1.0 × 10 6
18S рРНК 1 900 6,5 × 10 5
16S рРНК (E.coli) 1,500 5,1 × 10 5
5S рРНК (E.coli) 120 4,1 × 10 4
тРНК (E.coli) 75 2,5 × 10 4
* Молекулярные массы основаны на фактической последовательности.

Стандарты

1.Средняя молекулярная масса пары оснований дцДНК = 600.
2. Средняя молекулярная масса основания оцДНК = 330.
3. Средняя молекулярная масса основания РНК = 340.
.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *