Раздробленность на руси карта: Политическая раздробленность Руси – причины начала периода, план на карте (история 6 класс)

Республика Коми является крупнейшим источником выгоревших лесов в регионе, составляя почти 50% от общего количества выгоревших лесов с 1990 по 2005 год. Самое крупное пожарное событие за анализируемый временной интервал произошло в 2000 году, когда произошло крупномасштабное пожаротушение. неконтролируемые пожары распространились по северной части республики. Расширение пожаров в течение последнего года оценки 1990–2000 годов и отправная точка анализа 2000–2005 годов усложнили правильное картирование года пожара. Хотя большинство пожаров было правильно нанесено на карту как часть набора данных за период 1990–2000 годов, разница в чувствительности модели к обнаружению выгоревшей площади привела к тому, что некоторая часть выгоревшей площади была отображена как изменение в течение временного интервала 2000–2005 годов. Еще одним фактором, способствующим этой неопределенности, является большее количество доступных безоблачных изображений Landsat за 2001 год по сравнению с 2000 годом, что может вызвать задержку в один год для обнаружения изменений. Эти неопределенности могут быть причиной завышенной оценки изменений, обнаруженных в период 2000–2005 годов для Коми.

Смещение в 2000–2005 гг. Распределения гари из северной части региона в центральную связано с сезоном экстремальных пожаров 2002 г., когда суровые засушливые условия и антропогенные пожары привели к значительной потере лесного покрова в центральных регионах. Европейской России. Большинство лесных пожаров возникли и распространились на обширных территориях торфяных болот и сосновых лесов на торфяных почвах в Московской, Владимирской, Тверской, Нижегородской и Псковской областях. Большая часть этих водно-болотных угодий была осушена и использовалась для добычи торфа в течение 20 века.В конце лета 2002 г. засушливые погодные условия в сочетании с широким использованием огня для управления пастбищами возле населенных пунктов на торфяных почвах вызвали распространение пожара на окружающие леса [31]. По официальным данным, площадь выгоревших лесов в Московской области за 2002 г. была примерно в 10 раз выше, чем среднегодовая площадь выгоревших лесов с 1992 по 2005 г. [30].

4.3. Лесовосстановление и облесение

Мы полагаем, что основными факторами прироста валового лесного покрова являются возобновление лесного покрова на сплошных вырубках и выгоревших территориях, за которым следует рост деревьев на заброшенных сельскохозяйственных землях в южной части Европейского Севера России.Вырубленные и выгоревшие лесные площади в России часто оставляются для естественного лесовосстановления, однако в некоторых случаях восстановление леса может быть поддержано посадкой деревьев или посевом. Официальная статистика документирует ежегодные площади лесовосстановления за период 2000–2005 гг. [1]. Однако эти данные не отражают фактического возобновления лесного покрова, что делает данные о приросте лесного покрова несовместимыми с нашими выводами.

Из общего прироста лесного покрова, обнаруженного за период 2000–2005 годов, 39% произошло на территориях, вырубленных с 1990 года.Эти районы представляют собой естественное лесовосстановление или успешную посадку леса. В целом, доля вырубок леса, вырубленных в 1990–2000 годах, вырубленных к 2005 году (рис. 5 (d)), составляет коэффициент восстановления лесов. Наиболее высокие темпы восстановления лесов отмечены в южной части региона с наиболее благоприятными климатическими условиями для быстрого роста деревьев; лесовозобновление в северной части территории было медленным. Помимо этой общей тенденции, некоторые регионы имеют низкие показатели валового прироста лесного покрова, в том числе Ленинград, Москва и Владимир.Мы полагаем, что вырубка лесного покрова в этих регионах может быть следствием роста городов и развития инфраструктуры, динамики, при которой лесной покров навсегда превратился в нелесные типы почвенного покрова.

Остающийся 61% прироста лесного покрова был обнаружен на вырубленных или выгоревших площадях, расчищенных до 1990 года, или в виде посадки деревьев на заброшенные сельскохозяйственные земли. Оставление сельскохозяйственных земель и последующее расширение лесов было широко распространено в период перехода от плановой экономики к рыночной в бывших советских республиках [32, 33].Оставление земель в 1992–1997 гг., В первые годы после распада Советского Союза, было наиболее интенсивным заквашением крупных неуправляемых земельных участков, подлежащих естественному лесовосстановлению. Площадь пахотных земель для выбранных 20 регионов в 2005 г. составляла лишь 60% от общей площади пахотных земель, управляемых в 1990 г., что свидетельствует об этом широкомасштабном заброшении [1]. Почти половина заброшенных земель приходилась на четыре области: Кировскую, Тверскую, Нижегородскую и Пермскую. Наиболее высокие показатели заброшенности земель, согласно официальной статистике, наблюдались в западной части области (Новгород, Псков, Тверь), где прекращено управление более чем половиной бывших сельскохозяйственных земель. Эти регионы представляют собой интенсивную деградацию советской сельскохозяйственной системы, где ограниченные государственные субсидии и низкая урожайность сельскохозяйственных культур привели к массовому заброшению земель. Восстановление лесов на бывших сельскохозяйственных землях не включается в официальную статистику площади лесного покрова. Облесение бывших сельскохозяйственных земель может иметь серьезные последствия для региональных углеродных бюджетов и должно быть включено в мониторинг европейского лесного покрова [32].

Картирование прироста лесного покрова в течение анализируемого 5-летнего интервала в бореальных и полубореальных регионах является сложной задачей из-за медленного восстановления лесного покрова.В то время как густые молодые леса могут вырасти в течение 5-летнего интервала в южной части европейской части России, для восстановления северных бореальных древостоев требуется больше времени. Более того, переход от молодых открытых древостоев, классифицированных как нелесные в 2000 г. , к закрытым в 2005 г. в северной тайге не мог быть правильно визуально интерпретирован с использованием данных Landsat среднего разрешения. Подход к картированию прироста лесного покрова показан здесь только в качестве прототипа, который был бы возможен в более длительных (например, 10-летних) интервалах при наличии адекватных обучающих данных по изменению лесного покрова.

5. Заключение

Независимый спутниковый мониторинг бореальных лесов является важным инструментом для предоставления прозрачной информации об изменении лесного покрова. Правительственные чиновники, землеустроители, исследователи, защитники природы и группы гражданского общества могут использовать такую ​​информацию для принятия более информированных решений относительно управления бореальными экосистемами. Наши результаты, отображающие изменение лесного покрова в обширном лесном регионе Европейского Севера России за 15 лет, показывают, что такой анализ может быть выполнен с использованием свободно доступных данных Landsat и автоматизированного подхода к обработке изображений. Продолжение такого анализа, его распространение на остальную часть страны и публикация результатов картирования станет значительным шагом на пути к созданию прозрачной системы для независимого мониторинга лесного покрова в национальном масштабе. Авторы предполагают, что анализ будет расширен, чтобы охватить весь панбореальный биом, а также интервал 2000–2010 гг.

Экспертный мониторинг лесного покрова с использованием исторических данных Landsat — хорошо разработанный подход, его точность для обнаружения лесного покрова и изменений находится в диапазоне от 75% до 91% [34, 35].Этот высокий уровень точности подтвержден нашей картой лесного покрова 2000 г. (общая точность 89%) и продуктом мониторинга потери лесного покрова 2000–2005 гг. (Общая точность 98%) [15]. Используемые для нашего анализа данные мониторинга лесного покрова за 1990–2000 гг. Были перепроверены различными региональными экспертами и, как полагают, имеют одинаковую точность. Два основных фактора препятствовали валидации анализа исторических тенденций изменения лесного покрова в Европейской части России. Во-первых, мелкомасштабные карты оценки лесов конца советской эпохи и десятилетия сразу после распада СССР не являются общедоступными.Во-вторых, коммерческие спутниковые данные с высоким пространственным разрешением, часто используемые для проверки оценок площадей, полученных с помощью Landsat, недоступны до 2000 года. Проанализированные наборы данных об изменении лесного покрова, такие как продукт 1990–2000 годов, даже если они не были тщательно проверены, являются единственными общедоступные, пространственно согласованные и общерегиональные изображения изменений лесного покрова, что делает их бесценным источником данных для изучения динамики лесов. Возможным источником независимо собранных данных проверки является Обследование дистанционного зондирования ЮНФАО, основанная на выборке оценка глобальных изменений в землепользовании лесов в 1990–2005 годах, основанная на изображениях Landsat [36].Эти образцы данных, когда они станут общедоступными, могут быть использованы для проверки нашего продукта для непрерывного производства.

Анализ валовой потери лесного покрова в период 1990–2005 годов выявил несколько тенденций в изменении лесного покрова после распада плановой экономики. Наши результаты показали, что в то время как общая площадь лесозаготовок в регионе уменьшилась, вырубки и другие формы антропогенных вырубок увеличились в центральной и западной частях региона. Наиболее густонаселенные регионы Европейской части России (Ленинград и Москва) показали самые высокие темпы потери лесного покрова.Истощение лесного покрова вокруг крупных промышленных городов следует выделить как наиболее серьезную проблему, стоящую перед нынешним лесопользованием в европейской части России. Наши результаты также выявили интенсивную потерю валового лесного покрова из-за вырубки леса вблизи российско-финляндской границы (Ленинград и Карелия). Площадь лесов, пострадавших от пожаров, за анализируемый промежуток времени увеличилась почти вдвое. Увеличение площади возгорания является следствием нескольких факторов, в том числе распространения экстремальных пожаров и, возможно, ухудшения работы противопожарной службы. Последний фактор был еще раз подтвержден во время чрезвычайного пожара в 2010 году. Наши результаты мониторинга прироста лесного покрова показали, что посягательство древесного покрова на заброшенные сельскохозяйственные угодья является широко распространенным процессом в регионе и его следует определять количественно путем более точной оценки. анализ. Все такие тенденции могут быть полностью или частично подтверждены официальной статистикой лесов и сельского хозяйства. Наш анализ дополнил официальную статистику, предоставив независимо полученные пространственные данные, которые можно было бы использовать для оценки текущих тенденций и служить в качестве основы для будущего мониторинга лесного покрова.

Наше исследование отразило только количественные изменения лесного покрова, то есть изменение общей площади лесов. Другие эффекты лесоуправления, такие как антропогенная фрагментация ландшафта и изменение породного состава деревьев, не анализировались. Однако мы предполагаем, что представленный подход к крупномасштабному картированию лесов на основе спутника Landsat и анализу изменений может быть использован для количественной оценки большинства этих эффектов в дальнейших исследованиях.

(PDF) Фрагментация и утрата постсоветских лесов в зеленом поясе вокруг Москвы, Россия (1991–2001 гг.): Перспективы дистанционного зондирования

220 J.П. Боэнтье, М.С. Блинников / Ландшафт и градостроительство 82 (2007) 208–221

Настоящим открытием стало то, что в период с 1991 по 2001 гг., Большая часть из

, изменение ландшафта было не фрагментацией больших пригородных

лесопарков, а исчезновением самых маленьких. группы из

деревьев вдоль основных автомагистралей и вблизи жилых районов и

деревьев вдоль окраин парков. Онлайн-описания новых подразделений

и наблюдения на местности в Москве помогли подтвердить этот вывод

.

Результаты обнаружения изменений определили, что 31 729 га из

спелых лесов было потеряно в течение 10 лет на исследуемой территории

(3100 га в год), если не учитывать повторного роста. Официальные данные

из Отчета о состоянии окружающей среды Московской области

в 2002–2003 гг. , Однако, предполагают, что только около 6500 га леса

было потеряно за 1 год для всей Московской области на основе

собственных по наземному мониторингу (Отчет о состоянии окружающей среды

, 2002).Наши результаты показывают, что около половины этого количества

леса было потеряно только на нашей исследуемой территории, что составляет всего

, около 8,9% площади провинции, за тот же период времени. Этот

демонстрирует потребность в более широком мониторинге дистанционного зондирования в будущем

, потому что официальные отчеты, вероятно, занижают фактические потери

.

Большая часть застройки в период с 1991 по 2001 год

происходила на открытых участках или вдоль опушек леса.Развитие

вторгалось по опушкам леса, но еще не врезалось в основные участки леса

. Хотя это означает, что на данный момент

наиболее ценных спелых лесов были сохранены, развитие

продолжается, а доступные открытые земли сокращаются.

Дополнительная точность в будущем обнаружении утраты лесов из-за разрастания

может быть достигнута за счет использования изображений с более высоким разрешением,

, включая продукты Digital Globe и Space Imaging, использования разновременных изображений

для охвата большего количества дат и использования более высоких

количество классов земного покрова с нечеткой логикой или искусственной нейронной сетью

сетевых подходов.Однако даже с помощью простой контролируемой классификации

в этом исследовании можно было многое узнать о количестве

и структуре исчезновения деревьев в окрестностях Москвы в

за десятилетний период.

Благодарности

Авторы выражают благодарность Аспасии Ригополу-Мельчер, Бен-

Джамину Ричасону, Дэвиду Уоллу и двум анонимным рецензентам за

комментариев к более ранней версии этой рукописи. Наше исследование

было поддержано финансированием исследований студентов ГГНУ Джону Боен-

и грантом на повышение квалификации Михаила Блинникова.

Список литературы

Батер, Дж. Х., 1994. Приватизация в Москве. Геогр. Ред. 84 (2), 201–215.

Блинников М.С., Шанин А., Соболев Н., Волкова Л., 2006. Закрытые поселки

Зеленого пояса Москвы: сегрегированные ландшафты и пригород

Окружающая среда России. Гео. J. 66 (1–2), 65–81.

Бривио, П.А., Зилиоли, Э., 2001. Характеристика городской структуры с помощью геостатиса.

Тический анализ спутниковых изображений. В: Донней, Дж.-П., Барнсли, М.Г., Лонгли,

П.А. (Ред.), Дистанционное зондирование и городской анализ. Taylor and Francis, Lon-

don, pp. 39–53, GISDATA 9.

Brown, DG, Duh, J., Drzyzga, SA, 2000. Оценка ошибки при анализе изменения фрагментации прогнозного

est с использованием Характеристика ландшафта Северной Америки

(NALC). Remote Sens. Environ. 71 (1), 106–117.

Коэн, В.Б., Фиорелла, М., Грей, Дж., Хелмер, Э., Андерсон, К., 1998. Эффективный

и точный метод картирования сплошных вырубок на тихоокеанском севере —

запад с использованием снимков Landsat . Photogr. Англ. Remote Sens. 64 (4), 293–

300.

Croissant, C., Munroe, D., 2002. Зонирование и фрагментация сельскохозяйственных и

лесных земель на жилых участках в графстве Монро. Индиана. Геогр. Res.

Forum 22, 91–109.

Дэниэлсон, У.Р., ДеГрааф, Р.М., Фуллер, Т.К., 1997. Сельские и пригородные леса

опушки: влияние на хищников яиц и уровень хищничества в гнездах. Landsc. Городской план.

38, 25–36.

Донней, Дж.-П., Барнсли, М.Дж., Лонгли, П.А. (Eds.), 2001. Дистанционное зондирование и городской анализ

. Тейлор и Фрэнсис, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк.

Элки П., Ремпель Р., Карр А., 1999. Руководство пользователя Patch Analyst. Онтарио

Министерство природных ресурсов, науки и технологий Северо-Запада TM-002.

Тандер-Бей, Онтарио.

Эмч, М., Куинн, Дж. У., Петерсон, М., Александер, М., 2005. Изменение лесного покрова

в районе Толедо, Белиз, с 1975 по 1999: подход дистанционного зондирования.

Проф. Геогр. 57 (2), 256–267.

Эр, К.Б.Х., Иннес, Дж. Л., Мартин, К., Клинкенберг, Б., 2005. Исчезновение лесов с урбанизацией

предсказывает исчезновение птиц в Ванкувере. Биол. Консерв. 126,

410–419.

Эссен, П.А., Ренхорн, К.Е., 1998. Краевые эффекты на эпифитный лишайник во фрагментированных

лесах. Консерв. Биол. 12, 1307–1317.

Форман Р.Т.Т., 1995. Мозаика земли: экология ландшафтов и регионов.

University Press, Кембридж, Массачусетс.

Лесной кодекс Российской Федерации, 2005. 22-ФЗ. http://www.garweb.ru/

project / law / doc / 10033088 / 10033088-001.htm. 21 июня 2006 г.

Frohn, R.C., 2006. Использование метрик ландшафта в классификации изображений

дистанционного зондирования. Intl. J. Remote Sens. 27, 2025–2032.

Frohn, R.C., Arellano-Neri, O., 2005. Улучшение искусственных нейронных сетей с использованием анализа текстур

и деревьев решений для классификации земного покрова. GISci.

Remote Sens. 42 (1), 44–65.

Госкомостат, 1999. Регионы России. Государственный комитет Российской Федерации по статистике

Федерация (2 т.). Государственный комитет статистики, Москва.

Гухман С., 2001. «Москва не сразу строилась …» Государственный отчет о состоянии окружающей среды Москвы

, 1999 г. Энергия 4, 46–49. http://www.courier.com.

ru / energy / en0401guhman.htm. 26 июня 2006 г.

Хансен, М.Дж., Франклин, С.Е., Воудсма, К.Г., Петерсон, М., 2001. Caribou habi-

tat-картографирование и анализ фрагментации с использованием данных Landsat MSS, TM и GIS

в горах Северной Колумбии, Британская Колумбия. Может. Remote Sens.

Окружающая среда. 77, 50–65.

Хеленяк Т., 2003. Перепись 2002 года в России: предварительные итоги. Евразийская

Геогр. Экон. 44, 430–442.

Хоббс, Э.Р., 1988. Видовое богатство участков городских лесов и их значение

для разнообразия городского ландшафта. Landsc. Ecol.1, 141–152.

Honnay, O., Endels, P., Vereecken, H., Hermy, M., 1999. Роль участка

и разнообразия местообитаний в объяснении богатства местных видов растений в пригородных лесах. северная Бельгия. Разнообразие Distrib. 5,

129–141.

Иоффе Г., Нефедова Т., 2001. Изменение землепользования в Подмосковье. Площадь

33 (3), 273–286.

IRN Consulting, 2005. Индикаторы рынка недвижимости Консультационный отчет.

http://www.irn.ru. 1 марта 2005 г.

Айер С.Д., 2003. Возрастающая неравномерность распределения размеров городов в постсоветской России

. Евразийский Геог. Экон. 44 (5), 348–367.

Дженсен, Дж. Р., 1996. Введение в цифровую обработку изображений: дистанционное зондирование

Перспектива. Пирсон Прентис-Холл, Верхняя Сэдл-Ривер, штат Нью-Джерси.

Джи, В., Ма, Дж., Твибелл, Р.В., Андерхилл, К., 2006. Характеристика разрастания городов

с использованием многоступенчатых изображений дистанционного зондирования и показателей ландшафта. Комп.

Окружающая среда. Городская сист. 30, 861–879.

Kasanko, M., Barredo, J.I., Lavalle, C., McCormick, N., Demicheli, L., Sagris,

V., Brezger, A., 2006. Разделяются ли европейские города? Сравнительный анализ 15 европейских городских территорий. Landsc. Городской план. 77,

111–130.

Корнилов, С., 2002. Лесозащитная полоса нуждается в охране. Московская правда,

30 октября 2002 г.

Купфер Дж., 2006.Национальные оценки фрагментации лесов в США. Глобальный

Окружающая среда. Изменить 16, 73–82.

Земельный кодекс Российской Федерации, 2001. 136-ФЗ. http: //www.garweb.

ru / project / law / doc / 12024624 / 12024624-001.htm. 21 июня 2006 г.

Настройка фрагментации и чередования каналов | Junos OS

Как и на любом другом интерфейсе, приоритетное планирование на многоканальный пакет определяет порядок, в котором выходной интерфейс передает трафик из очереди вывода.Очереди обслуживаются в взвешенная круговая мода. Но когда очередь, содержащая большой пакеты начинают использовать многоканальный пучок, маленькие и чувствительные к задержкам пакеты должны ждать своей очереди для передачи. Из-за этой задержки некоторые медленные ссылки, такие как T1 и E1, могут стать бесполезными для чувствительных к задержке движение.

Link fragmentation and interleaving (LFI) решает эту проблему. Уменьшает задержку и джиттер на линках путем фрагментации больших пакетов и чередования чувствительных к задержке пакетов в результате пакеты меньшего размера для одновременной передачи через несколько ссылок многоканального пакета.

На рисунке 1 показано, как LFI работает. На этом рисунке для устройства R0 и устройства R1 включен LFI. Когда устройство R0 принимает большие и маленькие пакеты, такие как данные и голос пакеты, он делит их на две категории. Все голосовые пакеты и любые другие пакеты, настроенные для обработки как голосовые пакеты, классифицируются как пакеты LFI и передаются без фрагментации или заголовка MLPPP. Если в пакете настроен CRTP, пакеты LFI передаются через Обработка CRTP. Оставшиеся не-LFI (данные) пакеты могут быть фрагментированы. или нефрагментированный на основе настроенного порога фрагментации.В пакеты, размер которых превышает порог фрагментации, фрагментируются. An Заголовок MLPPP (содержащий многоканальный порядковый номер) добавляется к все пакеты, не относящиеся к LFI, фрагментированные и нефрагментированные.

Фрагментация выполняется по фрагментации. порог, который вы настраиваете. Например, если вы настраиваете фрагментацию порог 128 байт, все пакеты размером более 128 байт фрагментируются. Когда устройство R1 получает пакеты, оно отправляет нефрагментированные голосовые пакеты немедленно, но буферизует фрагменты пакета до тех пор, пока получает последний фрагмент пакета.В этом примере, когда устройство R1 принимает фрагмент 5, собирает фрагменты и передает весь пакет.

Нефрагментированные пакеты данных обрабатываются как один фрагмент. Таким образом, устройство R1 не буферизует нефрагментированные пакеты данных. и передает их по мере их получения.

Чтобы настроить LFI, вы определяете тип инкапсуляции MLPPP и включить фрагментацию и чередование пакетов, указав порог фрагментации и карты фрагментации, без фрагментации ручка сопоставлена ​​с выбранным классом пересылки.

границ | Полезность паттернов фрагментации вкДНК при создании профильных панелей для жидкой биопсии для повышения их чувствительности

Введение

В подходе, известном как «жидкая биопсия», бесклеточная ДНК (вкДНК), которая циркулирует в плазме, может использоваться для диагностического обнаружения опухолеспецифических мутаций (Dawson et al., 2013; Pupilli et al., 2013; Xi et al., 2016). В рамках парадигмы лабораторных тестов (LDT) анализ вкДНК уже получил одобрение по ряду общих показаний, включая обнаружение мутации устойчивости T790M в гене, кодирующем EGFR (Malapelle et al., 2016), который обычно возникает при аденокарциномах легких, леченных ингибиторами тирозинкиназы.

Вначале LDT на основе вкДНК обычно использовали тот или иной традиционный метод анализа ДНК, включая ПЦР в реальном времени, цифровую ПЦР в каплях и шарики, эмульсии, амплификацию и цифровую ПЦР с помощью магнетизма (BEAM) (Dawson et al., 2013 ; Oxnard et al., 2014; Siravegna et al., 2015; Thress et al., 2015; Sacher et al., 2016). Многие исследования показали, что соответствие жидкостной биопсии и анализа тканей относительно высокое; тем не менее, эти подходы не лишены ограничений.Обычно методы профилирования вкДНК на основе ПЦР и гибридизации разрабатываются для обнаружения конкретных вариантов ДНК, которые чаще всего лежат в основе того или иного ранее описанного патофизиологического процесса. Эти и другие методы, специфичные для вариантов, не подходят для исследовательского анализа вкДНК, который необходим для получения знаний о нетрадиционных, возникающих путях резистентности, для совместного выявления фенотипа репарации несоответствия и для назначения не по назначению противоопухолевые препараты, обычно необходимые для индивидуального лечения метастатических опухолей (Tafe et al. , 2015; Wei et al., 2016; Зехир и др., 2017). Эти ограничения легко преодолеваются появлением технологий на основе секвенирования, в том числе секвенирования всего экзома или, что более применимо к анализу вкДНК, панелей на основе ампликонов, которые ограничены их генами-мишенями, но все еще допускают исследования.

С зарегистрированной чувствительностью и специфичностью более 80% и от 98 до 100%, соответственно (Krishnamurthy et al., 2017), секвенирование следующего поколения (NGS) анализ вкДНК уже вошло в ряды широко используемых ЛДЦ.Тем не менее, необходимо дальнейшее улучшение чувствительности тестов на основе жидкой биопсии. Наиболее распространенный способ повысить чувствительность обнаружения мутаций в образцах жидкой биопсии — увеличить охват, что, в свою очередь, приводит к значительному увеличению стоимости анализа. Глубокий или сверхглубокий охват необходим для того, чтобы учесть низкие концентрации общей вкДНК в образцах плазмы, которые усугубляются разбавлением опухолеспецифических фрагментов вкДНК значительными количествами неопухолевых фрагментов вкДНК (Hellwig et al. , 2018).

Другая физическая характеристика вкДНК, распределение размеров ее фрагментов, имеет отношение к обнаружению вариантов ДНК как с помощью секвенирования, так и с помощью ПЦР. Недавние исследования cfDNA методом полногеномного секвенирования (WGS) продемонстрировали, что распределение размеров фрагментов ДНК, полученных из плазмы, далеко от типичного логнормального распределения, которое отражает формирование паттерна ДНК в образцах, фиксированных формалином и залитых парафином, или быстро замороженных тканях. Фактически, вкДНК демонстрирует преобладающий пик при длине фрагмента ~ 167 п.н., сопровождаемый вторым, значительно менее выраженным экстремумом около 350 п.н. (Ma et al., 2017). Эти наблюдения означают, что большинство этих фрагментов подходят для оценки техники, основанной на обычных длинах ампликонов ПЦР. Примечательно, что фрагменты вкДНК опухолевого происхождения даже короче, чем фрагменты, происходящие из здоровых клеток того же происхождения (Jiang et al., 2015). В области обычных систем для обнаружения вариантов ДНК эти характеристики вкДНК побудили к разработке ультракороткой ампликонной ПЦР, которая позволяет существенно повысить аналитическую и, как следствие, диагностическую чувствительность этих анализов.

Более того, недавние исследования показали, что картина фрагментации вкДНК не случайна. Поскольку деградация вкДНК определяется нуклеосомными паттернами, определяемыми эпигенетической регуляцией в определенных локусах (Иванов и др., 2015), повторяющаяся недопредставленность некоторых регионов в вкДНК вносит систематическую ошибку в обогащение целевых ампликонов на основе ПЦР и снижает чувствительность в локальном масштабе. .

В этом исследовании мы исследовали влияние длины ампликона на диагностическую и аналитическую чувствительность обнаружения мутаций, используя две панели NGS на основе ампликонов с различной длиной ампликонов.Мы также описываем способы использования знаний о паттернах фрагментации вкДНК для повышения чувствительности обнаружения мутаций в условиях жидкой биопсии.

Материалы и методы

Сбор проб

Секвенирование проводилось на фрагментах вкДНК, выделенных из ранее собранных образцов плазмы 13 пациентов с немелкоклеточным раком легкого (НМРЛ), пролеченных в Российском онкологическом научном центре им. Блохина в 2014–2015 годах. Для каждого пациента выявлена ​​мутация EGFR на основе опухолевой ткани. Состояние оценивали с помощью набора для ПЦР therascreen EGFR RGQ (Qiagen, Милан, Италия) в соответствии с протоколом производителя.

Для анализа паттерна фрагментации вкДНК под контролем нуклеосом мы использовали общедоступные анонимные данные WGS для вкДНК, описанные Snyder et al. (2016) и включены в набор данных [PRJNA2

].

Настоящее исследование было одобрено Внутренним контрольным советом Atlas Biomed. Все субъекты дали письменное информированное согласие в соответствии с Хельсинкской декларацией.

Экстракция ДНК и контроль качества образцов

Для каждого пациента с НМРЛ образец периферической крови собирали в содержащую ЭДТА пробирку Vacutainer (BD).Образцы фракционировали на плазму и клетки крови центрифугированием при 400 g в течение 15 минут в течение 4 часов после венепункции с последующим вторичным вращением при 1200 g в течение 20 минут. Полученные образцы плазмы замораживали в аликвотах и ​​хранили при -80 ° C до выделения ДНК. Циркулирующую ДНК экстрагировали из 4 мл плазмы с помощью набора для выделения ДНК из плазмы крови (BioSilica Ltd., Россия) в соответствии с инструкциями производителя, элюируя 120 мкл воды, свободной от нуклеаз, смешанной с 3 мкл гликогена (20 мг / мл. , Fermentas, Литва), 1/10 объема 50 мМ триэтиламина и затем осаждали 5 объемами ацетона (Bryzgunova et al., 2011). После восстановления в 30–50 мкл воды концентрацию вкДНК измеряли с помощью флуорометра Qubit.

Подготовка библиотеки и контроль качества

получали в соответствии с протоколом производителя для панели Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel (ITCHP2), разработанной для амплификации 207 целевых областей в 50 генах, связанных с раком. Кроме того, настраиваемая панель, а именно Клиническая панель Атласа (AODCP), была разработана для охвата следующих генов: EGFR, IDh3, NRAS, KIT, BRAF, TP53, PDGFRA, PTEN, IDh2, KRAS, PIK3CA, ERBB2, CTNNB1 (AODCP, 55 целевые регионы).Пользовательская панель была разработана с использованием сервера Ion AmpliSeq Designer (версия конвейера 5.2). У этих двух панелей было несколько общих локусов, что позволяло их сравнивать.

Секвенирование и анализ данных

Объединенные библиотеки секвенировали с использованием Ion Torrent PGM в соответствии с протоколом производителя. Поскольку ожидались низкочастотные мутантные аллели, первоначальный анализ был выполнен с использованием программного обеспечения Ion Torrent Suite (версия 5.2.0) с настройками низкой строгости. Чтобы исключить ложноотрицательные вызовы однонуклеотидных вариантов (SNV), был проведен сопутствующий конвейерный анализ Bowtie2-Strelka.После сопоставления всех считываний с геномом (GRCh47) (параметры Bowtie2: –rdg 5,2 –rfg 5,2 -N 1 -L 17) дальнейшие нецелевые чтения были удалены, в то время как оставшиеся чтения были повторно сопоставлены с целевыми последовательностями. Последовательности праймеров были исключены из считываний с использованием собственного программного обеспечения (Иванов и др., 2018). Вызов соматического варианта выполнялся с использованием Strelka (maxInputDepth установлен на -1; indelMaxRefRepeat установлен на 6; indelMaxWindowFilteredBasecallFrac установлен на 0.4; indelMaxIntHpolLength установлен на 6; нижняя граница качества для SNV и отступов установлена ​​на 9 и 2 соответственно).Варианты, поддерживающие менее 20 операций чтения, были отброшены. Если менее четырех считываний подтверждали альтернативный аллель, вариант не учитывался. Горячие точки мутаций были определены как нуклеотидные вариации, идентифицированные в десяти или более образцах COSMIC (Forbes et al., 2010). Обнаруженные варианты, расположенные в горячих точках мутации, должны были с уверенностью быть соматическими. Варианты за пределами горячих точек мутаций с частотой минорных аллелей в общей популяции, как определено Проектом 1000 Genomes (Консорциум проекта 1000 Genomes et al., 2015), 5% и более должны были уверенно составлять зародышевую линию. Дальнейший анализ ограничивался достоверно соматическими вариантами и вариантами зародышевой линии. Предварительно обработанные файлы fastq были дополнительно проверены на наличие горячих точек мутаций путем ввода данных дикого типа и ожидаемых мутантных считываний в статистическую модель распределения Пуассона с зависящей от сложности вероятностью ожидания переменной для SNV и отступов. Вызовы соматических вариантов проверялись вручную, в инструменте визуализации выравнивания считывания планшета (версия 1.16.09.06) (Milne et al., 2010). Частоты вариативных аллелей количественно оценивали в необработанных наборах считываний как отношение считываний, подтверждающих мутацию, к общему количеству квалифицированных считываний, охватывающих сайт мутации. Нормализацию частот мутационных аллелей до покрытия ампликонов выполняли бутстреппингом. Если не указано иное, анализ вариации генома ограничивался нуклеотидными изменениями, влияющими на последовательность белка. Использовались общедоступные версии программного обеспечения и баз данных: Bowtie2 v. 2.1.0 (Langmead and Salzberg, 2012), Strelka v.1.0.14 (Saunders et al., 2012) и SAMtools v. 0.1.19 (Li, 2011). Базы данных COSMIC и dbSNP были оценены в декабре 2017 года.

для анализа линейной регрессии была выполнена с использованием простой корректировки в соответствии с уравнением = r _i ^m / m _GC , где r _i обозначает счетчик считывания i. -й ампликон, m _GC — это среднее число считываний всех окон с таким же содержанием GC, что и ампликон i -го, а m — это общая медиана всех ампликонов.Отклонение охвата от среднего было выполнено для 5% полос содержания GC, а не для процентных значений 0, 1, 2, 3,…, 100%. Анализ линейной регрессии проводился с использованием простой аппроксимации методом наименьших квадратов.

, управляемые нуклеосомами, были проанализированы в общедоступных последовательностях, полученных из образцов плазмы, собранных у неизвестного количества здоровых людей (GSM1833219). Подробности выделения ДНК, подготовки библиотеки и секвенирования представлены в Snyder et al.(2016). Вкратце, библиотеки вкДНК подвергали секвенированию по парным концам с помощью технологии синтеза последовательности Illumina, генерируя чтения размером 101 п.н. Важно отметить, что на стадии подготовки библиотеки образцы ДНК плазмы не подвергались фрагментации под действием ультразвука, и, таким образом, исходные молекулы вкДНК были сохранены, что дало возможность исследовать характер ее фрагментации. Последовательности считывания fastq были сопоставлены с геномом человека (вышеупомянутая контрольная сборка) с помощью BWA-mem v. 0.7.12 (Li and Durbin, 2009).Длина фрагмента вкДНК может превышать длину чтения при секвенировании, однако секвенирование с парным концом позволяет фиксировать как начальные, так и конечные положения фрагмента. Таким образом, парные чтения продолжали представлять фрагменты WGS. Строгость положения нуклеосом рассчитывалась по существу, как описано у Valouev et al., С использованием программного обеспечения NuMap со стандартными параметрами. NuMap выполняет картирование нуклеосом на основе подсчета сглаженных считываний ядра (Valouev et al., 2011).

Для панельных ампликонов ITCHP2 и AODCP было получено количество фрагментов in silico после сопоставления обоих праймеров с фрагментом, амплифицированным и секвенированным экспериментально.Чтобы понять закономерности покрытия ампликона экспериментально наблюдаемыми фрагментами, фрагменты были сгенерированы с использованием парных считываний, а затем дополнительно отфильтрованы по длине, чтобы включить только фрагменты в диапазоне от 80 до 250 п.н. Поэтому фрагменты динуклеосом были исключены. Чтобы улучшить разрешение, полученные фрагменты были обрезаны на 40 п.н. вокруг диад для создания набора фрагментов одинаковой длины. Для каждого положения секвенированного нуклеотида регистрировали количество перекрывающихся фрагментов. Сгенерированные данные были подвергнуты фильтру нижних частот с ядром прямоугольных импульсов с шириной 21 пара оснований, затем полученные графики покрытия были сопоставлены с положениями генома ампликонов.

Статистический анализ проводился с использованием R, версия 3.2.3. Для машинного обучения мы использовали библиотеку с открытым исходным кодом Orange (Demsar et al., 2013). Были оценены пять алгоритмов машинного обучения, чтобы найти лучшую модель, демонстрирующую наивысшую точность прогнозирования на основе всех дескрипторов [машина опорных векторов (SVM), нейронная сеть, множественная линейная регрессия, наивный байесовский метод и случайный лес].

Результаты

Секвенирование образцов и анализ мутаций

В этом исследовании четырнадцать образцов вкДНК, собранных у пациентов с НМРЛ, были проанализированы с использованием скрининговых панелей ITCHP2 и AODCP.Среднее значение покрытия секвенированием во всех экспериментах было установлено на уровне 1150 × для панели AODCP и 802 × для панели ITCHP2 с соответствующими медианами 1002 × и 674 ×, соответственно.

Результаты обнаружения вариантов были полностью согласованы для двух панелей по 18 идентифицированным соматическим мутациям. Результаты обнаружения вариантов плазмы совпадали с исходным анализом ткани в 9 образцах (69%). Ложноотрицательные образцы были ограничены случаями, характеризующимися низкой концентрацией ДНК в плазме (рис. 1).В дополнение к мутациям, идентифицированным с помощью анализа ткани на исходном уровне, а именно в EGFR и RAS, секвенирование 13 образцов вкДНК плазмы выявило пять дополнительных соматических миссенс-мутаций, в том числе в генах PIK3CA и TP53 (рис. 1).

Рисунок 1. Образцы, использованные для анализа данных, а также мутации, выявленные во время секвенирования NGS, и их частоты аллелей (статус EGFR в плазме). Мутации, идентифицированные с использованием обычного метода секвенирования, указанного в столбце изменения опухоли, в то время как его соответствие (зеленый) или несоответствие (красный) с результатами NGS, указанными в столбце состояния EGFR плазмы.

Значение длины ампликона для чувствительности и специфичности обнаружения мутации

Средняя длина ампликонов в панели AODCP была намного короче, чем в панели ITCHP2 (рис. 2A), со средней длиной ампликонов, включающей последовательности праймеров 137 и 156 п.н., соответственно. Несмотря на разницу в размерах ампликонов, результаты поиска вариантов, полученные для каждой панели, были полностью совпадающими: в общей сложности обнаружен 51 вариант соматической или зародышевой линии. Следовательно, диагностическая чувствительность и специфичность этих двух систем обнаружения были одинаковыми при мощности исследования.

Рис. 2. (A) «Горячая точка 2» ионного рака (ITCHP2) и пользовательские панели праймеров AODCP Распределение длин ампликонов. Для дискретизации длины ампликона использовали постоянное окно в 5 п.н. Пунктирными линиями показана длина ампликонов, покрывающих 19 экзон EGFR. (B) влияние распределения длины фрагмента вкДНК, доступное для амплификации молекул ДНК в плазме, и, таким образом, эффективность амплификации. Сплошная заливка на верхней панели демонстрирует спектр фрагментов вкДНК, участвующих в ПЦР-амплификации экзона 19 EGFR с использованием панели ITCHP2.Пунктирная заливка показывает расширение этого спектра в случае использования панели AODCP. Заливки на нижней панели демонстрируют расширение спектра для двух панелей, соответственно, в случае мутации с делецией экзона 19 15 п.н.

Чтобы изучить возможное влияние длины ампликона на пределы обнаружения и, следовательно, на аналитическую чувствительность к наличию мутаций при жидкой биопсии, мы выполнили попарное сравнение частот для одного и того же мутированного аллеля в считывании, полученном от пар панельные ампликоны.Для синонимичного варианта зародышевой линии, а именно EGFR p.Gln787 = с общим числом идентифицированных 15 аллелей (1000 геномов MAF 0,43), частоты аллелей, извлеченные из анализа ампликонов AODCP и ITCHP2, были эквивалентны (знаковый ранговый критерий Вилкоксона p -значение = 0,88). С другой стороны, анализ соматических мутаций, которые обычно присутствуют в относительно небольшой части считываний, показал коэффициент корреляции Пирсона 0,88 ( p -значение = 0,02; знаковый ранговый критерий Вилкоксона p -значение = 0.44) для точечных мутаций в генах EGFR , TP53 и PIK3CA и 0,95 для делеций экзона 19 EGFR ( p -значение = 0,001; знаковый ранговый критерий Вилкоксона p -значение = 0,53) (рисунок 3). Поскольку делеции EGFR дополнительно уменьшают длину амплифицированных фрагментов на 15 или более п.н., их присутствие должно, по крайней мере теоретически, увеличивать аналитическую чувствительность системы обнаружения (рис. 2В). Примечательно, что среднее геометрическое отношение частоты аллелей делеций экзона 19 EGFR, обнаруженное двумя панелями, было равно 1.16 (95% ДИ 0,72–1,88; p -значение> 0,1). Это указывает на то, что аналитическая чувствительность этого анализа вряд ли изменится, даже если разница в средних размерах ампликонов увеличится и дальше.

Рисунок 3. Попарное сравнение частот для одного и того же мутировавшего аллеля в считывании, полученном от пар пан-специфичных ампликонов по обнаруженным соматическим вариантам.

Наконец, мы выполнили регрессионный анализ для оценки взаимосвязи между длиной ампликона и его средним охватом по выборкам для панели ITCHP2, представляющей более широкий спектр длин ампликонов.После нормализации содержания ГХ и общего количества считываний образцов линейный регрессионный анализ с использованием метода аппроксимации методом наименьших квадратов продемонстрировал отрицательный наклон со значением 0,0063 для теста Стьюдента t p . Однако регрессионный анализ по набору ампликонов длиной 170 п.н. или менее дал незначительный коэффициент наклона ( p — значение 0,69) (рисунки 4A, B). Регрессионный анализ между длиной ампликона и ковариацией его покрытия не продемонстрировал значимой корреляции в любом диапазоне длин ампликона (данные не показаны).Принимая во внимание, что ампликоны длиной 120 или меньше составляют только 5% этого набора, это указывает на то, что NGS-секвенирование cfDNA плазмы одинаково переносит ампликоны длиной в диапазоне 120–170 п.н.

Рис. 4. Регрессионный анализ показывает отсутствие связи между длиной ампликона и его средним охватом при ограничении анализа ампликонами длиной 170 или меньше (A) , в то время как регрессия сломанной палочки указывает на то, что система испытывает шок. после 170 п.н. (B) (зеленая заливка указывает на статистически значимый коэффициент наклона с p — значение 0.05 или меньше).

Шаблон, управляемый нуклеосомами, может облегчить дизайн панели праймеров

Согласно наиболее часто цитируемой гипотезе, вкДНК плазмы происходит из апоптотических клеток, где геномная ДНК переваривается набором нуклеаз (Ma et al., 2017). Обертывание нуклеосом защищает некоторые фрагменты ДНК от переваривания; поэтому фрагменты вкДНК соответствуют в первую очередь участкам, связанным с мононуклеосомами. Первоначально подтверждается только унимодальным распределением размеров фрагментов вкДНК (Fan et al., 2008; Lo et al., 2010), эта гипотеза была недавно подтверждена в нескольких исследованиях (Chandrananda et al., 2015; Snyder et al., 2016; Ulz et al., 2016). В частности, использование всего экзома-секвенирования фрагментов вкДНК для определения охвата глубины считывания позволило построить «нуклеосомные карты всего генома плазмы». Сопоставление фрагментов, покрытых панелью ITCHP2, с этими картами нуклеосом, показало, что положения праймеров ITCHP2 были выбраны неоптимальным способом относительно позиционирования нуклеосом ( p -значение для пиков нуклеосом и перехвата ампликонов 0.36). Ампликон, покрывающий экзон 4 KRAS, служит хорошей иллюстрацией неоптимального выбора праймеров, которые попадают между двумя пиками (рис. 5А). Из-за этого количества охватывающих фрагментов вкДНК намного ниже, чем для праймеров, выбранных для амплификации фрагмента, расположенного в пределах того же пика. Похожая ситуация может наблюдаться для экзона 21 EGFR; смещение положений праймеров примерно на 100 нуклеотидов может привести к увеличению глубины и однородности покрытия без ущерба для амплификации клинически значимого локуса, несущего мутацию.

Рис. 5. Модель фрагментации вкДНК в плазме искажает аналитические характеристики основанной на ПЦР системы соматической детекции. (A) Дизайн панели праймеров ITCHP2, картированный в управляемую нуклеосомами картину фрагментации вкДНК, указывает на возможное смещение в эффективности амплификации. Экспериментальный охват оценивался на основании парного секвенирования плазмы WGS здоровых людей (GSM1833219). Подсчет фрагментов рассчитывали как захваченные WGS и секвенированные фрагменты (продолжающиеся пары считывания), полностью покрывающие интересующий ампликон.Локализация панельного ампликона ITCHP2 (сплошная линия со стрелками, указывающая праймеры, а также освещенная область) в локальном минимуме приведет к недоступности для амплификации фрагментов вкДНК. Сдвиг ампликонов (пунктирные линии) в пределах клинически значимых мутаций может привести к увеличению количества доступных фрагментов и, следовательно, эффективности амплификации. A146 и K117 указывают на клинически значимые горячие точки мутации KRAS в интересующем экзоне. Аналогичная ситуация может наблюдаться для мутации EGFR L858R и соответствующего дизайна ампликонов — перемещение ампликонов в пределах клинически значимых мутаций сайта мутации может привести к увеличению однородности покрытия. (B) Общедоступные данные секвенирования cfDNA WGS [PRJNA2

] использовали для создания карт фрагментации cfDNA. (К) . Чтобы расшифровать комплексную переменную паттерна фрагментации вкДНК и ее сопоставление с положением и длиной ампликонов, были введены четыре характеристики, а именно наблюдаемые фрагменты (Характеристика A), диапазон глубины (Характеристика B), изменение глубины (Характеристика C) и форма глубины (Характеристика D).

На следующем этапе анализа мы поинтересовались, зависит ли эффективность целевого ресеквенирования образцов вкДНК от характера фрагментации ДНК.Для выполнения этого анализа для всех ампликонов, представленных в панели ITCHP2, образцы фрагментации были извлечены из репозитория считываний, полученных после дробового секвенирования фрагментов вкДНК, очищенных из пула образцов плазмы здоровых людей и пяти отдельных пациентов с твердым опухоли (рис. 5В).

Известно, что как позиционирование нуклеосом (Struhl and Segal, 2013), которое, в свою очередь, определяет фрагментацию кДНК (Ma et al., 2017), так и глубина и однородность покрытия при секвенировании считываний (Benjamini и Speed, 2012), зависят от содержания GC.В следующем анализе мы стремились выяснить, может ли какая-либо характеристика, связанная с паттерном фрагментации вкДНК в интересующем локусе, влиять на глубину и однородность охвата считываниями секвенирования на основе амплификации.

Для панели ITCHP2 каждый ампликон был сопоставлен с отдельной картой нуклеосом и оценен в соответствии с четырьмя характеристиками: (i) абсолютных количеств экспериментально наблюдаемых непрерывных фрагментов вкДНК, охватывающих весь ампликон (Характеристика A), (ii) прочтений амплитуда сигнала внутри ампликона (Признак B), (iii) изменение сигнала считывания на границах ампликона (Признак C) и (iv) форма сигнала считывания , определяемая как область между его линейной аппроксимацией и самим собой (Признак D ) (Рисунок 5C).Равномерность охвата была определена как коэффициент вариации охвата считыванием у всех индивидуумов между всеми образцами вкДНК. Чтобы рассчитать надежность нуклеосомного картирования, мы оценили межвыборочную дисперсию определенных характеристик, рассчитанных для каждого ампликона. Усредненные коэффициенты вариации признаков D, B и C составили 390, 68 и 38% соответственно, что указывает на значительную вариацию между выборками.

Далее мы оценили качество признаков, используя метод RReliefF (Робник-Сиконья и Кононенко, 2003), оценивая, насколько хорошо их значения различают целевые переменные, которые находятся рядом друг с другом.Несмотря на ранее продемонстрированную низкую надежность связанных с нуклеосомами функций, количество охватывающих фрагментов (функция A) оценивается даже выше, чем содержание GC, в то время как другие три функции, B, C и D, внимательно следят за функцией A и содержанием GC. (Рисунок 6A). Это открытие указывает на то, что однородность покрытия локуса с амплифицированными считываниями секвенирования может зависеть от лежащего в основе паттерна фрагментации вкДНК.

Рис. 6. Модель фрагментации вкДНК, управляемая нуклеосомами, влияет на средний охват ампликона и его однородность по образцам. (А) . RReliefF ранжирование определенных характеристик по отношению к среднему охвату ампликона и его однородности по выборкам, перечисленным в сравнении с рангами содержания GC, которые ранее показали сильную нелинейную корреляцию с обеими зависимыми переменными (C, D) , демонстрирует значимость все четыре функции для прогнозирования целевых переменных, хотя наблюдалась линейная корреляция между количеством охватывающих фрагментов и содержанием GC (B) .

Одномерная полиномиальная регрессия глубины охвата секвенированием и ее коэффициента вариации на основе содержания GC с полиномом второй степени дала коэффициенты детерминации 0.29 и 0,19 соответственно. Кроме того, равночастотная дискретизация содержания GC (четыре группы) и дисперсионный анализ обеих зависимых переменных между группами дали значение p менее 1e-6. Таким образом, была обнаружена сильная нелинейная корреляция между содержанием GC, охватом секвенирования и его однородностью (рисунки 6C, D). Несмотря на значительную линейную корреляцию между количеством охватывающих фрагментов и содержанием GC (рис. 6B), подобной связи между этой функцией и охватом секвенирования не наблюдалось (рис. 7A, B).Напротив, что касается однородности покрытия, оба охватывающих фрагмента, подсчет и охват глубины чтения формируют продемонстрированную корреляцию по отношению к нему (тест ANOVA p — значение 0,037 и 0,013, соответственно) (рисунки 7C, D). Не было обнаружено корреляции для изменения глубины или диапазона глубин (данные не показаны).

Рис. 7. Структура фрагментации вкДНК, управляемая нуклеосомами, облегчает прогнозирование однородности покрытия ампликонов по образцам. Тест ANOVA демонстрирует зависимость между количеством охватывающих фрагментов и однородностью покрытия, а также формой превышения глубины чтения и однородностью покрытия (C, D) , хотя аналогичной связи со средним охватом ампликонов по выборкам не наблюдалось (A, B) .Модель классификации SVM, использующая содержание GC в качестве единственного признака или в сочетании с признаками, определяющими паттерн фрагментации вкДНК, демонстрирует важность последнего для прогнозирования однородности покрытия ампликонов по образцам (F) , но не среднего охвата секвенированием. по образцам (E) .

Наконец, мы протестировали производительность классификатора SVM для его прогнозирования глубины покрытия и однородности покрытия, используя либо содержимое GC как отдельную функцию, либо в сочетании со всеми другими функциями, проанализированными выше.После трехгрупповой равночастотной дискретизации целевые классы были определены как глубина охвата в нижнем третьем тертиле и однородность покрытия в высшем третьем тертиле. Для прогнозирования глубины покрытия в качестве функций были выбраны GC-контент в сочетании с изменением глубины (Feature C). Чтобы предсказать равномерность покрытия, в качестве функций были выбраны содержимое GC в сочетании с подсчетом охватывающих фрагментов (Feature A) и формой глубины чтения (Feature D). Затем было применено ядро ​​радиальной базисной функции (RBF), использующее классификатор SVM, с использованием тройной перекрестной проверки.Производительность классификаторов SVM, построенных на нескольких функциях для прогнозирования однородности покрытия, была лучше, чем у классификаторов GC-content (области под рабочей кривой приемника (AUROC) 0,75, 95% доверительный интервал: 0,750–0,752 против 0,65, 95% ДИ: 0,63–0,67; точность — 0,74 против 0,68). Это указывает на то, что характеристики содержимого, не относящиеся к GC, могут помочь в прогнозировании ампликонов с большим разбросом покрытия по образцам. Однако для глубины покрытия применение аналогичной стратегии не привело к значительному улучшению (AUROC равняется 0.69, 95% ДИ: 0,68–0,70 против 0,70, 95% ДИ: 0,70–0,71; точность — 0,69 против 0,69) (рисунки 7E, F).

Обсуждение

Доля фрагментов вкДНК, происходящих из опухоли, а не из нормальных тканей, может сильно различаться среди пациентов. На ранней стадии заболевания эта доля может составлять всего 0,01% от общей вкДНК (Thierry et al., 2017). По этой причине проблема обнаружения низкочастотных мутантных аллелей представляет собой одну из самых больших технических проблем при разработке диагностических и прогностических анализов, включающих секвенирование вкДНК.В этом исследовании мы рассмотрели различные подходы к повышению диагностической и аналитической чувствительности обнаружения соматических мутаций в образцах жидкой биопсии.

В гетерогенной когорте пациентов жидкая биопсия проводилась на исходном уровне, при прогрессировании заболевания и / или в рамках мониторинга заболевания. Общая диагностическая чувствительность NGS для обнаружения мутаций EGFR в вкДНК составила 83%. Следует отметить, что когда мы ограничили набор образцов образцами плазмы с концентрацией ДНК 20 нг / мл и выше, количество ложноотрицательных результатов снизилось с 17 до 0%.Это наблюдение указывает на низкие концентрации образцов вкДНК как на основной фактор несовершенной чувствительности анализов жидкой биопсии и на необходимость либо улучшить восстановление фрагментов опухолевой ДНК, либо потребовать от лабораторий профилирования вкДНК ввести более строгие показатели контроля качества, что может делают многие образцы непригодными для последующей обработки.

Чувствительности анализов обнаружения мутаций на основе вкДНК может способствовать повышение эффективности амплификации. Известно, что внДНК плазмы сильно фрагментирована (Fleischhacker et al., 2011; Клевебринг и др., 2014; Рисунок 2B). Таким образом, общепризнано, что увеличение длины ампликонов ПЦР может привести к исключению большинства извлеченных фрагментов ДНК как возможных матриц. В этом исследовании мы стремились проанализировать, насколько длина ампликона влияет на чувствительность последующего обнаружения мутаций. Для этого мы провели, насколько нам известно, первое сравнение двух NGS-панелей на основе ампликонов, характеризующихся существенной разницей в средней длине ампликонов (рис. 2А).Сравнение проводилось в отношении диагностической и аналитической чувствительности панелей. Удивительно, но выход как зародышевой линии, так и соматических мутаций между двумя панелями был полностью согласован, указывая на несоответствие размера ампликона указанного короткого диапазона диагностической чувствительности результирующих анализов.

В качестве конкретного примера, противоречащего логике «чем короче ампликон, тем выше эффективность амплификации», мы проанализировали обнаружение аллелей делеции экзона 19 EGFR по ампликонам длиной 138 и 168 нуклеотидов.Основываясь на площади под кривыми распределения длины фрагментов (рис. 2B), мутантные аллели должны амплифицироваться в 1,45 раза более эффективно, чем аллели дикого типа, панелью с более крупными ампликонами, в то время как панель с более короткими ампликонами будет в 1,04 раза более эффективной для мутантных аллелей. фрагменты вкДНК. Учитывая, что фрагменты вкДНК, полученные из опухоли, даже короче, чем фрагменты, полученные из нормальной ткани (Jiang et al., 2018), эти показатели увеличиваются до 1,84 и 1,16 соответственно (Рисунок 3). Это должно примерно привести к увеличению на 1.В 6 раз больше частот мутантных аллелей, обнаруженных с помощью панели большего ампликона по сравнению с панелью меньшего ампликона. В нашем эксперименте не было отмечено статистически значимой разницы в частотах мутантных аллелей, при этом наблюдаемая тенденция была противоположной ожидаемой, что указывает на то, что размер ампликонов не влияет на аналитическую чувствительность анализов вкДНК.

Примечательно, что наши наблюдения противоречат некоторым предыдущим работам (Chan et al., 2004; Koide et al., 2005), которые показывают зависимое от длины снижение эффективности амплификации матриц вкДНК в диапазоне фрагментов до 250 нт, что соответствует к мононуклеосомной фракции, составляющей примерно 85% всех фрагментов вкДНК (рис. 2В).В этих предыдущих исследованиях выход ДНК упал почти на 30 и 60% при использовании ампликонов с размером 145 нт вместо 105 и 201 нт вместо 145 нт, в то время как для ампликонов большего размера не наблюдалось выраженного эффекта. Кроме того, другое исследование продемонстрировало, что увеличение выхода ДНК может наблюдаться при меньшем диапазоне размеров ампликона: прямое цифровое сравнение ампликона с помощью ПЦР 50 п.о. и 84 п.н. привело к значительному предпочтению более короткого ампликона (Koide et al., 2005 ; Sikora et al., 2010). Однако важно отметить, что сообщенные наблюдения были получены в ходе анализа, если образцы вкДНК, собранные либо у здоровых людей, либо в условиях пренатальной диагностики, направленной на амплификацию вкДНК плода, и, следовательно, не могут быть напрямую спроецированы на шаблоны опухолевых клеток. производная вкДНК, которая известна более короткими размерами ее фрагментов (Pinzani et al., 2011; Mouliere and Rosenfeld, 2015) и более низкой целостностью (Underhill et al., 2016). Исследования образцов вкДНК, собранных у пациентов с опухолями, показывают, что фрагментов 60 п.н. почти в пять раз больше, чем 150 п.н., что указывает на необходимость использования ампликонов размером 100 п.н. и меньше (Mouliere et al., 2011).

Важно отметить, что во многих случаях использование преимущества более короткого размера ампликона может оказаться невозможным из-за сложностей, возникающих из-за необходимости точного позиционирования праймеров, ограничивающего оптимизацию их содержания GC, согласования температур плавления и предотвращения димеризации олигонуклеотидов. Хотя разработка систем ПЦР для выбранных локусов все еще возможна, с анализом EGFR, являющимся распространенным примером (Reckamp et al., 2016), введение ультракоротких ампликонов в высоко мультиплексированные системы, нацеленные на более широкое молекулярное профилирование опухолей человека, может не осуществимо.Особые опасения по поводу этого подхода к дизайну ампликона, препятствующего мультиплексированию, связаны с недавними наблюдениями за широким спектром мутаций в жидких биоптатах пациентов с метастатическим раком и его значимостью для возможного включения в клинические испытания (Rothé et al., 2014; Frenel et al. ., 2015). В свете очевидной необходимости мультиплексирования открытие того факта, что различные размеры ампликонов в диапазоне от 140 до 170 нт не влияют на аналитическую чувствительность, является значительным, поскольку это смещает внимание разработчиков панелей с минимизации длины ампликонов на оптимизацию совместимости. олигонуклеотидов.

Кроме того, вкДНК в качестве матрицы для разработанного анализа на основе ПЦР может вводить набор дополнительных ограничений. Как преобладание фрагментов вкДНК определенных размеров, так и паттерны фрагментации зависят от расположения нуклеосом в ткани их происхождения. Чтобы описать эту новую сложную переменную, описывающую позиционирование нуклеосом, мы ввели четыре функции, а именно: количество охватывающих фрагментов, изменение глубины чтения, диапазон глубины чтения и форму глубины чтения (рис. 5C), которые в совокупности отображают покрытие выбранного ампликона экспериментальным путем. получается WGS читает.Когда карты покрытия считанных WGS-секвенированных фрагментов вкДНК из объединенной плазмы здоровых пациентов были сопоставлены с ампликонами, используемыми для анализа жидкостной биопсии пациентов с НМРЛ, эти четыре функции были использованы для определения степени влияния расположения нуклеосом на две зависимые переменные. : последовательность покрытия и равномерность покрытия. Классификатор на основе SVM продемонстрировал, что объединение содержимого GC с подсчетом охватывающих фрагментов и формой глубины чтения приводит к повышению точности предсказания обеих зависимых переменных.Следовательно, эту переменную следует учитывать при разработке систем праймеров для ПЦР.

Тем не менее, общая надежность позиционирования нуклеосом остается неясной. Известно, что несколько регуляторных событий, определяющих экспрессию гена, требуют строгого позиционирования нуклеосом; эти события обычно связаны с промоторными областями (Hesson et al., 2014; Lövkvist et al., 2018). Однако расположение нуклеосом не является абсолютным, и даже при значительных сдвигах в экспрессии генов некоторые клетки не могут изменить конфигурацию нуклеосом (Small et al., 2014), таким образом, указывая на лежащую в основе сложность позиционирования нуклеосом. Важно отметить, что большинство клинически значимых мутаций локализованы внутри экзонов, которые, согласно современным представлениям о картах нуклеосом cfDNA, не сохраняют строгий паттерн фрагментации cfDNA. Следовательно, расположение нуклеосом внутри таких экзонов может быть различным, как между молекулярными подтипами одного и того же заболевания, так и даже между образцами нормальной ткани. Тем не менее, несмотря на потенциальную низкую надежность, существенная корреляция, наблюдаемая между картами нуклеосом, выявленными объективным охватом считывания в вкДНК от здоровых пациентов, и охватом секвенирования и его однородностью в ампликонах, полученных в вкДНК пациентов с НМРЛ, указывает на то, что эффективность амплификации можно улучшить, если принять во внимание объективные покрытия для чтения.

В заключение, низкая концентрация вкДНК в плазме остается основным фактором, ограничивающим чувствительность анализов жидкой биопсии. Выше мы показали, что конструкция высоко мультиплексированной системы одинаково допускает ампликоны размером 140–170 п.н., что позволяет переключить внимание на температуру плавления, зажимы GC, перекрестную гомологию и другие контролируемые переменные. Мы также предоставили доказательства того, что размещение нуклеосом в исходной ткани и результирующая картина фрагментации вкДНК в масштабе всего генома могут быть использованы в качестве руководства для позиционирования праймера для улучшения как охвата секвенированием, так и его однородности.

Доступность данных

Наборы данных, созданные для этого исследования, можно найти в Архиве чтения последовательностей под номером доступа SRP167082 (https://trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?study=SRP167082). Дополнительные наборы данных, проанализированные для этого исследования, можно найти в Архиве чтения последовательностей под номером доступа SRP061633.

Авторские взносы

VM, AB, MI и SM. PC, KL и VB собрали образцы. ER проводил эксперименты. Все авторы участвовали в интерпретации результатов и в написании статьи.

Финансирование

Работа поддержана Министерством науки и образования России (проект № RFMEFI60714X0098).

Заявление о конфликте интересов

ER, SM, VM и AB работали в компании Atlas Oncology Diagnostics, Ltd.

Остальные авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Рецензент TT заявил о прошлом соавторстве с одним из авторов AB редактору, занимающемуся обработкой.

Благодарности

Авторы выражают благодарность за техническую поддержку лаборатории эпигенетики Медицинского генетического научного центра РАМН. Особая благодарность доктору Стрельникову и Танасу за техническую помощь и полезные обсуждения представленных здесь результатов.

Список литературы

Консорциум проекта «1000 геномов», Аутон, А., Брукс, Л. Д., Дурбин, Р. М., Гаррисон, Э. П., Канг, Х. М. и др. (2015). Глобальный справочник по генетическим вариациям человека. Nature 526, 68–74. DOI: 10.1038 / природа15393

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Брызгунова О., Бондарь А., Морозкин Е., Милейко В., Власов В., Лактионов П. (2011). Надежный метод концентрирования циркулирующей ДНК. Анал. Биохим. 408, 354–356. DOI: 10.1016 / j.ab.2010.09.005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чан, К. К., Чжан, Дж., Хуэй, А. Б., Вонг, Н., Лау, Т. К., Leung, T. N., et al. (2004). Распределение по размерам материнской и плодной ДНК в материнской плазме. Clin. Chem. 50, 88–92. DOI: 10.1373 / Clinchem.2003.024893

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чандрананда Д., Торн Н. П. и Бахло М. (2015). Характеристика сигнатур последовательностей с высоким разрешением из-за неслучайного расщепления внеклеточной ДНК. BMC Med. Геномика 8:29. DOI: 10.1186 / s12920-015-0107-z

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Доусон, С.Дж., Цуй, Д. В., Муртаза, М., Биггс, Х., Руэда, О. М., Чин, С. Ф. и др. (2013). Анализ циркулирующей опухолевой ДНК для мониторинга метастатического рака груди. N. Engl. J. Med. 368, 1199–1209. DOI: 10.1056 / NEJMoa1213261

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Demsar, J., Curk, T., Erjavec, A., Gorup, C., Hocevar, T., Milutinovic, M., et al. (2013). Оранжевый: набор инструментов для интеллектуального анализа данных на Python. J. Mach. Учиться. Res. 14, 2349–2353.

Google Scholar

Вентилятор, H.К., Блюменфельд, Ю. Дж., Читкара, У., Хаджинс, Л., и Квейк, С. Р. (2008). Неинвазивная диагностика анеуплоидии плода с помощью дробовика секвенирования ДНК из материнской крови. Proc. Natl. Акад. Sci. США 105, 16266–16271. DOI: 10.1073 / pnas.0808319105

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Флейшхакер М., Шмидт Б., Вейкманн С., Фершинг Д. М., Лешински Г. С., Зигеле Б. и др. (2011). Способы выделения внеклеточной ДНК плазмы сильно влияют на выход ДНК. Clin. Чим. Acta 412, 2085–2088. DOI: 10.1016 / j.cca.2011.07.011

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Форбс, С. А., Танг, Г., Биндал, Н., Бэмфорд, С., Доусон, Э., Коул, К. и др. (2010). COSMIC (Каталог соматических мутаций при раке): ресурс для исследования приобретенных мутаций при раке человека. Nucleic Acids Res. 38, D652 – D657. DOI: 10.1093 / nar / gkp995

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Френель, Дж.С., Каррейра, С., Гудолл, Дж., Рода, Д., Перес-Лопес, Р., Тунариу, Н. и др. (2015). Последовательное секвенирование следующего поколения циркулирующей внеклеточной ДНК для оценки реакции клона опухоли на молекулярно-направленное введение лекарств. Clin. Cancer Res. 21, 4586–4596. DOI: 10.1158 / 1078-0432.CCR-15-0584

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хеллвиг, С., Никс, Д. А., Глигорич, К. М., О’Ши, Дж. М., Томас, А., Фуэртес, К. Л. и др. (2018). Автоматический выбор размера для коротких бесклеточных фрагментов ДНК обогащает циркулирующую опухолевую ДНК и улучшает исправление ошибок при секвенировании следующего поколения. PLoS One 13: e0197333. DOI: 10.1371 / journal.pone.0197333

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Hesson, L. B., Sloane, M. A., Wong, J. W., Nunez, A. C., Srivastava, S., Ng, B., et al. (2014). Измененное позиционирование промоторных нуклеосом является ранним событием в сайленсинге генов. Эпигенетика 9, 1422–1430. DOI: 10.4161 / 15592294.2014.970077

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Иванов, М., Баранова, А., Батлер, Т., Спеллман, П., Милейко, В. (2015). Неслучайные паттерны фрагментации в циркулирующей внеклеточной ДНК отражают эпигенетическую регуляцию. BMC Genomics 16 (Приложение 13): S1. DOI: 10.1186 / 1471-2164-16-S13-S1

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Иванов М., Мацвай А., Глазова О., Красовский С., Усачева М., Амелина Е. и др. (2018). Целевое секвенирование выявляет сложные фенотип-коррелированные генотипы при муковисцидозе. BMC Med.Genomics 11 (Приложение 1): 13. DOI: 10.1186 / s12920-018-0328-z

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Jiang, P., Chan, C. W., Chan, K. C., Cheng, S. H., Wong, J., Wong, V. W., et al. (2015). Удлинение и укорочение ДНК плазмы у пациентов с гепатоцеллюлярной карциномой. Proc. Natl. Акад. Sci. США 112, E1317 – E1325. DOI: 10.1073 / pnas.1500076112

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Цзян, П., Sun, K., Tong, Y.K, Cheng, S.H., Cheng, T.H.T., Heung, M.M.S., et al. (2018). Предпочтительные концевые координаты и соматические варианты в качестве сигнатур циркулирующей опухолевой ДНК, связанной с гепатоцеллюлярной карциномой. Proc. Natl. Акад. Sci. США 115, E10925 – E10933. DOI: 10.1073 / pnas.1814616115

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Клевебринг, Д., Нейман, М., Сандлинг, С., Эрикссон, Л., Дарай Рамквист, Э., Челебиоглу, Ф. и др. (2014). Оценка секвенирования экзома для оценки опухолевой нагрузки в плазме. PLoS One 9: e104417. DOI: 10.1371 / journal.pone.0104417

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Коиде К., Секизава А., Ивасаки М., Мацуока Р., Хонма С., Фарина А. и др. (2005). Фрагментация внеклеточной ДНК плода в плазме и моче беременных. Prenat. Диаг. 25, 604–607. DOI: 10.1002 / pd.1213

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ли, Х. (2011). Статистическая структура для вызова SNP, обнаружения мутаций, сопоставления ассоциаций и оценки генетических параметров популяции на основе данных секвенирования. Биоинформатика 27, 2987–2993. DOI: 10.1093 / биоинформатика / btr509

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ло, Ю. М., Чан, К. К., Сун, Х., Чен, Э. З., Цзян, П., Лун, Ф. М. и др. (2010). Секвенирование ДНК материнской плазмы выявляет генетический и мутационный профиль плода по всему геному. Sci. Пер. Med. 2: 61ra91. DOI: 10.1126 / scitranslmed.3001720

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

млн лет назад X., Zhu, L., Wu, X., Bao, H., Wang, X., Chang, Z., et al. (2017). Бесклеточная ДНК обеспечивает хорошее представление генома опухоли, несмотря на предвзятые модели фрагментации. PLoS One 12: e0169231. DOI: 10.1371 / journal.pone.0169231

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Malapelle, U., Pisapia, P., Rocco, D., Smeraglio, R., di Spirito, M., Bellevicine, C., et al. (2016). Методы секвенирования нового поколения в жидкостной биопсии: основное внимание уделяется пациентам с немелкоклеточным раком легкого. Пер. Lung Cancer Res. 5, 505–510. DOI: 10.21037 / tlcr.2016.10.08

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Милн И., Байер М., Кардл Л., Шоу П., Стивен Г., Райт Ф. и др. (2010). Таблетка — визуализация сборки последовательности нового поколения. Биоинформатика 26, 401–402. DOI: 10.1093 / биоинформатика / btp666

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мульер, Ф., Роберт, Б., Арно Пейротт, Э., Дель Рио, М., Ичу, М., Молина, Ф. и др. (2011). Циркулирующая ДНК опухолевого происхождения характеризуется высокой степенью фрагментации. PLoS One 6: e23418. DOI: 10.1371 / journal.pone.0023418

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Mouliere, F., and Rosenfeld, N. (2015). Циркулирующая ДНК опухолевого происхождения короче соматической ДНК в плазме. Proc. Natl. Акад. Sci. США 112, 3178–3179. DOI: 10.1073 / pnas.1501321112

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Окснард, Г.Р., Павелец, К. П., Куанг, Ю., Мах, С. Л., О’Коннелл, А., Мессинео, М. М. и др. (2014). Неинвазивное определение ответа и устойчивости при EGFR-мутантном раке легкого с использованием количественного генотипирования следующего поколения бесклеточной ДНК плазмы. Clin. Cancer Res. 20, 1698–1705. DOI: 10.1158 / 1078-0432.CCR-13-2482

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пинзани П., Сальвианти Ф., Заккара С., Масси Д., Де Джорджи В., Паццагли М. и др. (2011).Циркулирующая внеклеточная ДНК в плазме больных меланомой: качественные и количественные соображения. Clin. Чим. Acta 412, 2141–2145. DOI: 10.1016 / j.cca.2011.07.027

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пупилли К., Пинзани П., Сальвианти Ф., Фибби Б., Росси М., Петроне Л. и др. (2013). Циркулирующий BRAFV600E в диагностике и последующем наблюдении дифференцированной папиллярной карциномы щитовидной железы. J. Clin. Эндокринол. Метаб. 98, 3359–3365.DOI: 10.1210 / jc.2013-1072

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Реккамп К. Л., Мельникова В. О., Карлович К., Секвист Л. В., Камидж Д. Р., Уэйкли Х. и др. (2016). Высокочувствительная и количественная тестовая платформа для обнаружения мутаций EGFR NSCLC в моче и плазме. J. Thorac. Онкол. 11, 1690–1700. DOI: 10.1016 / j.jtho.2016.05.035

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Робник-Сиконья, М., и Кононенко, И. (2003). Теоретический и эмпирический анализ ReliefF и RReliefF. Мах. Учиться. 53, 23–69. DOI: 10.1023 / A: 1025667309714

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Роте, Ф., Лаес, Дж. Ф., Ламбрехтс, Д., Смитс, Д., Винсент, Д., Мейтенс, М., и др. (2014). Циркулирующая в плазме опухолевая ДНК как альтернатива метастатической биопсии для мутационного анализа при раке груди. Ann. Онкол. 25, 1959–1965. DOI: 10.1093 / annonc / mdu288

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Захер, А.Г., Павелец, К., Дальберг, С. Э., Олден, Р. С., О’Коннелл, А., Фини, Н. и др. (2016). Проспективная валидация быстрого генотипирования плазмы для обнаружения мутаций EGFR и KRAS при распространенном раке легкого. JAMA Oncol. 2, 1014–1022. DOI: 10.1001 / jamaoncol.2016.0173

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сондерс, К. Т., Вонг, В. С., Свами, С., Бек, Дж., Мюррей, Л. Дж., И Читам, Р. К. (2012). Стрелка: точный соматический вызов малых вариантов из секвенированных пар опухоль-нормальный образец. Биоинформатика 28, 1811–1817. DOI: 10.1093 / биоинформатика / bts271

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сикора А., Циммерманн Б. Г., Рустерхольц К., Бирри Д., Колла В., Лапайр О. и др. (2010). Обнаружение повышенного количества внеклеточной ДНК плода с помощью коротких ампликонов ПЦР. Clin. Chem. 56, 136–138. DOI: 10.1373 / Clinchem.2009.132951

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сиравенья, Г., Муссолин, Б., Бускарино, М., Корти, Г., Кассингена, А., Кризафулли, Г. и др. (2015). Клональная эволюция и устойчивость к блокаде EGFR в крови пациентов с колоректальным раком. Нат. Med. 21, 795–801. DOI: 10,1038 / нм.3870

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Смолл, Э. К., Си, Л., Ван, Дж. П., Видом, Дж., И Лихт, Дж. Д. (2014). Картирование нуклеосом одной клетки показывает молекулярную основу гетерогенности экспрессии генов. Proc. Natl.Акад. Sci. США 111, 2462–2471. DOI: 10.1073 / pnas.1400517111

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Снайдер М. В., Кирчер М., Хилл А. Дж., Даза Р. М. и Шендуре Дж. (2016). Внеклеточная ДНК включает в себя нуклеосомный след in vivo, который сообщает о ее тканях происхождения. Cell 164, 57–68. DOI: 10.1016 / j.cell.2015.11.050

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Тафе, Л. Дж., Горлов, И. П., де Абреу, Ф.Б., Леффертс, Дж. А., Лю, X., Петтус, Дж. Р. и др. (2015). Внедрение совета по молекулярным опухолям: влияние на решения о лечении 35 пациентов, оцененных в медицинском центре Дартмут-Хичкок. Онколог 20, 1011–1018. DOI: 10.1634 / теонколог.2015-0097

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Тьерри А. Р., Пастор Б., Цзян З. К., Кациампура А. Д., Парсегиан К., Лори Дж. М. и др. (2017). Циркулирующая ДНК демонстрирует конвергентную эволюцию и общие механизмы устойчивости во время лечения колоректального рака. Clin. Cancer Res. 23, 4578–4591. DOI: 10.1158 / 1078-0432.CCR-17-0232

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Тресс, К. С., Брант, Р., Карр, Т. Х., Дирден, С., Дженкинс, С., Браун, Х. и др. (2015). Обнаружение мутации EGFR в ctDNA из плазмы пациентов с NSCLC: кросс-платформенное сравнение ведущих технологий для поддержки клинической разработки AZD9291. Рак легких 90, 509–515. DOI: 10.1016 / j.lungcan.2015.10.004

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ульц, П., Thallinger, G.G., Auer, M., Graf, R., Kashofer, K., Jahn, S.W., et al. (2016). Выявление экспрессируемых генов путем полногеномного секвенирования ДНК плазмы. Нат. Genet. 48, 1273–1278. DOI: 10,1038 / нг. 3648

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Андерхилл, Х. Р., Кицман, Дж. О., Хеллвиг, С., Велкер, Н. К., Даза, Р., Бейкер, Д. Н. и др. (2016). Длина фрагмента циркулирующей опухолевой ДНК. PLoS Genet. 12: e1006162. DOI: 10.1371 / journal.pgen.1006162

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Валуев А., Джонсон С. М., Бойд С. Д., Смит К. Л., Файер А. З., Сидоу А. (2011). Детерминанты организации нуклеосом в первичных клетках человека. Природа 474, 516–520. DOI: 10.1038 / nature10002

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Вэй, З., Шах, Н., Дэн, К., Сяо, X., Чжун, Т., и Ли, X. (2016). Циркулирующая ДНК направлена ​​на мониторинг рака у пациентов с немелкоклеточным раком легкого для выявления и фиксации динамических изменений болезни. Springerplus 5: 531. DOI: 10.1186 / s40064-016-2141-5

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Си, Л., Фам, Т. Х., Паябиаб, Э. К., Шерри, Р. М., Розенберг, С. А., и Раффельд, М. (2016). Циркулирующая опухолевая ДНК как ранний индикатор ответа на иммунотерапию с переносом Т-клеток при метастатической меланоме. Clin. Cancer Res. 22,5480–5486. DOI: 10.1158 / 1078-0432.CCR-16-0613

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Зехир, А., Benayed, R., Shah, R.H., Syed, A., Middha, S., Kim, H.R., et al. (2017). Мутационный ландшафт метастатического рака выявлен в результате проспективного клинического секвенирования 10 000 пациентов. Нат. Med. 23, 703–713. DOI: 10,1038 / нм.4333

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ухудшение качества спермы, увеличение морфологических дефектов спермы и фрагментация ДНК, связанные с загрязнением окружающей среды у городского населения молодых людей из Западной Сибири, Россия

Abstract

Плохая морфология сперматозоидов и повышенный уровень фрагментации ДНК считаются связанными с нарушениями спермиогенеза в результате генетических мутаций и воздействия факторов окружающей среды, включая промышленное загрязнение.Стандартизованные поперечные популяционные исследования дефектов морфологии сперматозоидов и фрагментации ДНК сперматозоидов, особенно в регионах с повышенным загрязнением окружающей среды, могут быть полезны для изучения влияния промышленного загрязнения и других популяционных факторов на процесс спермиогенеза. Целью настоящего исследования было оценить влияние промышленного загрязнения на морфогенез сперматозоидов и фрагментацию ДНК сперматозоидов у мужчин из общей популяции Западной Сибири. Города Новосибирск и Кемерово расположены в одинаковых климатических условиях в Западной Сибири, но город Кемерово характеризуется повышенным загрязнением окружающей среды, особенно твердыми частицами (ТЧ).В исследование были включены добровольцы-мужчины, проживающие в Новосибирске (n = 278) и Кемерово (n = 258). Процент морфологических дефектов сперматозоидов подсчитывают после окрашивания мазков нативного эякулята с помощью наборов Diff-Quick. Фрагментацию ДНК оценивали методом SCSA. Для жителей Кемерово характерны пониженное количество сперматозоидов и их подвижность, повышенная фрагментация ДНК, плохая морфология сперматозоидов и повышенная частота морфологических эффектов головки (грушевидная, удлиненная, круглая, аномальная акросома и вакуолизированный хроматин), асимметричного прикрепления шейки и избыточной остаточной цитоплазмы. .Более того, повышенная фрагментация ДНК была связана с пониженным количеством сперматозоидов, подвижностью сперматозоидов и повышенным процентом нескольких дефектов морфологии сперматозоидов, при этом место жительства влияло на взаимосвязь между обычными параметрами спермы, морфологией сперматозоидов и фрагментациями ДНК. Наше исследование предполагает, что чрезмерное удлинение головки сперматозоидов и нарушение образования акросом могут способствовать ухудшению морфологии сперматозоидов у мужчин из загрязненных территорий. Показаны региональные особенности во взаимосвязи между морфологией сперматозоидов, количеством сперматозоидов и фрагментацией ДНК, что свидетельствует о важности изучения паттерна морфологии сперматозоидов у мужчин из разных регионов.

Образец цитирования: Клещев М., Осадчук А., Осадчук Л. (2021) Нарушение качества спермы, увеличение морфологических дефектов спермы и фрагментация ДНК, связанные с загрязнением окружающей среды в городском населении молодых людей из Западной Сибири, Россия. PLoS ONE 16 (10): e0258900. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0258900

Редактор: Суреш Енугу, Хайдарабадский университет, ИНДИЯ

Поступило: 4 июня 2021 г .; Одобрена: 8 октября 2021 г .; Опубликован: 22 октября 2021 г.

Авторские права: © 2021 Kleshchev et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в рукописи и ее файлах с вспомогательной информацией.

Финансирование: Надзор за исследованием, анализ данных и написание рукописи были поддержаны проектом №19-15-00075 Российского научного фонда.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Бесплодие — сложное репродуктивное расстройство, от которого страдают почти 15% пар, причем 50% случаев вызваны мужским фактором [1]. Количество сперматозоидов, подвижность сперматозоидов и морфология сперматозоидов считаются традиционными маркерами мужской фертильности [2], однако рутинное микроскопическое исследование сперматозоидов не всегда точно предсказывает мужскую фертильность и указывает на причины бесплодия [3, 4].В последние десятилетия было разработано несколько дополнительных инструментов для оценки статуса мужской фертильности, включая оценку фрагментации ДНК в сперматозоидах. Многочисленные свидетельства показывают, что фрагментация ДНК является хорошим предиктором мужской фертильности [5–7].

Следует отметить, что во многих случаях снижение параметров сперматозоидов, особенно подвижности, морфологии и целостности ДНК, может быть вызвано нарушениями спермиогенеза. Спермиогенез — это сложный процесс морфологической и биохимической дифференциации гаплоидной сперматиды, включающий образование акросомы, изменение морфологии ядра, сборку жгутика и структур, ответственных за подвижность сперматозоидов, конденсацию хроматина, удаление остаточной цитоплазмы [8–14 ].Реорганизация хроматина во время спермиогенеза включает замену гистонов переходными белками и, наконец, протаминами. Более того, восстанавливаются физиологические разрывы в ДНК сперматозоидов, возникающие в результате замены гистона на протамин [15]. Эти процессы приводят к формированию видоспецифичной формы сперматозоидов и плотно упакованного хроматина, устойчивого к действию агентов окружающей среды, особенно активных форм кислорода (АФК). Неудачи протаминирования вызывают фрагментацию ДНК, потому что сперматозоид не может восстанавливать физиологические разрывы ДНК [15, 16], а неполное протаминирование приводит к повышенной уязвимости сперматозоидов к АФК.Кроме того, было показано, что избыточная остаточная цитоплазма (ERC) является значительным источником ROS [17, 18]. Известно, что АФК являются одной из причин, вызывающих повреждение ДНК и снижение качества спермы и мужской фертильности [15, 19]. Следовательно, недостаточность спермиогенеза может влиять на морфологию сперматозоидов из-за неудачной перестройки сперматозоидов, приводить к повышенной фрагментации ДНК сперматозоидов из-за нарушения конденсации хроматина, а также к снижению подвижности сперматозоидов из-за дефектной сборки хвоста.

Ошибки спермиогенеза приводят к появлению в эякуляте морфологических дефектов сперматозоидов, представленных в различных пропорциях.На сегодняшний день создано несколько систем классификации дефектов сперматозоидов, учитывающих особенности строения головы, средней части и хвоста [2, 20, 21]. Некоторые авторы считают, что частота дефектов сперматозоидов в эякуляте (морфологический паттерн сперматозоидов) специфична для определенных мужчин [22]. Считается, что морфологический паттерн обусловлен совместным влиянием генетических и внешних факторов [21, 22], причем морфология сперматозоидов связана с подвижностью сперматозоидов [23] и уровнем фрагментации ДНК [24–28].Оценка паттерна морфологии сперматозоидов считается более информативной для мужской репродуктивной оценки по сравнению с простым подсчетом сперматозоидов с нормальной морфологией, поскольку высокая частота некоторых критических отклонений может отражать изменения в спермиогенных процессах с функциональными последствиями, приводящими к снижению фертильности [21, 22 , 29]. С другой стороны, в нескольких исследованиях сообщалось об отсутствии связи между морфологией сперматозоидов, фрагментацией ДНК [30, 31] и мужской фертильностью [32–34].Обычно считается, что эти расхождения вызваны методологической серьезностью оценки морфологии сперматозоидов [35, 36], хотя это может свидетельствовать о том, что взаимосвязь между параметрами сперматозоидов и структурой морфологии сперматозоидов сложна, отражает сложность процесса спермиогенеза и зависит от взаимодействия многочисленные внешние факторы. Это обстоятельство указывает на необходимость стандартизированного детального изучения генетических и экологических факторов, влияющих на паттерн морфологии сперматозоидов и ее взаимосвязь с другими параметрами сперматозоидов.

Спермиогенез чувствителен к условиям окружающей среды и факторам образа жизни. Ожирение [37, 38], курение [39], андрологические расстройства [40] и хронические системные заболевания [41] влияют на морфологию сперматозоидов. Кроме того, загрязнение окружающей среды является серьезным фактором, влияющим на количество сперматозоидов, подвижность сперматозоидов, процент морфологически нормальных сперматозоидов [42], морфологический характер сперматозоидов [43] и уровень фрагментации ДНК [44, 45]. К загрязнителям окружающей среды относятся полициклические углеводороды [46], тяжелые металлы, газы и твердые частицы (ТЧ), являющиеся компонентами промышленного загрязнения [45, 47].

Следует отметить, что загрязнение воздуха и почвы связано с географическим положением и способствует региональным различиям в количестве сперматозоидов, прогрессирующей подвижности и процентном соотношении морфологически нормальных сперматозоидов, выявленных в ходе многочисленных исследований [48–52].

Восприимчивость спермиогенеза к факторам окружающей среды, влияющим на человеческую популяцию в различных регионах, и важность морфологии сперматозоидов для оценки мужской фертильности и понимания причин и механизмов нарушений спермиогенеза предполагают необходимость стандартизированных поперечных популяционных исследований дефектов морфологии сперматозоидов и фрагментации ДНК сперматозоидов. особенно в регионах с повышенным загрязнением окружающей среды, чтобы исследовать влияние промышленного загрязнения и других факторов, связанных с населением, на процесс спермиогенеза.Однако популяционные исследования морфологической картины сперматозоидов и повреждения ДНК сперматозоидов проводятся редко [20, 53, 54]. Насколько нам известно, популяционных исследований с одновременной детальной оценкой морфологии сперматозоидов и фрагментации ДНК в регионах с различным уровнем промышленного загрязнения не проводилось. Для популяций людей Западной Сибири поперечные исследования морфологической структуры сперматозоидов и фрагментации ДНК также не проводились, хотя отдельные районы этой территории характеризуются сильным загрязнением окружающей среды из-за металлургических, химических и горнодобывающих предприятий.В частности, города Новосибирск и Кемерово расположены в одних и тех же климатических условиях, но Кемеровская область (Кузбасс) и город Кемерово характеризуются повышенным загрязнением окружающей среды, особенно ТЧ, из-за добычи угля и многочисленных металлургических и химических производств [55, 56]. В предыдущем исследовании было показано, что мужчины из общей популяции города Кемерово характеризовались более низким количеством сперматозоидов, подвижностью сперматозоидов, уровнем тестостерона и ингибина B по сравнению с жителями города Новосибирска [56].Исследование паттерна морфологии сперматозоидов и фрагментации ДНК в этой области может быть интересным для оценки комплексного промышленного загрязнения морфогенеза сперматозоидов и уплотнения хроматина.

Целью исследования было оценить влияние промышленного загрязнения на морфологию сперматозоидов и фрагментацию ДНК сперматозоидов у мужчин из общей популяции Западной Сибири. Для полноты картины мы обсудили вышеупомянутые ранее опубликованные данные об основных параметрах спермы (количество, концентрация и подвижность сперматозоидов, процент сперматозоидов с нормальной морфологией) вместе с нашими данными о морфологических дефектах сперматозоидов и фрагментации ДНК у мужчин из общей популяции. проживает в Новосибирске и Кемерово.

Материалы и методы

Исследуемая популяция

Исследование в Новосибирске охватывало период: октябрь 2011 г. — май 2014 г., в Кемерово октябрь 2009 г. — март 2013 г.

Протокол набора и методы физического обследования были подробно описаны ранее [56]. Вкратце, в исследование были включены добровольцы-мужчины, заинтересованные в своем репродуктивном здоровье, с неизвестной фертильностью, проживающие в Новосибирске (n = 278) и Кемерово (n = 258) не менее 5 лет. Исследование проводилось в 2010–2014 гг.Критериями включения в исследование были отсутствие острых общих заболеваний или хронических заболеваний в острой фазе, а также инфекции половых путей. Все участники дали письменное информированное согласие на участие в исследовании.

Каждый участник был осмотрен опытным андрологом для определения возможных андрологических заболеваний, а также для измерения массы тела, роста, объема яичек и оценки вторичных половых признаков. Для всех участников был рассчитан индекс массы тела (ИМТ, ​​кг / м ² ).Чтобы оценить возможное влияние ожирения на морфологию сперматозоидов, каждый участник был отнесен к одной из трех групп в соответствии с его ИМТ: нормальный вес (18,5–24,9 кг / м ² ) избыточный вес (25–29,9 кг / м ² ) и ожирение (ИМТ ≥30 кг / м ² ).

Каждый участник заполнил стандартизированную анкету, включая информацию о текущем возрасте, месте рождения, семейном положении, перенесенных или текущих урологических заболеваниях. Курение табака, потребление алкоголя и история фертильности, а также самоопределение национальности добровольца и его родителей. .

Этический комитет Федерального исследовательского центра «Институт цитологии и генетики» Сибирского отделения Российской академии наук одобрил исследование.

Образцы спермы

Образцы спермы были собраны путем мастурбации и проанализированы на предмет объема спермы (мл), концентрации сперматозоидов (мл / мл), прогрессивной подвижности (в процентах) и морфологии сперматозоидов. Объем спермы, концентрация и количество сперматозоидов, а также прогрессивная подвижность для всех субъектов оценивались в соответствии с «лабораторным руководством ВОЗ по исследованию и обработке человеческой спермы» [2], как описано ранее [56, 57].Для изучения взаимосвязи между нарушенными параметрами спермы (концентрация сперматозоидов и подвижность сперматозоидов) и процентами морфологических дефектов сперматозоидов каждому участнику был присвоен статус качества спермы (SQS) в соответствии с пороговыми значениями качества спермы, предоставленными ВОЗ [2]: нормозооспермия (концентрация сперматозоидов) и процент прогрессивно подвижных сперматозоидов, равный или превышающий нижние контрольные пределы) и патозооспермия (концентрация сперматозоидов <15 млн / мл и / или процент прогрессивно подвижных сперматозоидов <32%).

Анализ морфологии сперматозоидов

Для оценки морфологии сперматозоидов готовили мазки эякулята, фиксировали метанолом (в течение 1 мин) и окрашивали с помощью наборов Diff-Quick («Абрис плюс», Россия) согласно «Руководству ВОЗ…» [2]. Сперматозоиды исследовали на морфологию с помощью светлопольного оптического микроскопа (Carl Zeiss, Германия) при увеличении × 1000 с масляной иммерсией. Микроскоп был оснащен цифровой камерой AxioScope со специальным программным обеспечением (AxioVision 9.0), позволяющим проводить морфометрию сперматозоидов.Были оценены двести сперматозоидов для каждого образца спермы. Процент нормальных сперматозоидов был дважды оценен в случайном и слепом порядке двумя опытными исследователями. Коэффициент корреляции Спирмена между процентами сперматозоидов с нормальной морфологией, полученными при первом и втором подсчете, составил 0,78, статистически значимой разницы не наблюдалось. Различия между первым и вторым подсчетами нормальной морфологии сперматозоидов были приемлемыми в соответствии с критериями, указанными в «лабораторном руководстве ВОЗ…» [2] для каждого образца.Было рассчитано среднее значение процента нормальных сперматозоидов.

Процент морфологических дефектов сперматозоидов оценивался в случайном и слепом порядке единственным опытным исследователем (M.K.).

Классификация морфологии сперматозоидов

Сперма была классифицирована как нормальная в соответствии с критериями нормальной морфологии сперматозоидов, указанными в «Руководстве ВОЗ по лаборатории…» [2]. Другие сперматозоиды относятся к аномальным, включая пограничные формы.

Классификация дефектов сперматозоидов проводилась по классификационной схеме, предложенной [2].К сожалению, руководство не дает точных определений каждой аномалии морфологии сперматозоидов, но представлены только фотографии некоторых дефектов сперматозоидов. Следовательно, дополнительные критерии для определения каждой категории дефектов сперматозоидов были использованы для стандартизации классификации морфологии сперматозоидов в нашем исследовании.

Всего учтено 14 типов аномалий.

1. Аморфная головка . Аморфные головы включают головы сильно деформированной формы, с неправильными краями, асимметричные, с расширенной постакросомной зоной, но не относящиеся к грушевидным или удлиненным головам.

2. Пириформная голова . К этому типу относятся головы с сильно удлиненной и суженной постакросомной зоной [22]. Отношение длины к ширине головы было ≥ 2, при этом ширина измерялась в экваториальной зоне [58].

3. Головка удлиненная . Голова имеет отношение длины к ширине> 2 [58], но в отличие от грушевидной головки ширина акросомы и постакросомной зоны одинакова.

4. Круглая головка . Головка имеет отношение длины к ширине = 1 [58].

5. Дефект акросомы .Площадь акросомы составляет менее 40% или более 70% площади головы [2].

6. Головка с вакуумом. Голова имеет более двух вакуолей, занимающих более 20% площади головы или расположенных в постакросомной области [2].

7 . Толстая середина . Ширина средней части составляет более одного мкм [2].

8. Тонкий переходник . Ширина промежуточной детали меньше ширины основной детали [58].

9. Гнутая шейка . Промежуточный элемент образует угол 90 ° (или меньше) с длинной осью головки сперматозоида [58].

10. Избыточная остаточная цитоплазма (ERC). Представлен крупный (более 1/3 площади головы) остаток цитоплазмы [2].

11. Асимметричная насадка для шеи . Крепление промежуточного элемента не совмещено с центральной осью головы [2].

13. Спиральный хвост. Хвост закручен (> 360 °) [2].

14. Короткий хвост. Длина хвоста менее 45 мкм [2].

Дефектов в каждом сперматозоиде регистрировали с помощью лабораторного счетчика в системе многократного ввода.Процент каждой аномалии сперматозоидов и индекса тератозооспермии (TZI) был рассчитан в соответствии с «лабораторным руководством ВОЗ…» [2].

Оценка фрагментации ДНК

Анализ структуры хроматина сперматозоидов (SCSA) был использован для оценки уровня фрагментации ДНК [7, 59]. Сразу после сбора эякулята аликвоту спермы (300 мкл) замораживали и хранили (-40 ° C) до анализа. Для анализа фрагментации ДНК сперматозоидов образец разбавляли TNE-буфером (0,01 M Трис, 1 мМ EDTA, 0,15 MNaCl, pH 7.4) до концентрации сперматозоидов 1 млн / мл, а затем 200 мкл кислотного буфера (0,1% Triton-X-100, 0,15 M NaCl, 0,08 N HCl, pH -1,2). был добавлен к 100 мкл разбавленного эякулята. После инкубации в течение 30 с 600 мкл раствора красителя, содержащего 6 мг / л акридинового оранжевого, 0,2 М Na ₂ HPO ₄ , 1 мМ ЭДТА (динатрий), 0,15 М NaCl, 0,1 М лимонной кислоты (pH 6,0). добавлен. Подсчет сперматозоидов с красной и зеленой флуоресценцией проводили на флуоресцентном цитометре Guava Easy CyteMini («Guava», США). Каждый образец оценивали трижды (5000 ячеек в каждой оценке).Индекс фрагментации ДНК (DFI) рассчитывали как процент клеток с красной флуоресценцией (сперматозоиды с фрагментированной ДНК) от общего количества клеток с красной и зеленой флуоресценцией.

Согласно пороговым значениям DFI, предложенным некоторыми авторами [7, 59], каждому участнику был назначен один из трех уровней фрагментации ДНК: нормальный (DFI <15%), слегка повышенный (15% ≤DFI <27%) и сильно повышенный. (DFI ≥ 27%). Чтобы проанализировать взаимосвязь между фрагментацией ДНК сперматозоидов и морфологией сперматозоидов, группы были объединены в несколько увеличенных и сильно увеличенных групп.

Статистический анализ

Статистический анализ данных проводился с использованием статистического пакета «Statistica» (версия 8.0). Параметры качества спермы, DFI и процент морфологических дефектов сперматозоидов не имели нормального распределения в соответствии с тестом Колмогорова-Смирнова. Данные были лучше всего преобразованы с помощью преобразования квадратного корня для количества сперматозоидов и концентрации сперматозоидов; логарифмическое преобразование для TZI и преобразование арксинуса для DFI, процент прогрессивно подвижных сперматозоидов, морфологически нормальных сперматозоидов и все дефекты морфологии сперматозоидов.Описательная статистика в таблицах, на рисунках и в тексте представлена ​​с использованием нетрансформированных данных в виде среднего значения, его стандартного отклонения и медианы с 5-м — 95-м процентилями. Коэффициенты корреляции Спирмена использовались для определения взаимосвязей между всеми изучаемыми параметрами. Для исследования влияния региона и качества спермы (или уровня DFI) на процент дефектов морфологии сперматозоидов был использован двусторонний ковариационный анализ (ANCOVA). Категориальными предикторами (факторами) в ANCOVA были место жительства и SQS (пониженный или нормальный) или уровень DFI (нормальный или повышенный), при этом возраст и время воздержания рассматривались как коварианты.Тест Дункана использовался для определения статистической значимости различий между группами. Значение p <0,05 считалось статистически значимым.

Результаты

Антропометрическая и социально-демографическая характеристика

Демографические и морфометрические характеристики исследуемых популяций представлены в Таблице 1. Как видно из Таблицы 1, мужчины из города Кемерово характеризовались более высоким возрастом и битестикулярным объемом, но меньшим временем воздержания по сравнению с участниками из Новосибирска.Не было выявлено статистически значимых различий в соотношении курильщиков сигарет, алкоголиков и мужчин с избыточным весом и ожирением. Доля мужчин, страдающих варикоцеле (I и II степени), была выше в Кемерово, чем в Новосибирске. Процент пациентов с простатитом и кистами яичек был выше в Новосибирске, чем в Кемерово.

Климат и уровень загрязнения в Новосибирске и Кемерово.

Данные по температуре воздуха и уровням загрязнения для Новосибирска и Кемерово за 2009–2014 гг. (Период исследования) представлены в таблице 2.

Город Кемерово характеризовался резким повышением объема выбросов в атмосферный воздух твердых частиц, диоксида серы, оксидов азота и оксида углерода по сравнению с Новосибирском.

Морфология сперматозоидов: региональные различия

Из 561 участника некоторые мужчины (n = 16) отказались сдавать эякулят, мужчины с азооспермией (n = 9) были исключены, поэтому было проанализировано 536 образцов спермы (278 образцов из Новосибирска и 258 из Кемерово). DFI и процент нормальных морфологических дефектов сперматозоидов и сперматозоидов представлены в таблице 3.

Значительное влияние места жительства и SQS было продемонстрировано ANCOVA для всех параметров спермы и процента морфологических дефектов сперматозоидов. Результаты ANCOVA (категориальные факторы — место жительства и SQS; ковариаты — возраст и время воздержания) представлены в таблице S1.

У жителей Кемерово был значительно более низкий процент морфологически нормальных сперматозоидов и аморфных головок и более высокий TZI, встречаемость грушевидных, удлиненных, круглых, вакуолизированных головок, сперматозоидов с аномальной акросомой, сперматозоидов с тонкой, толстой средней частью, асимметричной вставкой шеи и ERC по сравнению с мужчинам из Новосибирска (таблица 3).

Субъекты с пониженной концентрацией и / или подвижностью сперматозоидов характеризовались более высоким процентом всех дефектов сперматозоидов, кроме больших головок (таблица S2). Более того, взаимодействия места жительства и SQS были показаны для процентного содержания аморфных, грушевидных, вакуолизированных головок, ERC и асимметричной вставки хвоста. Жители Кемерово с пониженным качеством спермы характеризовались более высоким процентным содержанием грушевидной формы, вакуолизированных головок и ERC по сравнению с мужчинами с нормальным качеством спермы (рис.1), в то время как у нормальных и патозооспермических мужчин из Новосибирска различий в процентном отношении этого дефекта не обнаружено. .Однако жители Новосибирска с пониженным качеством спермы характеризовались более высоким процентом аморфной головки и асимметричных вставок хвоста по сравнению с мужчинами с нормальным качеством спермы, а для жителей Кемерово эти различия не проявлялись.

Рис. 1. Процентное соотношение нескольких морфологических дефектов спермы у мужчин из Новосибирска и Кемерово с патозооспермией и нормальным качеством спермы.

** — достоверность различий между группами (р <0,01).Сокращения: ERC - избыточная остаточная цитоплазма.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0258900.g001

Уровень фрагментации ДНК: региональные различия и взаимосвязь с морфологией сперматозоидов

Кемеровские мужчины имели более высокий DFI по сравнению с испытуемыми из Новосибирска (таблица 3). Среди участников из Кемерово 78,85% испытуемых характеризовались нормальным DFI, тогда как другие имели повышенный (12,5%) и сильно увеличенный (8,65%) DFI.Среди мужчин из Новосибирска 89,33% испытуемых имели нормальный ПНД, у других — повышенный (8,00%) и сильно повышенный (2,67%) ПДН. Различия в пропорциях субъектов с нормальным и повышенным DFI были значительными согласно критерию хи-квадрат (χ2 = 6,41, p = 0,0405).

Анализ ANCOVA с использованием места проживания и уровня фрагментации ДНК в качестве категориальных факторов показал значительное влияние уровня фрагментации ДНК на количество сперматозоидов, концентрацию сперматозоидов, прогрессирующую подвижность сперматозоидов, а также процент сперматозоидов с нормальной морфологией, TZI и частоту возникновения нескольких дефектов морфологии сперматозоидов. (Таблица S3).Субъекты с повышенным DFI имели более низкое количество сперматозоидов, концентрацию сперматозоидов, прогрессирующую подвижность сперматозоидов, процент сперматозоидов с нормальной морфологией, но более высокий TZI, процент удлиненной и двойной головки, аномальную акросому, изогнутую голову, асимметричную вставку шеи и скрученный хвост (p < 0,01) по сравнению с мужчинами с нормальным уровнем фрагментации ДНК (таблица 4).

Взаимодействие места проживания и статуса фрагментации ДНК было показано с помощью ANCOVA для количества сперматозоидов, концентрации сперматозоидов (таблица S3).Жители Новосибирска с повышенным ППИ характеризовались меньшим количеством сперматозоидов и концентрацией сперматозоидов по сравнению с мужчинами с нормальным ППИ (рис. 2). Однако у испытуемых из Кемерово различий по этим параметрам нет.

Рис. 2. Количество и концентрация сперматозоидов у мужчин Новосибирска и Кемерово с нормальным и повышенным DFI.

** — достоверность различий между группами (р <0,01). Сокращения: DFI - индекс фрагментации ДНК.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0258900.g002

Влияние факторов образа жизни на морфологию сперматозоидов и фрагментацию ДНК в Новосибирске и Кемерово

Значимые эффекты курения были продемонстрированы ANCOVA (категориальные факторы — место проживания и курение; ковариаты — возраст и время воздержания) для параметров спермы и процентного содержания нескольких морфологических дефектов сперматозоидов (таблица S4).

Курильщики характеризовались снижением количества сперматозоидов, прогрессирующей подвижностью, а также повышенным TZI, DFI и процентным содержанием удлиненных, двойных, вакуолизированных головок, сперматозоидов с асимметричным прикреплением шеи и ERC, повышенной частотой комбинированных дефектов головы и средней части, комбинированными аномалиями голова, середина и хвост в сравнении с некурящими (таблица 5).

Употребление алкоголя немного увеличило процент вакуолизированных головок, но не повлияло на процентное содержание других дефектов сперматозоидов, а также на качество спермы и фрагментацию ДНК (результаты представлены в таблицах S5 и S6).

Не было обнаружено значительных различий в количестве сперматозоидов, концентрации сперматозоидов, прогрессирующей подвижности сперматозоидов, DFI, процентном содержании сперматозоидов с нормальной морфологией и пропорциях всех дефектов сперматозоидов среди мужчин с нормальной массой тела, избыточным весом и ожирением, как показано в таблицах S7 и S8.

У субъектов, страдающих кистами яичек, наблюдалось незначительное (p <0,05) снижение количества нормальных сперматозоидов по сравнению со здоровыми мужчинами (среднее ± стандартное отклонение): 6,22 ± 3,15% и 7,39 ± 3,18% у больных и здоровых мужчин соответственно. Существенных различий в количестве сперматозоидов, подвижности сперматозоидов, TZI, SDI и доле морфологических дефектов сперматозоидов между здоровыми мужчинами и лицами с другими андрологическими заболеваниями (варикоцеле, простатит, эпидидимит) не выявлено.

Корреляция между DFI, морфологией сперматозоидов и другими параметрами спермы

Информация о корреляции между фрагментацией ДНК и процентом дефектов морфологии сперматозоидов представлена ​​в таблице S9.

При рассмотрении всей популяции DFI отрицательно коррелировал с количеством сперматозоидов (-0,27, p <0,01), концентрацией сперматозоидов (-0,30, p <0,01), прогрессирующей подвижностью (-0,46, p <0,01) и процент нормальных форм (-0,36, p <0,01). Выявлены достоверные положительные корреляции между DFI и TZI (0,38, p <0,01), процентным соотношением удлиненных (0,23, p <0,01), круглых (0,19, p <0,01) вакуолизированных головок (0,26, p <0,01), аномальная акросома (0,35, p <0,01), асимметричное прикрепление шеи (0,27, p <0.01), спиральные (0,21, p <0,01) и короткие (0,19, p <0,01).

Более того, как показано в Таблице S9, были выявлены региональные различия в корреляциях между процентами дефектов морфологии сперматозоидов и фрагментацией ДНК. Фрагментация ДНК у мужчин из Новосибирска достоверно коррелировала с количеством сперматозоидов, процентом удлиненных головок, аномальной акросомой, асимметричным прикреплением шеи, комбинированными дефектами головы, середины и хвоста, тогда как у жителей Кемерово значимых корреляций между этими параметрами не выявлено.С другой стороны, DFI у мужчин из Кемерово достоверно коррелировал с частотой ERC, но для жителей Новосибирска статистически значимой корреляции не выявлено.

Как показано в таблице S10, концентрация сперматозоидов отрицательно коррелировала с TZI (-0,39, p <0,01), процентом дефектов акросомы (-0,29, p <0,01), изогнутой головкой (-0,31, p <0,01) и коротким хвостом (- 0,34, р <0,01). Значимые взаимосвязи были показаны между прогрессирующей подвижностью сперматозоидов и TZI (-0,56, p <0.01), пропорции нормальных сперматозоидов (0,67, p <0,01), удлиненные головки (-0,18, p <0,01), дефекты акросомы (-0,38, p <0,01), изогнутые головки (-0,37 , p <0,01), ERC (-0,23, p <0,01), спиральный (-0,36, p <0,01) и короткие (-0,45, p <0,01) хвосты (таблица S10).

Процент грушевидной головки положительно коррелирует с процентом удлиненных, вакуолизированных головок, изогнутой головки и ERC (таблица S11).

Обсуждение

В ходе исследования выявлены значительные региональные различия в уровне фрагментации ДНК и встречаемости морфологических дефектов сперматозоидов у жителей городов с разным уровнем загрязнения атмосферного воздуха.Для жителей Кемерово характерны повышенная фрагментация ДНК, плохая морфология сперматозоидов и повышенная частота морфологических дефектов головы (грушевидная, удлиненная, округлая голова, аномальная акросома и вакуолизированный хроматин), асимметричной вставки шеи и ERC. Предыдущее исследование показало, что у мужчин из общей популяции в Кемерово снижено количество сперматозоидов, концентрация и прогрессирующая подвижность сперматозоидов, а также уровень тестостерона и ингибина B в сыворотке [56]. Региональные вариации качества спермы и морфологии сперматозоидов считаются результатом комплексного влияния различных условий окружающей среды в месте проживания, таких как климат, микроэлементы в воде или пище, загрязнение окружающей среды, а также факторы образа жизни [51] и связанные с этим этнические особенности. с генетическим фоном [60].Следует отметить, что Новосибирск и Кемерово расположены в одинаковых климатических условиях и характеризуются сходной этнической принадлежностью и социокультурной идентичностью. Однако Кемерово отличается повышенным загрязнением воздуха по сравнению с Новосибирском из-за наличия большого количества предприятий химической и угольной промышленности [55, 56]. Производственная деятельность приводит к увеличению выбросов в атмосферу твердых частиц, оксидов азота SO ₂ в г. Кемерово. Следует отметить, что мы исследовали городское население в целом, подверженное воздействию сложной смеси загрязняющих веществ от промышленной деятельности и транспорта (газы, ТЧ, полициклические углеводороды, тяжелые металлы и т. Д.).), а также негативные факторы образа жизни. Поэтому трудно оценить вклад определенных загрязнителей или других негативных факторов в повреждение спермиогенеза в исследуемых популяциях. В частности, наши результаты показывают, что курение отрицательно влияет на спермиогенез, что приводит к снижению количества сперматозоидов, подвижности сперматозоидов, повышению DFI, TZI и возникновению удлиненных, вакуолизированных головок, сперматозоидов с ERC и асимметричной вставки шеи у курильщиков. Предыдущие исследования показали отрицательное влияние курения на количество сперматозоидов, подвижность и морфологию сперматозоидов, а также на фрагментацию ДНК [61, 62].Эти данные свидетельствуют о том, что курение может способствовать нарушению морфологии сперматозоидов у мужчин из Кемерово и Новосибирска. Однако, учитывая отсутствие различий в частоте курения, а также других негативных факторах образа жизни (потребление алкоголя, ожирение) в Новосибирске и Кемерово, вероятно, что повышенное загрязнение воздуха в Кемерово является основным фактором выявленных региональных различий. в морфологии сперматозоидов.

Сообщалось, что загрязнение воздуха отрицательно влияет на количество, подвижность и морфологию сперматозоидов [44], а также на фрагментацию ДНК [63] и приводит к увеличению числа случаев дефектов головки сперматозоидов [43, 64–68].Наши результаты в целом согласуются с предыдущими доказательствами и предполагают, что загрязнение окружающей среды влияет на морфогенез сперматозоидов, причем распределение дефектов сперматозоидов в предыдущих и наших исследованиях является конкретным. Преобладание определенных дефектов сперматозоидов, вероятно, отражает природу загрязнения и ряд других факторов, включая уровень загрязнения, этническую принадлежность, образ жизни и т. Д. В нашем исследовании загрязнение окружающей среды территории было связано с увеличением числа случаев удлиненных и грушевидных головок и нарушениями акросомы.Пириформные и удлиненные головки считаются стресс-индуцированными аномалиями, возникающими в результате ошибок спермиогенеза из-за негативных внешних факторов [22]. Было показано, что варикоцеле [69, 70], тяжелый психологический стресс [71], гипертермия мошонки [72] связаны с увеличением частоты удлиненных головок. На ультраструктурном уровне удлиненные и грушевидные головки характеризуются чрезмерным удлинением ядра, наличием дополнительных мембранных слоев между внешним и внутренним листками ядерной оболочки, а также плохо конденсированным хроматином [35, 70, 73].

Было предложено несколько механизмов, объясняющих влияние загрязнения окружающей среды на качество спермы, включая окислительный стресс [63, 74, 75], образование аддуктов ДНК [44, 76] и гормональный дисбаланс [77, 78]. Было показано, что у испытуемых из Кемерово несколько снижен уровень тестостерона в сыворотке крови и существенно снижен уровень ингибина В по сравнению с мужчинами из Новосибирска [56]. Пониженный уровень ингибина B связан с повреждением клеток Сертоли и сперматогенных клеток [79, 80] и является маркером повреждения яичек из-за токсического действия поллютантов [81, 82].Следовательно, пониженный уровень ингибина B может указывать на нарушение клеток Сертоли и сперматогенеза у человека из Кемерово из-за промышленного загрязнения. Как показали экспериментальные исследования на грызунах, загрязнение окружающей среды может напрямую влиять на клетки Сертоли [44, 83, 84], что приводит к вакуолизации клеток Сертоли, отслоению и отделению половых клеток от подлежащего эпителия, нарушению сигнальных путей между Сертоли и зародышевыми клетками, нарушению гемато-семенникового барьера и нарушение иммунологической микросреды в семеннике [85].Кроме того, токсические вещества окружающей среды вызывают нарушение цитоскелета в клетках Сертоли [86–88] и могут влиять на морфологию сперматозоидов. Известно, что формирование головки сперматозоида во время спермиогенеза зависит от точного взаимодействия структур цитоскелета сперматид и окружающих клеток Сертоли. Эктоплазматические специализации клеток Сертоли образованы слоями пучков актина, и эта структура уменьшает их диаметр, прикладывая внешние силы для уплотнения ядра сперматид во время удлинения сперматид.Более того, акроплаксома и манкетка являются переходными структурами цитоскелета, которые образуются в процессе спермиогенеза [12]. Акроплаксома модулирует экзогенные силы, генерируемые клетками Сертоли. Маргинальное кольцо акроплаксомы и перинуклеарное кольцо манжеты уменьшают свой диаметр, поскольку они постепенно опускаются вдоль ядра к хвосту сперматиды в виде застежки-молнии, что способствует конденсации и формированию ядер [10]. Более того, акроплаксома прикрепляет развивающуюся акросому к ядерной оболочке сперматид [12].Микротрубочки манжетки необходимы для передачи белка от ядра сперматиды к развивающемуся хвосту. Этот внутриманкетный транспорт, как известно, необходим для формирования головы и сборки хвоста [10, 89]. Исследования на грызунах показали, что истощение генов, кодирующих белки, связанные с микротрубочками, приводит к чрезмерному удлинению манжеты и головки сперматозоида [90], при этом внешний вид сперматозоидов напоминает удлиненную и грушевидную головку у человека. Принимая во внимание эти доказательства, разумно предположить, что чрезмерное удлинение головы и нарушение формирования акросом могут быть вызваны нарушением функции манкетки и акроплаксомы в сперматидах и / или цитоскелете клеток Сертоли, а также связанных с ними моторных или сигнальных белков. нарушения микросреды в семенниках из-за загрязнения окружающей среды исследуемой популяции в Кемерово.Следует отметить, что эта гипотеза нуждается в экспериментальной проверке, поскольку регуляция формы головки сперматозоида — сложный процесс, требующий множества белков.

Наше исследование показало, что у кемеровцев был повышенный уровень фрагментации ДНК по сравнению с мужчинами из Новосибирска. Как показано в Таблице 6, DFI, полученные в нашем исследовании для жителей Новосибирска и Кемерово, были аналогичны данным, полученным для фертильных, субфертильных субъектов и мужчин из общей популяции из европейских и азиатских стран [91–99].Средние значения DFI в исследуемых нами популяциях можно рассматривать как «низкие уровни фрагментации ДНК» [7, ​​59] и предполагать, что наблюдаемое увеличение DFI у большинства мужчин г. Кемерово является довольно умеренным без серьезных негативных последствий для фертильности. Однако повышенная фрагментация ДНК и процент вакуолизированных головок, рассматриваемых как индикаторы плохой целостности хроматина [98], свидетельствуют о нарушении конденсации хроматина у жителей Кемерово.

Наше исследование показало, что мужчины с пониженной подвижностью и / или концентрацией сперматозоидов характеризуются плохой морфологией сперматозоидов и повышенной частотой большинства морфологических дефектов.Повышенный уровень фрагментации ДНК был связан с повышенным TZI, частотой аномальной акросомы, спирального и короткого хвоста, а также комбинированными дефектами средней части головы и хвоста. Сообщалось о взаимосвязи между морфологией сперматозоидов и подвижностью сперматозоидов [99]. Кроме того, было показано, что повышенная фрагментация ДНК связана с плохой морфологией сперматозоидов и повышенной частотой дефектов головы и хвоста [24, 100–104], продукции ROS и нарушением уплотнения хроматина [24]. Авторы предположили, что выявленные ассоциации являются результатом аномального ядерного ремоделирования, приводящего к аномальной морфологии сперматозоидов, увеличению продукции АФК в сперме, а также уязвимости ДНК к окислительной атаке из-за плохой конденсации хроматина [24].Результаты нашего поперечного исследования дополняют эти доказательства, показывая, что географическое положение влияет на взаимосвязь между обычными параметрами спермы, морфологией сперматозоидов и фрагментациями ДНК. DFI был тесно связан с количеством сперматозоидов и дефектами акросомы у мужчин из Новосибирска, но не из Кемерово. Следует отметить, что в современной литературе существуют расхождения в отношении связи морфологии сперматозоидов с другими параметрами спермы и фертильностью, поскольку об этом сообщалось в нескольких исследованиях, тогда как в других не было обнаружено различий в морфологии сперматозоидов у мужчин с различным репродуктивным статусом [32–34] и ДНК. уровень фрагментации [30, 31].Считается, что противоречивые доказательства вызваны различиями в методе отбора исследуемых образцов (мужчины с доказанной фертильностью, пациенты с бесплодием, мужчины из общей популяции и т. Д.) И / или методологией оценки морфологии сперматозоидов, включая критерии классификации, технику окрашивания, опыт исследователя и т. Д. [ 35]. В нашем исследовании протокол набора, методы оценки количества сперматозоидов, подвижности сперматозоидов и фрагментации ДНК, техники окрашивания были одинаковыми, оценка морфологии сперматозоидов проводилась единственным опытным исследователем с использованием стандартных критериев классификации, полученные данные корректировались с учетом возраста и возраста. время воздержания.Следовательно, наиболее вероятно, что наши данные свидетельствуют о наличии региональных особенностей в проявлении взаимосвязей между паттерном морфологии сперматозоидов, фрагментацией ДНК сперматозоидов и обычными параметрами спермы. Причина этого явления неясна. Возможно, что различия во внешних факторах, влияющих на популяцию в определенных регионах, могут по-разному влиять на спермиогенез, ослабляя или увеличивая силу взаимосвязи между параметрами спермы. Настоящие результаты предполагают, что необходимо учитывать географическое положение, чтобы понять текущие свидетельства морфологической картины как индикатора нарушения функции сперматозоидов.

Заключение

Проведенное исследование показало значительную региональную изменчивость в процентах нескольких морфологических дефектов сперматозоидов и фрагментации ДНК у мужчин из общей популяции, проживающей в городах с разным уровнем загрязнения окружающей среды, расположенных в Западной Сибири. Для жителей Кемерово характерны повышенная фрагментация ДНК, плохая морфология сперматозоидов и повышенная заболеваемость грушевидной, удлиненной, круглой головкой, аномальной акросомой и вакуолизированным хроматином, асимметричной вставкой шеи и ERC, вероятно, из-за повышенного загрязнения окружающей среды в Кемерово.Кроме того, были показаны региональные особенности во взаимосвязи между морфологией сперматозоидов, количеством сперматозоидов, подвижностью и фрагментацией ДНК, что свидетельствует о важности изучения паттернов морфологии сперматозоидов в общих популяциях мужчин из разных регионов.

Вспомогательная информация

S1 Таблица. Влияние статуса качества спермы на DFI и процент дефектов морфологии сперматозоидов (результаты ANCOVA).

Жирным шрифтом обозначены значительные (p <0,05) влияния, выявленные ANCOVA.SQS – статус качества спермы: нормозооспермия (концентрация сперматозоидов и процент прогрессивно подвижных сперматозоидов равны или превышают нижние контрольные пределы) и патозооспермия (концентрация сперматозоидов <15 млн / мл и / или процент прогрессивно подвижных сперматозоидов <32%). ERC - избыточная остаточная цитоплазма.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0258900.s001

(DOCX)

S2 Стол. Взаимосвязь между качеством спермы и морфологией спермы.

Результаты основаны на необработанных данных.Дисперсионный анализ используется для сравнения всех параметров. Значимые (p <0,05) различия между группами выделены жирным шрифтом. Сокращения: SD - стандартное отклонение; (5–95) - 5–95 процентиль; DFI - индекс фрагментации ДНК; TZI – индекс тератозооспермии; ERC - избыточная остаточная цитоплазма.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0258900.s002

(DOCX)

S3 Таблица. Влияние уровня фрагментации ДНК на качество спермы и процент дефектов морфологии сперматозоидов (результаты ANCOVA).

Значимые (p <0,05) эффекты факторов выделены жирным шрифтом. Сокращения: DFI – индекс фрагментации ДНК; TZI – индекс тератозооспермии; ERC - избыточная остаточная цитоплазма.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0258900.s003

(DOCX)

S4 Таблица. Влияние курения на качество и морфологию сперматозоидов (результаты ANCOVA).

Значимые (p <0,05) эффекты факторов выделены жирным шрифтом. Сокращения: DFI – индекс фрагментации ДНК; TZI – индекс тератозооспермии; ERC - избыточная остаточная цитоплазма.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0258900.s004

(DOCX)

S5 Таблица. Влияние употребления алкоголя на качество и морфологию сперматозоидов (результаты ANCOVA).

Значимые (p <0,05) эффекты факторов выделены жирным шрифтом. Сокращения: DFI – индекс фрагментации ДНК; TZI – индекс тератозооспермии; ERC - избыточная остаточная цитоплазма.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0258900.s005

(DOCX)

S6 Таблица. Влияние употребления алкоголя на качество и морфологию сперматозоидов.

Результаты основаны на необработанных данных. Дисперсионный анализ используется для сравнения всех параметров. Значимые (p <0,05) различия между группами выделены жирным шрифтом. Сокращения: SD - стандартное отклонение; (5–95) - 5–95 процентиль; DFI - индекс фрагментации ДНК; TZI – индекс тератозооспермии; ERC - избыточная остаточная цитоплазма.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0258900.s006

(DOCX)

S7 Таблица. Влияние ожирения на качество и морфологию сперматозоидов (результаты ANCOVA).

Значимые (p <0,05) эффекты факторов выделены жирным шрифтом. Сокращения: DFI – индекс фрагментации ДНК; TZI – индекс тератозооспермии; ERC - избыточная остаточная цитоплазма.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0258900.s007

(DOCX)

S8 Таблица. Влияние ожирения на качество и морфологию сперматозоидов.

Результаты основаны на необработанных данных. Дисперсионный анализ используется для сравнения всех параметров. Значимые (p <0,05) различия между группами выделены жирным шрифтом.Сокращения: SD - стандартное отклонение; (5–95) - 5–95 процентиль; DFI - индекс фрагментации ДНК; TZI – индекс тератозооспермии; ERC - избыточная остаточная цитоплазма.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0258900.s008

(DOCX)

S11 Стол. Коэффициенты корреляции Спирмена между процентами различных дефектов морфологии сперматозоидов.

Полужирным шрифтом обозначены значимые (p <0,05) коэффициенты корреляции. DH – двойная головка; ЧД - наклоненная голова; ERC - избыточная остаточная цитоплазма; ANI – асимметричная вставка шеи; ДТ - двойной хвост; КТ - спиральный хвост; СТ – короткий хвост.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0258900.s011

(DOCX)

Благодарности

Мы благодарим врачей Андрея Ерковича, Наталью Ворошилову, Наталью Кузнезову за координацию набора и проведения медицинского осмотра участников, г-жу Наталью Гуторову за помощь в сборе анкет, г-жу Дарью Татару за оценку фрагментации ДНК. Благодарим всех волонтеров, участвовавших в исследовании.

Список литературы

1. 1.Agarwal A, Mulgund A, Hamada A, Chyatte MR. Уникальный взгляд на мужское бесплодие во всем мире. Репрод Биол Эндокринол 2015; 13: 1–9. pmid: 25567742
2. 2. Всемирная организация здравоохранения. Лабораторное руководство по исследованию и обработке спермы человека. 5-е изд. Женева: ВОЗ; 2010.
3. 3. Barratt CLR, Björndahl L, De Jonge CJ, Lamb DJ, Martini FO, McLachlan R, et al. Диагноз мужского бесплодия: анализ данных в поддержку разработки глобальных рекомендаций ВОЗ и возможностей для будущих исследований.Обновление Hum Reprod 2017; 23: 660–80. pmid: 28981651
4. 4. Ковач Дж., Смит Р., Каджипе М., Лэмб Д., Липшульц Л. Мужчины с полным отсутствием нормальной морфологии сперматозоидов демонстрируют высокие показатели успеха без вспомогательной репродукции. Азиатский Дж. Андрол 2017; 19: 39–42. pmid: 27751992
5. 5. Эстевес С.К., Зини А., Трус Р.М., Эвенсон Д.П., Госалвес Дж., Льюис С.Э.М. и др. Тестирование на фрагментацию ДНК сперматозоидов: сводные доказательства и рекомендации по клинической практике. Андрология. 2021; 53: e13874.pmid: 33108829
6. 6. Cissen M, Wely MV, Scholten I., Mansell S, Bruin JP, Mol BW и др. Измерение фрагментации ДНК сперматозоидов и клинических результатов вспомогательной репродукции: систематический обзор и метаанализ. PLoS One. 2016; 11: e0165125. pmid: 27832085
7. 7. Эвенсон Д.П. Анализ структуры хроматина сперматозоидов (SCSA®) и другие тесты на фрагментацию ДНК сперматозоидов для оценки целостности ядерной ДНК сперматозоидов в отношении фертильности. Anim Reprod Sci 2016; 169: 56–75.pmid: 26919909
8. 8. Нето FTL, Бах П.В., Наджари Б.Б., Ли П.С., Гольдштейн М. Сперматогенез у людей и его влияющие факторы. Semin Cell Dev Biol 2016; 59: 10–26. pmid: 27143445
9. 9. Кучакулла М., Нарасимман М., Ходаморади К., Хосравизаде З., Рамасами Р. Как дефектный сперматогенез влияет на целостность ДНК сперматозоидов. Андрология 2021; 53: e13615. pmid: 32324913
10. 10. Тевес М.Э., Ролдан Э.С., Крапф Д., Штраус Дж. Ф. III, Бхагат В., Сапао П. Дифференциация сперматозоидов: роль транспорта белков.Int J Mol Sci 2020; 21: 3702. pmid: 32456358
11. 11. Chemes HE. Фенотипические разновидности патологии сперматозоидов: генетические аномалии или влияние окружающей среды могут приводить к различным паттернам аномальных сперматозоидов. Anim Reprod Sci 2018; 194: 41–56. pmid: 29753534
12. 12. Кирзенбаум АЛ, Ривкин Э., Трес ЛЛ. Молекулярная биология формирования головки сперматозоида. Soc Reprod Fertil Suppl 2007; 65: 33–43. pmid: 17644953
13. 13. Chemes HE, Alvarez Sedo C. Рассказы о головных болях в хвосте и сперматозоидах: изменение представлений о прогностическом значении патологий сперматозоидов, влияющих на голову, шею и хвост.Азиатский Дж. Андрол 2012; 14: 14–23. pmid: 22198630
14. 14. Chemes HE, Rawe VY. Создание аномальных сперматозоидов: клеточные и молекулярные механизмы, лежащие в основе патологического спермиогенеза. Cell Tissue Res 2010; 341: 349–57. pmid: 20596874
15. 15. Гамильтон TRDS Assumpção MEOD. Фрагментация ДНК сперматозоидов: причины и идентификация. Зигота. 2020; 28: 1–8. pmid: 31603068
16. 16. Тамбуррино Л., Марчиани С., Монтойя М., Элиа Марино Ф., Натали И., Камби М. и др.Механизмы и клинические корреляты повреждения ДНК сперматозоидов. Азиатский Дж. Андрол 2012; 14: 24–31. pmid: 22138903
17. 17. Ренган А.К., Агарвал А., ван дер Линде М., дю Плесси СС. Исследование избыточной остаточной цитоплазмы в сперматозоидах человека и ее отличия от цитоплазматической капли. Репрод Биол Эндокринол 2012; 10: 1–8. pmid: 22233680
18. 18. Agarwal A, Tvrda E, Sharma R. Взаимосвязь между тератозооспермией, семенным оксидативным стрессом и мужским бесплодием.Репрод Биол Эндокринол. 2014; 12:45 pmid: 24884815
19. 19. Галено Л. Р., Ализаде А., Древет Дж. Р., Шахверди А., Валожерди М. Р. Окисление ДНК сперматозоидов и мужское бесплодие. Антиоксиданты 2021; 10: 1–15.
20. 20. Auger J, Eustache F, Andersen AG, Irvine DS, Jørgensen N, Skakkebaek NE и др. Морфологические дефекты спермы, связанные с окружающей средой, образом жизни и историей болезни 1001 партнера беременных женщин-мужчин из четырех европейских городов. Hum Reprod 2001; 16: 2710–7.pmid: 11726600
21. 21. Оже Дж., Жуанне П., Юсташ Ф. Другой взгляд на морфологию сперматозоидов человека. Hum Reprod. 2016; 31: 10–23. pmid: 26472152
22. 22. Menkveld R, Holleboom CAG, Rhemrev JPT. Измерение и значение морфологии сперматозоидов. Азиатский Дж. Андрол 2011; 13 (1): 59–68. pmid: 21076438
23. 23. Parinaud J, Vieitez G, Moutaffian H, Richoilley G, Milhet P. Взаимосвязь между параметрами подвижности, морфологией и акросомным статусом сперматозоидов человека.Hum Reprod 1996; 11: 1240–3. pmid: 8671432
24. 24. Оумайма А., Тесним А., Зохра Х, Амира С., Инес З., Сана С. и др. Исследование происхождения морфологических дефектов сперматозоидов: окислительные атаки, незрелость хроматина и фрагментация ДНК. Environ Sci Pollut Res 2018; 25: 13775–6.
25. 25. Лу Дж. К., Джинг Дж., Чен Л., Гэ Ю. Ф., Фэн РХ, Лян Ю. Дж. И др. Анализ факторов, связанных с индексом фрагментации ДНК сперматозоидов (DFI): отчет о 1010 субфертильных мужчинах в Китае. Репрод Биол Эндокринол 2018; 16: 1–9.pmid: 29310676
26. 26. Дариш Б., Горопевнек А., Хойник Н., Влайсавлевич В. Морфологические аномалии сперматозоидов как индикаторы фрагментации ДНК и оплодотворения в ИКСИ. Arch Gynecol Obstet 2010; 281: 363–7. pmid: 19504115
27. 27. Utsuno H, Oka K, Yamamoto A, Shiozawa T. Оценка формы головки сперматозоидов при большом увеличении выявила корреляцию фрагментации ДНК сперматозоидов с аберрантной эллиптичностью и угловатостью головки. Fertil Steril 2013; 99: 1573–1580. pmid: 23477680
28. 28.Евгений Э., Харалабопулос К., Асимакопулос Б. Фрагментация ДНК спермы человека и ее корреляция с обычными параметрами спермы. J Reprod Infertil 2014; 15: 2–14. pmid: 24696791
29. 29. Митчелл В., Сигала Дж., Бюллетень С, Джумо Ф., Барботин А.Л., Дюамель А. и др. Морфологические характеристики жгутика сперматозоидов при световой микроскопии могут быть связаны с аксонемными аномалиями. Андрология 2015; 47: 214–20. pmid: 24611953
30. 30. Трисини А.Т., Сингх Н.П., Долг С.М., Хаузер Р.Взаимосвязь между параметрами спермы человека и повреждением дезоксирибонуклеиновой кислоты, оцененная с помощью анализа нейтральных комет. Fertil Steril 2004; 82: 1623–32. pmid: 15589869
31. 31. Доннелли Е.Т., Кристин Стил Е., МакКлюр Н., Льюис СЭМ. Оценка целостности ДНК и морфологии эякулированных сперматозоидов фертильных и бесплодных мужчин до и после криоконсервации. Hum Reprod 2001; 16: 1191–9. pmid: 11387291
32. 32. Патель П., Карраскильо Р., Мадхусуданан В., Дадун С., Патель А., Смит Н. и др.Влияние аномальной морфологии сперматозоидов на рождаемость после внутриматочной инсеминации. Дж. Урол 2019; 202: 801–5. pmid: 31009287
33. 33. Лемменс Л., Кос С., Бейер С., Бринкман Дж. В., ван дер Хорст Ф. Л., ван ден Ховен Л. и др. Прогностическое значение морфологии сперматозоидов и количества прогрессивно подвижных сперматозоидов для исходов беременности при внутриматочной инсеминации. Fertil Steril 2016; 105: 1462–8. pmid: 26930619
34. 34. Эрдем М., Эрдем А., Мутлу М.Ф., Озисик С., Йылдыз С., Гулер И. и др.Влияние морфологии сперматозоидов на исход циклов внутриматочной инсеминации гонадотропинами при необъяснимой и мужской субфертильности. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2016; 197: 120–124. pmid: 26745391
35. 35. Гатимель Н., Моро Дж., Парино Дж., Леандри РД. Морфология сперматозоидов: оценка, патофизиология, клиническая значимость и состояние дел в 2017 году. Андрология. 2017; 5: 845–62. pmid: 28692759
36. 36. Данис РБ, Сампласки МК. Морфология сперматозоидов: история, проблемы и влияние на естественную и вспомогательную фертильность.Curr. Урол. Rep.2019; 20:43. pmid: 31203470
37. 37. Salas-Huetos A, Maghsoumi-Norouzabad L, James ER, Carrell DT, Aston KI, Jenkins TG и др. Мужское ожирение, параметры спермы и репродуктивные гормоны: обновленный систематический обзор и совместный метаанализ. Obes Rev 2021; 22: 1–33. pmid: 32705766
38. 38. Перейра СК, Крисостомо Л., Соуза М., Оливейра П.Ф., Алвес М.Г. Болезни обмена веществ влияют на мужскую репродуктивную функцию и вызывают в гаметах сигнатуры, которые могут поставить под угрозу здоровье потомства.Environ Epigenetics 2020; 6: 1–18. pmid: 33324496
39. 39. Шарма Р., Харлев А., Агарвал А., Эстевес СК. Курение сигарет и качество спермы: новый метаанализ, изучающий влияние лабораторных методов Всемирной организации здравоохранения 2010 г. на исследование спермы человека. Eur Urol 2016; 70: 635–645. pmid: 27113031
40. 40. Рахбан Р., Неф С. Региональные различия в качестве спермы молодых мужчин: обзор влияния факторов окружающей среды и образа жизни во время внутриутробной жизни и во взрослом возрасте.Базовый Clin Androl 2020; 30: 1–15. pmid: 31993202
41. 41. Манн У., Шифф Б., Патель П. Причины снижения мужской фертильности во всем мире. Curr Opin Urol 2020; 30: 296–301. pmid: 32168194
42. 42. Пиццол Д., Фореста С., Гаролла А., Демуртас Дж., Тротт М., Бертольдо А. и др. Загрязняющие вещества и качество спермы: систематический обзор и метаанализ. Environ Sci Pollut Res Int. 2021; 28: 4095–4103. pmid: 33196997
43. 43. Блум М.С., Уиткомб Б.В., Чен З., Е А., Каннан К., Бак Луи Г.М.Связь между концентрацией фталата в моче и параметрами качества спермы в общей популяции. Hum Reprod 2015; 30: 2645–57. pmid: 26350610
44. 44. Лафуэнте Р., Гарсиа-Блакес Н., Жакмен Б., Чека Массачусетс. Загрязнение наружного воздуха и качество спермы. Fertil Steril 2016; 106: 880–96. pmid: 27565259
45. 45. Рубес Дж., Селеван С.Г., Эвенсон Д.П., Зудова Д., Воздова М., Зудова З. и др. Эпизодическое загрязнение воздуха связано с повышенной фрагментацией ДНК в сперме человека без других изменений качества спермы.Hum Reprod 2005; 20: 2776–83. pmid: 15980006
46. 46. Джи Х, Мяо М., Лян Х, Ши Х, Руань Д., Ли И и др. Воздействие бисфенола А из окружающей среды на стандартные параметры спермы и характеристики движения сперматозоидов у фертильных мужчин. Sci Rep 2018; 8: 1–9. pmid: 29311619
47. 47. Хуанг Г, Чжан Ц., Ву Х, Ван Ц., Чен И, Го П и др. Качество спермы и воздействие загрязнения окружающего воздуха: ретроспективное когортное исследование в южной провинции Китая. Environ Res 2020; 188: 109756.pmid: 32531526
48. 48. Йоргенсен Н., Андерсен А.Г., Юсташ Ф., Ирвин Д.С., Суоминен Дж., Петерсен Дж. Х. и др. Региональные различия в качестве спермы в Европе. Hum Reprod 2001; 16: 1012–9. pmid: 11331653
49. 49. Erenpreiss J, Punab M, Zilaitiene B, Hlevicka S, Zayakin P, Matulevicius V, et al. Качество спермы молодых мужчин из общей популяции в странах Балтии. Hum Reprod 2017; 32: 1334–40. pmid: 28383690
50. 50. Ли ВН, Цзя ММ, Пэн YQ, Дин Р, Фан ЛК, Лю Г.Структура качества спермы и возрастной порог: ретроспективное перекрестное исследование 71 623 бесплодных мужчин в Китае в период с 2011 по 2017 год. Reprod Biol Endocrinol 2019; 17: 1–8. pmid: 30606208
51. 51. Skakkebaek NE, Rajpert-De Meyts E, Buck Louis GM, Toppari J, Andersson AM, Eisenberg ML, et al. Нарушения мужской репродукции и тенденции фертильности: влияние окружающей среды и генетическая предрасположенность. Physiol Rev 2015; 96: 55–97.
52. 52. Zhou N, Cui Z, Yang S, Han X, Chen G, Zhou Z и др.Загрязнение воздуха и снижение качества спермы: сравнительное исследование городских и сельских районов Чунцина. Environ Pollut 2014; 187: 145–52. pmid: 244

53. 53. Стронати А., Маникарди Г.К., Чекати М., Бордиккья М., Ферранте Л., Спано М. и др. Взаимосвязь между фрагментацией ДНК сперматозоидов, маркерами апоптоза сперматозоидов и уровнями CB-153 и p, p’-DDE в сыворотке крови в популяциях европейцев и инуитов. Репродукция 2006; 132: 949–58. pmid: 17127755
54. 54. Спано М., Колстад А.Х., Ларсен С.Б., Корделли Э., Летер Дж., Гиверкман А. и др.Применимость проточно-цитометрического анализа структуры хроматина сперматозоидов в эпидемиологических исследованиях. Hum Reprod 1998; 13: 2495–505. pmid: 9806274
55. 55. Голохваст К.С., Манаков Ю.А., Быков А.А., Чайка В.В., Никифоров П.А., Рогулин Р.С. и др. Некоторые характеристики пылевых частиц в атмосфере города Кемерово по данным загрязнения снежного покрова. IOP Conf Ser Earth Environ Sci 2017; 87: 0422005.
56. 56. Осадчук Л., Шантанова Л., Троев И., Клещев М., Осадчук А.Региональные и этнические различия в качестве спермы и репродуктивных гормонов в России: сибирское популяционное когортное исследование молодых мужчин Андрология. 2021; 10.1111 / andr.13024. pmid: 33884771
57. 57. Осадчук Л., Типисова Е., Клещев М., Горенко И., Осадчук А. Изучение качества спермы, уровней репродуктивных гормонов и липидов у мужчин из Архангельска, города на севере европейской части России. Am J Mens Health 2020; 14: 1557988320939714. pmid: 32812503
58. 58. Ротманн С.А., Борт А.М., Куигли Дж., Подушка Р.Классификация морфологии сперматозоидов: рациональный метод схем, принятых Всемирной организацией здравоохранения. Методы Мол Биол 2013; 927: 27–37. pmid: 22992901
59. 59. Эвенсон Д.П., Йост Л.К., Маршалл Д., Зинаман М.Дж., Клегг Э., Первис К. и др. Использование анализа структуры хроматина сперматозоидов в качестве диагностического и прогностического инструмента в клинике репродуктивной функции человека. Hum Reprod. 1999; 14: 1039–49. pmid: 10221239
60. 60. Клещев М., Осадчук А., Шантанова Л., Троев И., Осадчук Л.Этнические различия в разнообразии морфологических дефектов сперматозоидов у мужчин Восточной Сибири, Россия. Репрод Биол Эндокринол.
61. 61. Taha EA, Ez-Aldin AM, Sayed SK, Ghandour NM, Mostafa T. Влияние курения на жизнеспособность сперматозоидов, целостность ДНК, оксидативный стресс семенной жидкости, цинк у фертильных мужчин. Урология. 2012. 80 (4): 822–5. pmid: 23021663
62. 62. Мостафа Р.М., Насраллах Ю.С., Хассан М.М., Фарраг А.Ф., Маджзуб А., Агарвал А. Влияние курения сигарет на параметры семени человека, структуру хроматина сперматозоидов и конденсацию.Андрология. 2018; 50 (3). pmid: 2

    82

63. 63. Bosco L, Notari T, Ruvolo G, Roccheri MC, Martino C, Chiappetta R и др. Фрагментация ДНК сперматозоидов: ранний и надежный маркер загрязнения воздуха. Environ Toxicol Pharmacol 2018; 58: 243–9. pmid: 29448163
64. 64. Эскенази Б., Вайробек А.Дж., Фенстер Л., Кац Д.Ф., Сэдлер М., Ли Дж. И др. Исследование влияния воздействия перхлорэтилена на качество спермы у рабочих химчистки. Am J Ind Med 1991; 20: 575–91. pmid: 1793101
65. 65.Вайробек А.Дж., часовщик Дж., Гордон Л. Аномалии формы сперматозоидов у сотрудников, подвергшихся воздействию карбарила. Environ Health Perspect 1981; 40: 255–65. pmid: 6791917
66. 66. Рэтклифф Дж. М., Шредер С. М., Стинланд К., Клапп Д. Е., Тернер Т., Хорнунг Р. В.. Качество спермы рабочих папайи, подвергшихся длительному воздействию дибромида этилена. Br J Ind Med 1987; 44: 317–26. pmid: 3297130
67. 67. Nobles CJ, Schisterman EF, Ha S, Kim K, Mumford SL, Buck Louis GM и др. Загрязнение окружающего воздуха и качество спермы.Environ Res 2018; 163: 228–36. pmid: 29459305
68. 68. Hansen C, Luben TJ, Sacks JD, Olshan A, Jeffay S, Strader L и др. Влияние загрязнения окружающего воздуха на качество спермы. Environ Health Perspect 2010; 118: 203–9. pmid: 20123611
69. 69. Прасиворавонг Дж., Марчелли Ф., Лемэтр Л., Пиньи П., Рамдейн Н., Пирс М.С. и др. Благоприятное влияние эмболизации варикоцеле на параметры спермы. Базовый Clin Androl 2014; 24: 1–6. pmid: 25780577
70. 70. Prisant N, Escalier D, Soufir JC, Morillon M, Schoevaert D, Misrahi M и др.Ультраструктурные дефекты ядер и повышенные анеуплоидии хромосом в сперматозоидах с удлиненными головками. Hum Reprod 2007; 22: 1052–9. pmid: 17208942
71. 71. Фенстер Л., Кац Д.Ф., Вайробек А.Дж., Пипер С., Ремпель Д.М., Оман Д. и др. Влияние психологического стресса на качество спермы человека. Дж. Андрол. 1997; 18: 194–202. pmid:

    14

72. 72. Mieusset R, Bujan L, Mansat A, Pontonnier F, Grandjean H. Влияние искусственного крипторхизма на морфологию сперматозоидов. Fertil.Steril.1987; 47: 150–5. pmid: 3792568
73. 73. Огер Дж. Оценка морфологии сперматозоидов человека: лучшие модели, аутсайдеры или биометрия? Азиат Дж. Андрол. 2010; 12: 36–46. pmid: 20111080
74. 74. Дэн З., Чен Ф., Чжан М., Лан Л., Цяо З., Цуй Й и др. Связь между загрязнением воздуха и качеством спермы: систематический обзор и метаанализ. Environ Pollut 2016; 208: 663–9. pmid: 26552539
75. 75. Радван М., Юревич Дж., Поланска К., Собала В., Радван П., Боченек М. и др.Воздействие загрязнения окружающего воздуха — влияет ли оно на качество спермы и уровень репродуктивных гормонов? Энн Хум Биол 2016; 43: 50–6. pmid: 26211899
76. 76. Юревич Дж., Дзевирска Э., Радван М., Ханке В. Загрязнение воздуха из естественных и антропных источников и мужская фертильность. Репрод Биол Эндокринол 2018; 16 (1): 109. pmid: 30579357
77. 77. Раштиан Дж., Чавкин Д.Е., Мери З. Загрязнение воды и почвы как детерминант качества / загрязнения воды и продуктов питания и его влияние на фертильность женщин.Репрод Биол Эндокринол 2019; 17: 1–13. pmid: 30606208
78. 78. Сифакис С., Андроутсопулос В.П., Цацакис А.М., Спандидос Д.А. Воздействие на человека химических веществ, нарушающих эндокринную систему: воздействие на мужскую и женскую репродуктивную систему. Environ Toxicol Pharmacol. 2017; 51: 56–70. pmid: 28292651
79. 79. Пиерик Ф.Х., Бурдорф А., Де Йонг Ф.Х., Вебер РФА. Ингибин B: новый маркер сперматогенеза. Энн Мед 2003; 35: 12–20. pmid: 12693608
80. 80. Мичем С.Дж., Нишлаг Э., Симони М.Ингибин B в мужской репродукции: патофизиология и клиническое значение. Eur J Endocrinol 2001; 145: 561–71. pmid: 11720872
81. 81. Ден Хонд Э., Турне Х., Де Саттер П., Омбелет В., Баейнс В., Ковачи А. и др. Воздействие на человека химикатов, нарушающих эндокринную систему, и фертильность: исследование случай-контроль у пациентов с субфертильностью мужского пола. Environ Int 2015; 84: 154–60. pmid: 26292060
82. 82. Стюарт Дж., Тернер К.Дж. Ингибин B как потенциальный биомаркер токсичности для яичек. Биомаркеры рака 2005; 1: 75–91.pmid: 17192034
83. 83. Филлипс К.П., Танфайчитр Н. Воздействие на человека эндокринных деструкторов и качество спермы. J Toxicol Environ Health B Crit Rev.2008; 11: 188–220. pmid: 18368553
84. 84. Cremonese C, Piccoli C, Pasqualotto F, Clapauch R, Koifman RJ, Koifman S, et al. Профессиональное воздействие пестицидов, уровни репродуктивных гормонов и качество спермы у молодых бразильских мужчин. Reprod Toxicol 2017; 67: 174–85. pmid: 28077271
85. 85. Сельвараджу В., Баскаран С., Агарвал А., Хенкель Р.Загрязнения окружающей среды и мужское бесплодие: эффекты и механизмы. Андрология 2021; 53: 1–13. pmid: 32447772
86. 86. Гао Ю., Мрук Д.Д., Ченг С.Ю. Клетки Сертоли являются мишенью для токсических веществ окружающей среды в яичках — механистическая и терапевтическая идея. Мнение эксперта — цели. 2015; 19: 1073–1090. pmid: 25⁰
87. 87. Мао Б.П., Ли Л., Янь М., Лянь Ц., Гэ Р., Ченг С.Ю. Экологические токсиканты и полярность клеток в семенниках. Reprod Toxicol 2018; 81: 253–8.pmid: 30171969
88. 88. Ван Л., Ян М., Вонг СКК, Ге Р., Ву Х, Сан Ф и др. Связанные с микротрубочками белки (MAP) в динамике цитоскелета микротрубочек и сперматогенезе. Histol Histopathol 2020; 18279.
89. 89. Lehti MS, Sironen A. Формирование и функция структур хвоста сперматозоидов в связи с дефектами подвижности сперматозоидов. Биол Репрод 2017; 97: 522–36. pmid: 292
90. 90. Lehti MS, Sironen A. Формирование и функция манжеты и жгутика во время сперматогенеза.Репродукция 2016; 151: R43–54. pmid: 26792866
91. 91. Виннакота C, Cree L, Peek J, Morbeck DE. Частота высокой фрагментации ДНК сперматозоидов в целевой популяции мужчин с низкой фертильностью. Syst Biol Reprod Med. 2019; 65: 451–457. pmid: 31550174
92. 92. Bandel I, Bungum M, Richtoff J, Malm J, Axelsson J, Pedersen HS, et al. Нет связи между индексом массы тела и целостностью ДНК сперматозоидов. Hum Reprod. 2015; 30: 1704–1713. pmid: 25994665
93. 93. Rylander L, Wetterstrand B, Haugen TB, Malm G, Malm J, Bjørsvik C и др.Анализ одиночной спермы как предиктор качества спермы: клинические и эпидемиологические последствия. Азиат Дж. Андрол. 2009; 11: 723–730. pmid: 19823177
94. 94. Салех Р.А., Агарвал А., Нада Е.А., Эль-Тонси М.Х., Шарма Р.К., Мейер А. и др. Отрицательные эффекты повышенного повреждения ДНК сперматозоидов в отношении семенного оксидативного стресса у мужчин с идиопатическим бесплодием и бесплодием мужского фактора. Fertil Steril. 2003; 79 (ПРИЛОЖЕНИЕ 3): 1597–1605. pmid: 12801566
95. 95. Erenpreiss J, Punab M, Zilaitiene B, Hlevicka S, Zayakin P, Matulevicius V, et al.Качество спермы молодых мужчин из общей популяции в странах Балтии. Hum Reprod. 2017; 32: 1334–1340. pmid: 28383690
96. 96. Никопуллос JDM, Джиллинг-Смит C, Алмейда PA, Homa S, Norman-Taylor JQ, Ramsay JWA. Фрагментация ДНК сперматозоидов у субфертильных мужчин: влияние на результат интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов и корреляция с переменными сперматозоидов. BJU Int. 2008; 101: 1553–1560. pmid: 18294305
97. 97. Ni W, Лю К., Хоу Дж., Пан С., Ву С., Чжэн Дж. И др.Суточные вариации фрагментации ДНК сперматозоидов: анализ 11 382 образцов спермы из двух популяций и эксперименты на животных in vivo. Chronobiol Int. 2019; 36: 1455–1463. pmid: 31418296
98. 98. Пердрикс А., Ривес Н. Исследование морфологии подвижных органелл сперматозоидов (MSOME) и вакуолей головки сперматозоидов: состояние дел в 2013 г. Hum Reprod Update 2013; 19: 527–41. pmid: 23825157
99. 99. Parinaud J, Vieitez G, Moutaffian H, Richoilley G, Milhet P. Взаимосвязь между параметрами подвижности, морфологией и акросомным статусом сперматозоидов человека.Hum Reprod 1996; 11: 1240–3. pmid: 8671432
100. 100. Мехди М., Хантуче Л., Аджина М., Саад А. Обнаружение фрагментации ДНК в сперматозоидах человека: корреляция с параметрами спермы. Андрология 2009; 41: 383–6. pmid: 198
101. 101. Брахем С., Мехди М., Эльгезал Х., Саад А. Обнаружение фрагментации ДНК и мейотической сегрегации у человека с изолированной тератозооспермией. J Assist Reprod Genet 2011; 28: 41–8. pmid: 20872065
102. 102. Перрин А., Луанжли Н., Зиан Й., Луанжли Т., Ле Рой С., Гуганик Н. и др.Изучение анеуплоидии и фрагментации ДНК в гаметах пациентов с тяжелой тератозооспермией. Репродукция Биомед онлайн. 2011; 22: 148–54. pmid: 21233018
103. 103. Брахем С., Эльгезал Х., Гедир Х., Ландолси Х., Амара А., Ибала С. и др. Цитогенетические и молекулярные аспекты абсолютной тератозооспермии: сравнение полиморфных и мономорфных форм. Урология. 2011; 78: 1313–9. pmid: 22137696
104. 104. Зини А., Филлипс С., Куршен А., Боман Дж. М., Баазим А., Биссоннетт Ф. и др.Морфология головки сперматозоида связана с высокой окрашиваемостью дезоксирибонуклеиновой кислотой, оцениваемой с помощью анализа структуры хроматина сперматозоидов. Fertil Steril 2009; 91: 2495–500. pmid: 18555233

Fragmentation — Halo Infinite Wiki Guide

Последняя редакция: 3 декабря 2021 г., 6:26 утра

Это руководство по многопользовательской карте Halo Infinite расскажет вам все, что вам нужно знать о карте фрагментации, включая выноски, силовое оружие и точки появления оборудования. , и секреты карты.

Возрождение лучшего оружия и снаряжения

реклама

Вот лучшее оружие и снаряжение, которое можно найти во Фрагментации.

Доступное оборудование

Оборудование, которое может появиться при фрагментации, включает:

Fragmentation случайным образом порождает либо Overshield, либо Active Camo Equipment в центре карты. Дополнительное силовое оборудование может появиться внутри Hex Vault и Rock Vault, если они открыты. Grappleshot, Drop Wall, Threat Sensor и Repulsor всегда доступны с обеих сторон карты.

Доступное оружие

Оружие, которое может появиться на Бегемоте, включает:

реклама

Доступные транспортные средства

Транспортные средства, которые могут появиться на Бегемоте, включают:

Детали карты фрагментации

Официальное описание фрагментации: «Сейчас более чем когда-либо безмятежная поверхность Установки 07 противоречит более глубокому напряжению и конфликту».

Описание: Фрагментация — это огромная открытая карта для больших командных сражений, напоминающая Валгаллу из Halo 3 и Рагнарок из Halo 4.В плейлисте Big Team Battle проводятся различные матчи 12 на 12, а также интенсивно используются машины и силовое оружие.

реклама

Фрагментация происходит на кольце Ореола Установки 07 и устанавливается в каньоне с двумя излучателями лучей Предтеч. Он был вдохновлен картами Big Team Battle из предыдущих игр Halo.

Доступные игровые режимы

Фрагментация может быть найдена в плейлисте Big Team Battle и содержит следующие игровые режимы:

Выноски

По мере изучения фрагментации вы увидите, что в нижнем левом углу HUD появляются выноски.Это поможет вам дать названия частям карты, чтобы вы могли лучше общаться с товарищами по команде. Вы также увидите, что эти имена всплывают при использовании способности «Отметить», которая помогает вам пинговать местоположения. Высказывания о фрагментации:

• Разорванное кольцо
• Основание каньона
• Дорога каньона
• Стена каньона
• Центральная шестигранная дорожка
• Центральная каменная дорожка
• Передняя основа каньона
• Шестигранная развязка
• Шестигранный свод
Vault Hex Vault Шестигранник Vault Hex Vault Hex Vault
• Rock Junction
• Rock Vault Courtyard
• Rock Vault
• Обломки

Секреты карты

реклама

• Fragmentation имеет совершенно уникальный и невероятно полезный дополнительный механизм в виде двух взламываемых хранилищ.