Тест нуклеиновые кислоты с ответами 9 класс: Тест. Нуклеиновые кислоты

вопросов и ответов о CRISPR

В: Что такое CRISPR?

A: «CRISPR» (произносится «четче») означает кластерные регулярные короткие палиндромные повторы, которые являются отличительной чертой системы защиты бактерий, составляющей основу технологии редактирования генома CRISPR-Cas9. В области геномной инженерии термин «CRISPR» или «CRISPR-Cas9» часто используется в широком смысле для обозначения различных систем CRISPR-Cas9 и -CPF1 (и других), которые могут быть запрограммированы для нацеливания на определенные участки генетического кода. и для редактирования ДНК в точных местах, а также для других целей, например, для новых диагностических инструментов.С помощью этих систем исследователи могут постоянно изменять гены в живых клетках и организмах, а в будущем, возможно, сделать возможным исправление мутаций в определенных местах генома человека для лечения генетических причин заболевания. В настоящее время доступны другие системы, такие как CRISPR-Cas13, в которых РНК-мишень предоставляют альтернативные возможности для использования и обладают уникальными характеристиками, которые использовались для чувствительных диагностических инструментов, таких как SHERLOCK.

Вопрос: Откуда берутся CRISPR?

Ответ: CRISPR были впервые обнаружены у архей (а затем и у бактерий) Франсиско Мохика, ученым из Университета Аликанте в Испании.Он предположил, что CRISPR служат частью бактериальной иммунной системы, защищающей от вторгшихся вирусов. Они состоят из повторяющихся последовательностей генетического кода, прерванных последовательностями-спейсерами — остатками генетического кода прошлых захватчиков. Система служит генетической памятью, которая помогает клетке обнаруживать и уничтожать захватчиков (называемых «бактериофагами»), когда они возвращаются. Теория Мойки была экспериментально продемонстрирована в 2007 году группой ученых во главе с Филиппом Хорватом.

В январе 2013 года лаборатория Чжана опубликовала первый метод разработки CRISPR для редактирования генома в клетках мыши и человека.

Чтобы узнать больше о многих ученых и группах, которые внесли свой вклад в понимание и развитие системы CRISPR от первоначального открытия до первых демонстраций редактирования генома с помощью CRISPR, посетите нашу хронологию CRISPR.

Q: Как работает система?

A: «Спейсерные» последовательности CRISPR транскрибируются в короткие последовательности РНК («РНК CRISPR» или «crRNA»), способные направлять систему к сопоставлению последовательностей ДНК.Когда целевая ДНК обнаружена, Cas9 — один из ферментов, продуцируемых системой CRISPR — связывается с ДНК и разрезает ее, отключая целевой ген. Используя модифицированные версии Cas9, исследователи могут активировать экспрессию генов вместо того, чтобы разрезать ДНК. Эти методы позволяют исследователям изучать функцию гена.

Исследования также предполагают, что CRISPR-Cas9 можно использовать для нацеливания и модификации «опечаток» в последовательности из трех миллиардов букв генома человека с целью лечения генетических заболеваний.

В: Чем CRISPR-Cas9 отличается от других инструментов редактирования генома?

О: CRISPR-Cas9 оказался эффективной и настраиваемой альтернативой другим существующим инструментам редактирования генома. Поскольку сама система CRISPR-Cas9 способна разрезать нити ДНК, CRISPR не нужно сочетать с отдельными расщепляющими ферментами, как это делают другие инструменты. Их также можно легко сопоставить с индивидуальными последовательностями «направляющей» РНК (гРНК), предназначенными для того, чтобы вести их к их ДНК-мишеням.Десятки тысяч таких последовательностей гРНК уже созданы и доступны исследовательскому сообществу. CRISPR-Cas9 также можно использовать для одновременного нацеливания на несколько генов, что является еще одним преимуществом, которое отличает его от других инструментов редактирования генов.

Вопрос: Чем CRISPR-Cpf1 отличается от CRISPR-Cas9?

CRISPR-Cpf1 по ряду важных отличий от ранее описанного Cas9 имеет важное значение для исследований и терапии.

Во-первых, в своей естественной форме ДНК-режущий фермент Cas9 образует комплекс с двумя небольшими РНК, обе из которых необходимы для режущей активности. Система Cpf1 проще в том, что для нее требуется только одна РНК. Фермент Cpf1 также меньше стандартного SpCas9, что облегчает его доставку в клетки и ткани.

Во-вторых, что, возможно, наиболее важно, Cpf1 разрезает ДНК иначе, чем Cas9. Когда комплекс Cas9 разрезает ДНК, он разрезает обе нити в одном и том же месте, оставляя «тупые концы», которые часто претерпевают мутации при повторном соединении.В комплексе Cpf1 разрезы в двух нитях смещены, оставляя короткие выступы на открытых концах. Ожидается, что это поможет с точной вставкой, что позволит исследователям более эффективно и точно интегрировать фрагмент ДНК.

В-третьих, Cpf1 разрезает далеко от сайта узнавания, что означает, что даже если целевой ген становится мутированным в сайте разреза, он, вероятно, все еще может быть повторно разрезан, что дает множество возможностей для правильного редактирования.

В-четвертых, система Cpf1 обеспечивает новую гибкость в выборе целевых сайтов.Подобно Cas9, комплекс Cpf1 должен сначала присоединиться к короткой последовательности, известной как PAM, и должны быть выбраны мишени, которые соседствуют с встречающимися в природе последовательностями PAM. Комплекс Cpf1 распознает последовательности PAM, сильно отличающиеся от таковых Cas9. Это может быть преимуществом при нацеливании, например, на геном малярийного паразита и даже геном человека.

Q: Какие еще научные применения CRISPR могут быть помимо редактирования генома?

О: Редактирование генома CRISPR позволяет ученым быстро создавать модели клеток и животных, которые исследователи могут использовать для ускорения исследований таких заболеваний, как рак и психические заболевания.Кроме того, CRISPR сейчас разрабатывается как средство быстрой диагностики. Чтобы способствовать развитию этого типа исследований во всем мире, Фэн Чжан и его команда обучили тысячи исследователей использованию технологии редактирования генома CRISPR посредством прямого обучения и обмена более чем 40 000 компонентов CRISPR с академическими лабораториями по всему миру.

Решения для анализа и исследований SARS-CoV-2 / COVID-19

Наши лучшие в своем классе решения для COVID-19

Bio-Rad предлагает широкий спектр продуктов для поддержки диагностического скрининга COVID-19, подтверждения результатов тестов, надзора, а также исследований и разработок терапии / вакцин.От молекулярного тестирования с использованием ПЦР в реальном времени или цифровой капельной ПЦР до иммунологических анализов — наш широкий спектр решений обеспечивает лучшую в своем классе чувствительность и точность.

На этих страницах перечислены наши продукты в этих областях. Доступность некоторых продуктов в регионах ограничена. Если у вас есть конкретный вопрос о решениях для коронавируса, пожалуйста, свяжитесь с вашим местным офисом продаж или представителем . Поскольку мы во всем мире соблюдаем правила предоставления убежища на месте, компания Bio-Rad продолжает обрабатывать заказы и предлагать обслуживание клиентов и техническую поддержку.

Диагностика и подтверждение

Вакцины и терапевтические исследования и разработки

Последние новости

Контактное лицо для СМИ: Тина Куччиа | Менеджер по корпоративным коммуникациям | Телефон: 510-741-6063 | [email protected]

Ресурсы по COVID-19

Пандемия коронавируса 2019-20 (COVID-19; 2019-nCoV)

Новый коронавирус, идентифицированный как возбудитель случаев пневмонии, впервые обнаруженный в городе Ухань, Китай, в декабре 2019 года. был официально обозначен как SARS-CoV-2.11 марта 2020 года ВОЗ объявила COVID-19 глобальной пандемией. Для получения последней информации о пандемии нового коронавируса COVID-19/2019-nCoV посетите веб-сайт Всемирной организации здравоохранения:

WHO.int> Чрезвычайные ситуации> Заболевания> Коронавирусная болезнь 2019

Центры США по контролю и профилактике заболеваний предоставляют ценную информацию для жителей США и других стран. Обзор ситуации с новым коронавирусом 2019 г., руководство для путешественников, информацию для специалисты в области здравоохранения и общественного здравоохранения, руководство для лабораторных специалистов, справочная информация и последние новости:

CDC.gov> Новый коронавирус

Хотя в настоящее время нет клинических диагностических средств для коронавируса 2019-nCoV, одобренных Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) США, 4 февраля 2020 года FDA выдало разрешение на экстренное использование, чтобы временно расширить использование анализов RT-PCR для выявление 2019-nCoV. Последние новости можно найти на веб-сайте Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США:

FDA.gov> Инициатива по медицинским контрмерам (MCMi)> Новый коронавирус (2019-nCoV)
FDA.gov> Инициатива по медицинскому противодействию (MCMi)> Разрешение на использование в чрезвычайных ситуациях

Обнаружение SARS-CoV-2 с использованием изотермической амплификации и быстрого и недорогого протокола инактивации и очистки образцов

Значимость

В этой работе описывается оптимизация конвейера подготовки и обнаружения образцов для быстрого диагностического теста SARS-CoV-2 и не требует специального оборудования. Этот конвейер включает инактивацию вирусов, делающую образцы более безопасными для работы, с последующей чувствительной 30-минутной изотермической реакцией обнаружения с отображением от красного к желтому на основе цвета.Чувствительность можно дополнительно улучшить, используя простой и недорогой протокол очистки. Этот конвейер может помочь решить проблему нехватки возможностей тестирования и может работать в различных условиях.

Abstract

Текущая пандемия тяжелого острого респираторного синдрома, вызванная коронавирусом 2 (SARS-CoV-2), оказала огромное влияние на общество во всем мире, угрожая жизни и средствам к существованию многих людей. Последствия будут продолжать расти и ухудшаться, если экономика начнет открываться без надлежащих мер предосторожности, включая расширенные диагностические возможности.Чтобы удовлетворить эту потребность в расширении тестирования, мы разработали чувствительный анализ изотермической амплификации, опосредованной петлей обратной транскрипции (RT-LAMP), совместимый с текущими реагентами, который использует колориметрическое считывание всего за 30 минут. Протокол быстрой инактивации, способный инактивировать вирионы, а также эндогенные нуклеазы, был оптимизирован для повышения чувствительности и стабильности образца. Этот протокол в сочетании с анализом RT-LAMP имеет чувствительность не менее 50 копий вирусной РНК на микролитр в образце.Для дальнейшего повышения чувствительности был разработан протокол очистки, совместимый с этим методом инактивации. Протокол инактивации и очистки в сочетании с анализом RT-LAMP обеспечивает чувствительность по крайней мере до 1 копии вирусной РНК на микролитр в образце. Этот простой конвейер инактивации и очистки является недорогим, совместим с другими платформами для обнаружения РНК, расположенными ниже по цепочке, и использует легко доступные реагенты. Это должно повысить доступность тестирования SARS-CoV-2, а также расширить настройки, в которых это тестирование может быть выполнено.

Нынешняя пандемия коронавируса 2 (SARS-CoV-2) тяжелого острого респираторного синдрома оказала и будет продолжать оказывать огромное влияние на общество во всем мире, угрожая жизни и средствам к существованию многих людей. По мере распространения болезни потребность в инструментах быстрой диагностики по месту оказания медицинской помощи стала огромной. В настоящее время прилагается много усилий для разработки анализов, которые можно использовать в различных условиях (1). Идеальный анализ не требует специального оборудования и дает быстрый, легко читаемый результат.С этой целью мы разработали анализ, основанный на методе изотермической амплификации, опосредованной обратной транскрипцией (RT-LAMP). Чтобы повысить чувствительность, мы также разработали метод подготовки образцов, который можно использовать в качестве первого шага для многих различных типов последующих анализов. Протокол простой, недорогой и быстрый, и в нем используются реагенты, которые легко приготовить в больших количествах.

LAMP — это метод изотермической репликации ДНК, который использует в ускоренном формате шесть олигонуклеотидов ДНК, которые гибридизуются с восемью различными участками молекулы-мишени (2, 3).При использовании замещающей цепи полимеразы и петель, образующихся во время этой реакции, происходит быстрая реакция амплификации при правильном связывании олигонуклеотидов с желаемой мишенью. Такие реакции генерируют микрограммы ДНК за очень короткий период времени при одной температуре реакции. Кроме того, хотя замещающая цепь полимераза обладает активностью обратной транскриптазы, обратная транскриптаза может быть включена для повышения чувствительности реакции при обнаружении РНК-мишени (RT-LAMP), такой как РНК SARS-CoV-2.Анализы LAMP имеют различные показания из-за большого количества генерируемой ДНК, включая флуоресценцию с использованием интеркалирующего красителя ДНК, мутность или падение pH, если реакция минимально забуферена (1, 4, 5). Это изменение pH, достаточное для того, чтобы индикаторный краситель pH заметно изменил цвет, является оптимальным методом диагностики на основе LAMP в месте оказания медицинской помощи.

Мы разработали и протестировали 11 наборов праймеров для анализа RT-LAMP и использовали реактивы LAMP от New England Biolabs (NEB) для колориметрического считывания.Они были протестированы относительно других праймеров, недавно опубликованных NEB. Оптимальный набор праймеров, направленных на неконсервативную область гена SARS-CoV-2 Orf1a, был идентифицирован как особо чувствительный, но не подверженный фоновым сигналам. Помимо разработки надежного набора праймеров RT-LAMP, мы также стремились оптимизировать подготовку образцов таким образом, чтобы максимизировать чувствительность и сделать образцы стабильными и безопасными для персонала, проводящего тестирование. Мы исследовали толерантность реакции RT-LAMP к детергентам и хаотропным солям, которые могут способствовать лизису вирионов и очистке геномов вирусной РНК и информационной РНК.Кроме того, мы оптимизировали очень простой и быстрый протокол, основанный на методе HUDSON (6), для инактивации вирионов, а также эндогенных РНКаз, скорректировав состав, чтобы обеспечить его совместимость с показаниями на основе pH. Эта последняя модификация имела преимущество снижения температуры, при которой инактивируются РНКазы. Эти методы позволяют добавить в реакцию не менее 5 мкл образца (мазки из носоглотки [NP] в физиологическом растворе / фосфатно-солевом буфере [PBS] или чистая слюна), чтобы довести чувствительность до 10-50 копий РНК на микролитр образца.Мы также разработали простой и быстрый процесс, с помощью которого вирусную РНК можно очистить и сконцентрировать из 0,5 мл среды для сбора, так что при использовании с нашим набором праймеров Orf1a предел обнаружения падает как минимум до 2 копий РНК на микролитр. В отличие от схем очистки, используемых для текущего одобренного Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) теста на основе qRT-PCR, эта очистка не требует коммерческого набора. Он связывает нуклеиновые кислоты с диоксидом кремния в форме суспензии, известной как «стеклянное молоко» (7), которая легко доступна в промышленных количествах по невысокой цене.Общая стоимость инактивации и очистки составляет приблизительно 0,07 доллара США за образец. Ранняя клиническая проверка этих протоколов на образцах пациентов, состоящих из мазков в физиологическом растворе, показала, что инактивация сама по себе увеличивает чувствительность до> 95% образцов со значениями Ct <30 qRT-PCR и общей чувствительностью 85% (8). Стеклянная очистка молока увеличивает эту чувствительность как минимум в 10 раз. Кроме того, было обнаружено, что специфичность составляет 100%, без ложноположительных результатов (8).

Результаты

Чувствительность анализов HMS и NEB RT-LAMP.

Мы разработали и протестировали 11 наборов праймеров LAMP для геномов SARS-CoV-2 с использованием V5 (https://primerexplorer.jp/e/), за исключением праймеров петель для Orf1a. PrimerExplorer не смог найти набор для этой области генома, поэтому петлевые праймеры для Orf1a-Гарвардской медицинской школы (Orf1a-HMS; SI, приложение , таблица S1) были сконструированы вручную. Orf1a-HMS находится в области SARS-CoV-2, которая не сохраняется ни с SARS, ни с изолятом SARS-подобного летучих мышей коронавируса Rs4084, двумя близкородственными коронавирусами (рис.1 А ). Несмотря на отсутствие консервативности среди коронавирусов, данные секвенирования клинических изолятов SARS-CoV-2 со всего мира, полученные через Nextstrain (9), не показывают, что эта область-мишень мутирует быстрее, чем остальная часть генома (рис. 1 B и C ). Первоначальные тесты показали, что праймеры Orf1a-HMS превосходят другие наши наборы праймеров. Затем мы создали Orf1a-Harvard Medical School Enhanced (Orf1a-HMSe, SI, приложение , таблица S1) путем модификации прямого внутреннего праймера (FIP) и обратного внутреннего праймера (BIP), чтобы включить линкер «TTTT» между F1c и F2. области, так как сообщалось, что это еще больше улучшает реакцию (10).Orf1a-HMS и Orf1a-HMSe были протестированы с использованием набора NEB WarmStart LAMP Kit (NEB E1700) со считыванием данных на основе флуоресценции в реальном времени (рис. 2). В этой схеме реакции каждый цикл составляет 30 с при 65 ° C. В идеале положительный результат будет считываться через 30 минут или 60-й цикл, временную точку, используемую Zhang et al. (1). Мы использовали РНК положительного контроля от Twist Bioscience (Sku 102019) в реакциях объемом 10 мкл в трех экземплярах, включая 0, 100, 200 или 300 копий вирусной РНК на реакцию. Как видно, оба набора праймеров способны обнаруживать вирусную РНК с низким числом копий.Для дальнейшей оценки чувствительности мы провели повторные реакции с использованием того же считывания на основе флуоресценции с Orf1a-HMS, Orf1a-HMSe и NEB Orf1a-C ( SI, приложение , рис. S1). Для каждого мы провели 48 реакций по 10 мкл с 200 копиями вирусной РНК каждая и 48 реакций по 10 мкл без добавления вирусной РНК. Как можно видеть, как Orf1a-HMS, так и Orf1a-HMSe работали хорошо, показывая высокую амплификацию в 45 и 47 из 48 реакций с 200 копиями РНК, соответственно. Кроме того, ни в одной из реакций без вирусной РНК не наблюдалось амплификации через 60 мин.NEB Orf1a-C не работал так же хорошо, так как время до амплификации в реакциях с 200 копиями РНК сильно варьировало, и многие из них не амплифицировались до или после 30-минутной точки. Более того, две реакции без вирусной РНК показали амплификацию, но мы не можем исключить возможность того, что эти реакции, какими бы чувствительными они ни были, были загрязнены. Эти данные предполагают, что Orf1a-HMS и Orf1a-HMSe являются более надежными наборами праймеров для этого анализа.

Консервация последовательности целевой области Orf1a-HMS между родственными коронавирусами и внутри изолятов SARS-CoV-2.( A ) Выравнивание (blastn, megablast) SARS, изолята Rs4084 коронавируса типа Bat SARS и последовательности, обнаруженной с помощью Orf1a-HMS / Orf1a-HMSe. ( B и C ) Измерение секвенированных нуклеотидных мутаций в подмножестве глобальных данных, предоставленных Nextstrain (энтропия нуклеотидов), адаптированных из визуального интерфейса Nextstrain. Указана целевая область Orf1a-HMS / Orf1a-HMSe (от 2245 до 2441). ( B ) Просмотр всего генома. ( C ) Крупный план целевой области.

Тест начальной чувствительности выбранных наборов праймеров RT-LAMP. Флуоресцентные реакции RT-LAMP проходят в течение 120 30-секундных циклов при 65 ° C: 0 (синий), 100 (зеленый), 200 (красный) или 300 (фиолетовый) контрольных копий РНК, включенных в реакцию ( n = 4) . Были выполнены анализы ( A ) Orf1a-HMS и ( B ) Orf1a-HMSe. RFU, относительные единицы флуоресценции.

Допуск моющих средств.

Чтобы потенциально улучшить чувствительность реакции RT-LAMP при использовании образцов пациентов, мы предположили, что увеличение количества детергента в реакции может помочь лизировать вирионы, делая их геномную РНК более доступной для обратной транскрипции и амплификации.Используя Orf1a-HMS и те же флуоресцентные реакции объемом 10 мкл, как описано выше, мы провели реакции с 500 копиями вирусной РНК и различными количествами добавленного Tween20 или TritonX100. Реакция вполне толерантна к добавленным детергентам, и можно наблюдать устойчивую амплификацию, по крайней мере, до 1,5% Tween20 и 1% TritonX100 (рис. 3). Амплификация все еще могла быть обнаружена для обоих детергентов до 3%, но реакции, по-видимому, выходили на плато при более низком уровне флуоресценции, когда уровни детергента увеличивались.

Оценка толерантности к моющим средствам RT-LAMP. Флуоресцентные реакции RT-LAMP проходят в течение 120 30-секундных циклов при 65 ° C. Все реакции содержат 500 копий контрольной РНК, набор праймеров Orf1a-HMS и от 0 до 3% добавленных ( A ) Tween20 или ( B ) TritonX100, как указано.

Сравнение чувствительности праймеров NEB и HMS к хаотропным солям с использованием колориметрических данных.

Чтобы оптимизировать протоколы, которые используют хаотропные соли во время очистки, мы проверили толерантность колориметрических реакций RT-LAMP к GuSCN и NaI, двум таким хаотропным солям, обнаружив, что реакция толерантна к любой из них до 50 мМ ( SI Приложение , рис.S2) (7, 11). Хотя наш окончательный рекомендуемый протокол (ниже) не использует GuSCN (отчасти из-за проблем с производственными масштабами, а также из-за опасности смешивания GuSCN с отбеливателем), мы разработали протокол, который его использует, для ситуаций, когда GuSCN является хаотропным. агент в использовании. Мы протестировали влияние 50 мМ GuSCN на чувствительность анализа RT-LAMP с различными наборами праймеров. Это также служило для прямого сравнения чувствительности Orf1a-HMS, Orf1a-HMSe, NEB Gene N-A и NEB Orf1a-C в реакциях RT-LAMP.

NEB Orf1a-C показал худшие результаты с GuSCN или без него (рис. 4 A ), обнаружив 2/40 с 100 копиями вирусной РНК и 5/40 с 200 копиями вирусной РНК. Этот результат был неожиданным, поэтому мы снова провели эксперимент, переработав все реагенты, включая смеси праймеров, и включив четыре реакции Orf1a-HMSe с 200 копиями вирусной РНК в качестве контроля планшета ( SI, приложение , рис. S3). Результаты были такими же: NEB Orf1a-C обнаруживал 1/40 при 100 копиях вирусной РНК и 1/40 или 2/40 при 200 копиях вирусной РНК (одна из реакций на 200 копий РНК стала заметно оранжевой, но не желтой). .NA гена NEB показала лучшие результаты, обнаруживая от 11/40 до 13/40 с использованием 100 копий вирусной РНК (в зависимости от того, считаются ли пограничные оранжевые реакции положительными) и от 22/40 до 29/40 с 200 копиями вирусной РНК (рис.4 ). В ). Orf1a-HMS и Orf1a-HMSe были гораздо более чувствительными. При 100 копиях вирусной РНК Orf1a-HMS и Orf1a-HMSe детектировали 26/40 и 31/40 соответственно (фиг. 4 C и D ). При 200 копиях вирусной РНК Orf1a-HMS и Orf1a-HMSe обнаруживали 36/40 и 39/40 соответственно.Кроме того, все положительные реакции были полностью желтыми, без неоднозначных оранжевых реакций. Ни одна из реакций без вирусной РНК не привела к положительной реакции ни в одном из протестированных анализов (рис. 4). Также не было разницы в чувствительности между реакциями, которые содержали 50 мМ GuSCN, и реакциями, которые не содержали, при использовании праймеров Orf1a-HMSe.

Оценка влияния GuSCN на чувствительность колориметрических анализов RT-LAMP. Колориметрические реакции RT-LAMP проводят с отмеченным количеством копий контрольной РНК (0, 100 или 200).Реакции проводили с 50 мМ GuSCN (+) или без GuSCN (-), как указано. ( A ) Набор праймеров NEB Orf1a-C. ( B ) Набор праймеров NEB Gene N-A. ( C ) Набор праймеров Orf1a-HMS. ( D ) Набор праймеров Orf1a-HMSe. Звездочкой * обозначены реакции, которые были заметно оранжевыми, но не полностью желтыми.

Цели для оптимизированного протокола быстрой инактивации / стабилизации и очистки.

Текущие методы сбора образцов, используемые для тестирования SARS-CoV-2, требуют помещения тампонов в 2–3 мл коммерческой среды для сбора, такой как среда для сбора вирусов Quest Diagnostics (VCM) (7).Этот метод представляет собой серьезную проблему для обнаружения на основе RT-LAMP, поскольку очень мало (не более 1 мкл) можно использовать в реакции объемом 25 мкл из-за присутствия красителей и буферов в VCM, которые могут препятствовать визуализации сдвиг pH в положительной реакции (8). Другие среды для сбора, такие как 0,9% физиологический раствор, обладают меньшим ингибирующим действием. Наконец, важно отметить, что обработка образцов сопряжена с риском, поскольку такие образцы могут содержать инфекционный вирус. Таким образом, мы решили разработать серию протоколов, которая включает быструю инактивацию вирионов в различных типах образцов при сохранении инактивированной РНКазы.Кроме того, наша цель состояла в том, чтобы этот протокол повысил чувствительность, при этом он был совместим как с прямым добавлением к реакциям RT-LAMP, так и с очисткой на основе NaI (схематично на рис. 5).

Простая и быстрая схема дезактивации и очистки образцов. ( A ) Схема, изображающая инактивацию образца и прямое тестирование RT-LAMP. ( B ) Схема процедуры очистки и тестирования постинактивации мазков. ( C ) Схема процедуры очистки и тестирования для постинактивации образцов слюны.

Протокол инактивации.

Чтобы быстро инактивировать / лизировать вирионы, одновременно защищая их РНК от эндогенных РНКаз, мы использовали простой протокол, основанный на протоколе HUDSON (6), с использованием стабильного при хранении восстанавливающего агента, Трис (2-карбоксиэтил) фосфина ( TCEP), хелатор двухвалентных катионов этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA) и кратковременное нагревание при 95 ° C. (Тем не менее, более низкие температуры могут быть достаточными; SI Приложение , рис. S6.) В этом протоколе 1/100 объема образца смеси 100 × TCEP / EDTA (реагент инактивации) добавляется к образцу, который затем смешивается и нагревали при 95 ° C в течение 5 мин.Этот протокол быстро денатурирует белки, используя TCEP для уменьшения любых дисульфидных мостиков. Любые двухвалентные катионы, необходимые для активности РНКазы, высвобождаются из денатурированных белков и секвестрируются ЭДТА, делая любые ренатурированные РНКазы инертными. Мы обнаружили, что этого достаточно, чтобы инактивировать активность РНКазы; Дополнительным преимуществом является то, что восстановители снижают вязкость слюны и слизи (12). Полученный инактивированный образец полностью совместим с прямым добавлением к реакции RT-LAMP, при этом допускается не менее 5 мкл.Этого протокола должно быть достаточно для инактивации любых вирионов SARS-CoV-2 в образце, что делает образец гораздо более безопасным для последующей обработки и транспортировки (13, 14). Ранее разработанные методы лизиса РНК-вирусов используют стадию лизиса при 95 ° C, а ближневосточный респираторный синдром-CoV очень чувствителен даже к 1 минуте при 65 ° C (6, 14).

Используя этот протокол, в реакцию можно добавить не менее 5 мкл инактивированного образца, включая мазки в физиологическом растворе и 1 × PBS, а также чистую слюну (без какого-либо другого препарата), что обеспечивает надежное обнаружение при 50 копиях РНК. на микролитр в исходной пробе (рис.6). Этот протокол также может быть дополнен только этим реагентом для инактивации и источником кипящей воды, что обеспечивает быструю инактивацию и стабилизацию образца в самых разных условиях. В результате инактивации образец остается со слабощелочным pH с 2,5 мМ TCEP и 1 мМ EDTA, поэтому такие инактивированные образцы, вероятно, будут совместимы с различными тестами на обнаружение нуклеиновых кислот, а не только с анализом RT-LAMP. Мы также обнаружили, что дитиотреитол (DTT) может работать вместо TCEP с незначительным изменением используемого гидроксида натрия (NaOH), поскольку DTT не такой кислый, как TCEP.Однако DTT гораздо менее стабилен, поэтому мы выбрали TCEP в качестве оптимального стабильного при хранении реагента.

с набором праймеров Orf1a-HMSe после инактивации образца. Прямое обнаружение в восстановленных мазках из горла и носа в ( A ) физиологическом растворе, ( B ) 1 × PBS или ( C ) восстановленной слюне. Копии контрольной РНК добавляли в образцы во время инактивации (указана концентрация). Образцы отрицательного контроля (-) не содержали добавленной РНК. После инактивации 5 мкл образца добавляли в колориметрическую реакцию RT-LAMP с праймерами Orf1a-HMSe.Положительные контрольные реакции (+) содержали дополнительно 1000 контрольных копий РНК, добавленных непосредственно в реакцию.

Протокол очистки.

Чтобы еще больше повысить чувствительность этого теста, сделав его недорогим, доступным и легко масштабируемым, мы стремились оптимизировать протокол очистки, позволяющий сконцентрировать вирусную РНК из большего объема образца в одну реакцию. Таким образом, мы протестировали очень недорогую и высокодоступную суспензию частиц диоксида кремния, известную как «стеклянное молоко» (7).Эта суспензия получается путем очистки мелких частиц диоксида кремния и их суспендирования в равном объеме воды. Одна лаборатория может подготовить достаточно для десятков миллионов очисток в день по цене менее 45 долларов за 1 миллион очисток. Эта суспензия является предшественником обычно используемых наборов для очистки колонок на основе диоксида кремния, используемых сегодня. Как и в случае с этими колонками, нуклеиновые кислоты будут связываться с диоксидом кремния в присутствии хаотропных солей, таких как GuSCN или NaI (7, 11).

Наш предпочтительный протокол очистки РНК основан на NaI, который часто использовался в качестве хаотропной соли выбора для очистки ДНК от агарозных гелей с использованием стеклянного молока (7).В таких протоколах три объема 6 М NaI добавляли к срезам геля, чтобы расплавить гель и связать ДНК со стеклянным молоком. Мы обнаружили, что конечной концентрации 2 М NaI было достаточно для концентрирования геномов контрольной РНК с помощью стеклянного молока. Это довольно удобно, поскольку использование меньшего объема связующего позволяет обрабатывать больший объем образца.

Очистка мазков в физиологическом растворе / PBS.

Для образцов, которые состоят из тампонов в физиологическом растворе или 1 × PBS, к образцу добавляют 1/2 объема связующего раствора на основе NaI (6 M NaI, 2% TritonX100, 10 мМ HCl) и 5 ​​мкл стеклянного молока. после описанного ранее этапа тепловой инактивации (рис.5 В ). Затем образец перемешивают и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 минут, чтобы позволить РНК связать (образцы переворачивают каждые 1–2 минуты, чтобы диоксид кремния оставался в суспензии). Затем образцы подвергают импульсному центрифугированию в настольной микроцентрифуге, такой как VWR Galaxy Mini (или в более крупной настольной центрифуге при 2000 × g), для осаждения кремнезема, и супернатант сливают. Выполняется однократная промывка 80% этанолом с последним отжимом и использованием микропипетки или пипетки для переноса с тонким наконечником для удаления последних следов 80% этанола.Осадок частиц диоксида кремния со связанной РНК сушат либо при комнатной температуре, либо при 65 ° C. После сушки можно напрямую добавить 25 мкл LAMP-реакционной смеси и ресуспендировать диоксид кремния, после чего РНК элюируется в реакцию. Затем реакция может быть запущена напрямую, или образец может быть перенесен в другой реакционный сосуд с включенными частицами кремнезема. По мере протекания реакции частицы кремнезема опускаются на дно трубки и остаются инертными. При очистке мазков в физиологическом растворе или 1 × PBS это обеспечивает высокую чувствительность, по крайней мере, до одного генома на микролитр в исходном образце (рис.7 A и B ).

Тест на чувствительность с набором праймеров Orf1a-HMSe после очистки образца. Прямое обнаружение в восстановленных мазках из горла и носа в ( A ) физиологическом растворе, ( B ) 1 × PBS или ( C ) восстановленной слюне. Копии контрольной РНК добавляли в образцы во время инактивации (указана концентрация). Образцы отрицательного контроля (-) не содержали добавленной РНК. После инактивации образцы очищали с использованием стеклянного молока с помощью центрифуги и непосредственно добавляли колориметрическую реакцию RT-LAMP с праймерами Orf1a-HMSe.Положительные контрольные реакции (+) содержали дополнительно 1000 контрольных копий РНК, добавленных непосредственно в реакцию. Как указано, реакции проводились в течение от 30 до 40 минут при 65 ° C.

Мы обнаружили, что описанный выше протокол может быть легко адаптирован к ситуациям, в которых центрифуга недоступна. После связывания РНК с диоксидом кремния образцы можно просто оставить в покое от 5 до 10 минут, позволяя большей части диоксида кремния осесть на дно пробирки; затем можно слить супернатант.Для этой процедуры мы включили две промывки 80% этанолом, чтобы гарантировать удаление ингибиторов, давая 2 мин диоксиду кремния опускаться на дно пробирки между промывками. Мы использовали пипетку для переноса с тонким наконечником, чтобы удалить последнюю промывку перед сушкой гранулы и проведением реакции, как описано выше. Хотя некоторые частицы диоксида кремния теряются, особенно мельчайшие частицы, которые нелегко выпадают из раствора, мы все же смогли достичь чувствительности по крайней мере до 1 копии РНК на микролитр при очистке от 0.5 мл тампонов в физиологическом растворе 1 × PBS ( SI Приложение , рис. S4).

Очистка от слюны.

Мы также стремились разработать протокол очистки вирусной РНК из слюны, поскольку запасы мазков могут стать ограниченными, а сбор слюны не требует помощи медицинского работника, как это делает текущий протокол мазка NP. Мы начали со слюны, инактивированной описанным выше протоколом инактивации (рис. 5 C ). Перед добавлением NaI или стеклянного молока образцы вращают в настольной микроцентрифуге, такой как VWR Galaxy Mini, или другой центрифуге, при 2000 × g в течение от 10 до 15 секунд.На этом этапе флокулянт в этих образцах осаждается, что позволяет вылить очищенный образец в новую пробирку. После завершения этого этапа «предварительной очистки» очистка очищенного супернатанта может продолжаться точно так же, как описано выше для образцов мазков в среде, что позволяет снизить чувствительность по крайней мере до 1 копии РНК на микролитр при запуске с 0,5 мл слюны (рис. 7 С ).

К сожалению, нам не удалось усовершенствовать протокол очистки от слюны, не основанный на использовании небольшой центрифуги, хотя недавние инновации, такие как портативное устройство «paperfuge», которое легко сделать, могут помочь решить эту проблему (15).Мы пытались дать материалу флокулянта осесть под действием силы тяжести в течение 30 минут (в течение которых большая часть его оседает на дно пробирки, но не все) и безуспешно переносили остаток в новую пробирку. Мы продолжим работать над этим и пригласим других сделать это, чтобы сделать протоколы очистки на основе слюны как можно более доступными.

Очистка от коммерческих коллекционных сред.

Мы также оптимизировали протоколы для очистки от часто используемых носителей для сбора, включая Quest Diagnostics VCM и PrimeStore MTM.Вирусная РНК может быть очищена от VCM после тепловой инактивации с помощью TCEP и EDTA, после чего желатин в собирающей среде вылетает из раствора. Образец можно центрифугировать, а очищенный супернатант можно использовать для очистки с добавлением связывающего раствора NaI с добавлением немного большего количества HCl. Образцы в PrimeStore MTM можно обрабатывать так же, как образцы физиологического раствора / PBS, которые уже были инактивированы. Таким образом, можно напрямую добавить 1/2 объема реагента, связывающего NaI, и можно будет продолжить очистку.Для обоих образцов наблюдалась сопоставимая чувствительность по сравнению с другими типами образцов, описанными выше ( SI, приложение , рис. S5).

Стабильность РНК после инактивации и в процессе очистки.

Чтобы убедиться, что эндогенные РНКазы полностью инактивированы с помощью этих протоколов, мы инактивировали образцы слюны, а также мазки в физиологическом растворе или 1 × PBS, а затем добавили контрольную вирусную РНК (100 копий на микролитр) для проверки деградации. Инактивированные образцы с этими контрольными РНК инкубировали при 37 ° C в течение 30 минут, что давало возможность любой остаточной РНКазной активности разрушить контрольные РНК.Когда 5 мкл этих образцов были использованы в 25-мкл реакций RT-LAMP с праймерами Orf1a-HMSe, все реакции дали положительный результат (фиг. 8 A ). Мы также инкубировали аналогично инактивированную слюну и смеси 1: 1 слюна / физиологический раствор в течение 24 часов при комнатной температуре перед проведением тех же реакций. И снова все реакции из образцов с контрольными копиями РНК дали положительный результат (фиг. 8 A ). Мы также обнаружили, что РНК в высушенном осадке РНК / диоксид кремния достаточно стабильна. После очистки мы инкубировали высушенный осадок РНК / диоксид кремния в течение 48 ч при комнатной температуре перед проведением 25-мкл реакции RT-LAMP с праймерами Orf1a-HMSe.Все реакции из образцов с добавленными копиями контрольной РНК (до двух копий РНК на микролитр) дали положительный результат (фиг. 8 B ). Это указывает на то, что РНКазы полностью инактивированы этим протоколом. Мы также протестировали инактивацию при различных температурах. Инкубация при температуре от 25 ° C до 65 ° C не полностью инактивировала РНКазы ( SI Приложение , рис. S6, A и B ). Однако с использованием нашего реагента для инактивации, который является щелочным, чтобы быть совместимым с колориметрическими показаниями на основе pH, активность РНКазы была отменена при инактивации при 75 ° C.Образцы, инактивированные щелочным инактивирующим реагентом при температуре 75 ° C или выше ( SI Приложение , рис. S6, C и E ). Если к таким инактивированным образцам добавить контрольные РНК и затем инкубировать при 37 ° C в течение 30 минут с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 24 часов, они дали положительный результат ( SI Приложение , рис. S6 C и E ). Однако при использовании реагента для инактивации при нейтральном pH требовалась инактивация при 95 ° C. Это говорит о том, что РНКазы легче инактивировать в щелочном растворе, потенциально сокращая любое окно между вирусным лизисом и инактивацией РНКазы.Активность РНКазы также ингибировалась концентрацией NaI, использованной во время связывания для очистки (2 M) (фиг. 8, C и D ).

Доказательства стабильности РНК от инактивации путем очистки. ( A ) Мазки в физиологическом растворе, мазки в 1 × PBS, слюне или смеси слюны и физиологического раствора 1: 1 инактивировали и добавляли контрольную РНК до 100 копий на микролитр. После инактивации образцы инкубировали в течение 30 минут при 37 ° C в течение 30 минут или 24 часов при комнатной температуре, как указано, перед тем, как 5 мкл добавляли к колориметрической реакционной смеси RT-LAMP с праймерами Orf1a-HMSe.( B ) Тампоны объемом 500 мкл в физиологическом растворе очищали с использованием стеклянного молока на центрифуге. Высушенные гранулы РНК / диоксида кремния оставляли при комнатной температуре на 48 ч перед добавлением колориметрической реакционной смеси RT-LAMP с праймерами Orf1a-HMSe. Образец отрицательного контроля (-) не содержал копий РНК, добавленных к образцу. Положительные контрольные реакции (+) имели 1000 копий РНК, добавленных непосредственно в реакцию. ( C и D ) РНКазная активность тампонов, помещенных непосредственно в растворы NaI (указана концентрация).Реакции RNase Alert инкубируют в течение 30 мин при 37 ° C; ( C ) светлое поле, ( D ) канал флуоресценции 488 нм; флуоресценция указывает на активность РНКазы.

Обсуждение

В этом отчете мы представили доказательства того, что чувствительный анализ RT-LAMP для вируса SARS-CoV-2 стал еще более чувствительным благодаря быстрой и очень доступной схеме инактивации и очистки. Схема совместима с современными методами сбора, при которых мазки помещаются в большой объем собирающей среды, а также образцы прямой слюны.Эта схема инактивации и очистки, а также анализ RT-LAMP просты и быстры, недороги и не требуют специального оборудования. Реакционные смеси RT-LAMP можно лиофилизировать, при этом смесь остается стабильной в течение многих лет при 4 ° C или недель при комнатной температуре (16, 17). Это устранит барьер холодовой цепи для развертывания в районах с ограниченными ресурсами, где холодная доставка и замороженное хранение могут оказаться невозможными. Такие лиофилизированные реакционные форматы также позволят добавлять увеличенные объемы образцов в каждую реакцию.

Протокол инактивации быстро инактивирует как вирионы (13, 14), так и эндогенные РНКазы (6). Это работает как для стабилизации вирусной РНК перед обнаружением, так и для того, чтобы сделать образцы более безопасными для последующей обработки. Кроме того, этот протокол инактивации должен быть совместим с большинством других анализов обнаружения нуклеиновых кислот, включая используемый в настоящее время одобренный FDA тест qRT-PCR. Используемый здесь щелочной раствор для инактивации также снижает температуру, необходимую для инактивации, с 95 ° C до 75 ° C ( SI Приложение , рис.S6), что может повысить безопасность работы с образцами.

Используемые для очистки частицы диоксида кремния состоят из неочищенного порошка диоксида кремния и могут быть очень быстро получены в огромных количествах. Кроме того, для каждой очистки требуется очень мало (1 л достаточно для 200 000 очисток). Одна лаборатория может легко сделать достаточно для миллионов тестов, что позволяет учреждениям с базовым оборудованием, таким как центрифуги и автоклавы, производить достаточное количество для удовлетворения высокого спроса.Очистку каждого образца тампона можно выполнить за считанные минуты в одной пробирке без центрифуги, используя только два раствора. Множественные очистки могут выполняться параллельно, что позволяет медицинскому персоналу в медицинских учреждениях эффективно проводить очистку. Очищенные образцы можно хранить при комнатной температуре после процедуры очистки стеклянного молока, что позволяет собирать и хранить образцы перед анализом в различных типах анализов.

Эти протоколы могут использоваться вместе в одном конвейере.Образцы пациентов могут быть сначала инактивированы и протестированы непосредственно в анализе RT-LAMP с праймерами Orf1a-HMSe с чувствительностью не менее 50 копий вирусной РНК на микролитр за 30 мин. Образцы, показывающие отрицательные результаты в этом анализе, затем могут быть непосредственно использованы в протоколе очистки стеклянного молока и повторно протестированы, увеличивая чувствительность к 1 копии вирусной РНК на микролитр. Гибкость, обеспечиваемая использованием непосредственно инактивированных образцов или использованием очищенных образцов, позволяет использовать несколько схем.Кроме того, стеклянная очистка молока с отстаиванием под действием силы тяжести должна быть совместима с роботизированными дозирующими платформами с медленной аспирацией, чтобы гранулы диоксида кремния оставались после промывки. В качестве альтернативы более крупные частицы диоксида кремния доступны в керамической промышленности. Если используются более крупные размеры, потребуется использовать больший объем частиц, чтобы компенсировать уменьшение отношения поверхности к объему. Однако для некоторых приложений может быть оправдан компромисс при расчетах.

Образец может быть обработан изначально с использованием нескольких наборов праймеров (либо в одной реакции, либо в параллельных реакциях, либо в последовательных реакциях) для обеспечения специфичности и чувствительности.Например, если образцы пациентов тестировались отдельно с помощью тестов Orf1a-HMSe и NEB N-A, двойной положительный результат был бы более определенным положительным результатом. Также возможно, что наборы праймеров, нацеленные на области генома к 3′-концу вируса, которые более многочисленны в субгеномных РНК, таких как ген нуклеокапсида, в инфицированных клетках, будут иметь повышенную чувствительность, если эти РНК будут обнаружены в образцах пациентов (18) . Это не отразилось бы на наших контрольных РНК, которые содержали равные уровни всех геномных областей.Более того, если геномная мутация помешала одному анализу дать положительный результат, второй анализ, нацеленный на другую область генома, все равно мог бы обнаружить вирусную РНК. Также важно, чтобы тесты, используемые для образцов пациентов, включали внутренний контроль, такой как бета-актин, используемый при клинической валидации этого анализа (8), чтобы гарантировать сохранение целостности РНК в образце и отрицательный результат не из-за деградация.

При использовании с образцами пациентов Orf1a-HMSe показал себя очень хорошо, а инактивация значительно повысила предел обнаружения (8).Инактивация и использование праймеров Orf1a-HMSe обеспечили чувствительность ~ 85% от используемого в настоящее время анализа qRT-PCR с высокой чувствительностью (> 95%) для образцов со значениями Ct менее 30, что соответствует образцам с ~ 40 вирионов на микролитр. Оказалось, что стеклянная очистка молока увеличивает чувствительность как минимум в 10 раз. Кроме того, было обнаружено, что специфичность составляет 100% без ложных срабатываний. Несмотря на то, что он не такой чувствительный, как используемый в настоящее время метод qRT-PCR, простота и скорость в самых разных условиях могут все же сделать этот анализ полезным для борьбы с инфекциями.Мало что известно о диапазоне концентраций вируса, который делает человека особенно заразным для других. Люди с очень низкой вирусной нагрузкой, безусловно, менее заразны, и поэтому их идентификация может не иметь решающего значения для снижения распространения вируса. Кроме того, вероятно, будет применяться эпиднадзорное тестирование для достаточно широкого и случайного мониторинга популяций (19, 20). Объединение без очистки может быть достаточным для обнаружения высокоинфекционных особей. Однако, поскольку относительно большие объемы могут быть сконцентрированы с помощью процедуры стеклянного молока, образцы могут быть объединены и очищены по протоколу стеклянного молока, вероятно, без ущерба для чувствительности.Это позволило бы проводить надзорные испытания без значительного увеличения стоимости (21).

Мы понимаем, что многие экспресс-тесты разрабатываются ежедневно и получают одобрение FDA. Однако, учитывая невероятный спрос, необходимы различные тесты с различными компонентами из разных промышленных источников, чтобы решить немедленную нехватку тестов перед лицом широкомасштабной пандемии. Каждый протокол выполняет важную функцию, поскольку разные тесты имеют разные требования, разную чувствительность и разные расходы.

Материалы и методы

Дизайн грунтовки Orf1a-HMS / Orf1a-HMSe.

Первичные олигонуклеотиды для праймеров Orf1a-HMS / Orf1a-HMSe, F3, B3, FIP и BIP были разработаны PrimerExplorer V5 (https://primerexplorer.jp/e/). Праймеры петель (LF и LB) были разработаны вручную, проверены соответствующие температуры плавления с использованием прогнозов программного обеспечения SnapGene.

Oligos.

Все олигонуклеотиды были заказаны у IDT и ресуспендированы в воде UltraPure при концентрации 100 мкМ.Олиго объединяли для получения 100 мкл 10-кратной смеси праймеров следующим образом: 16 мкл FIP, 16 мкл BIP, 2 мкл F3, 2 мкл B3, 4 мкл LF и 4 мкл LB, и доводили до 100 мкл. мкл воды UltraPure.

RT-LAMP Реакции.

Все реакции RT-LAMP проводили, как описано в протоколах NEB (E1700 и M1800), и проводили при 65 ° C. Реакции, основанные на флуоресценции, запускали как реакции объемом 10 мкл в термоциклере Bio-Rad CFX96 в течение 60 мин, контролируя каждые 30 с флуоресценцию в канале SYBR. Колориметрические анализы проводили как 25-мкл реакции в течение 30 минут при 65 ° C в термоциклере Eppendorf, за исключением реакций после очистки образцов с помощью 0.От 5 до 1 копий вирусной РНК на микролитр образца, которые обрабатывали в течение 40 минут для улучшения изменения цвета. Колориметрические анализы были получены с помощью смартфона Pixel 2 с настройками по умолчанию.

Контрольная РНК.

Все последовательности вирусной РНК, использованные в этом исследовании, были очищенными контрольными РНК от Twist Bioscience (SKU 102019, 1 × 10 ⁶ копий РНК на микролитр), соответствующим образом разведенных в воде, свободной от нуклеаз. Это были неперекрывающиеся РНК, представляющие фрагменты генома, соответствующие каждому набору зондов.Для проверки концентраций Twist РНК контрольные РНК обрабатывали методом RT и количественно оценивали с помощью цифровой капельной ПЦР (ddPCR) с использованием праймеров HMS Orf1e F3 / B3 и NEB N-A F3 / B3 для их геномных областей. Полученные значения составили 33% и 40%, соответственно, от значений, предоставленных Twist, при условии, что частота RT и обнаружение ddPCR были 100%. Поскольку 100% маловероятно, эти значения RT-ddPCR считались подтверждением заявленных концентраций.

Настройка чистой реакции.

Все реакции были собраны и запечатаны перед запуском в специальной чистой комнате, которая регулярно дезактивировалась отбеливателем и имела ограниченный доступ для персонала.После проведения реакции реакционные пробирки или планшеты больше никогда не открывали, чтобы предотвратить постамплификационное загрязнение будущих реакций.

Решения.

Все растворы были созданы из реагентов молекулярной степени чистоты. Чтобы приготовить 5 мл 100-кратного реагента для инактивации, сначала 358 мг TCEP-HCl (Millipore Sigma 580567) растворяли в воде, чтобы получить 2,5 мл 0,5-М раствора. Затем добавляли 1 мл 0,5 М EDTA, pH = 8 (ThermoFisher Scientific AM9260G). Наконец, добавляли 10 н. NaOH и воду UltraPure (ThermoFisher Scientific 10977015), чтобы довести конечный объем до 5 мл и концентрацию NaOH до 1.От 1 до 1,15 N NaOH (1,1 N для мазков в физиологическом растворе 1 × PBS, 1,15 N для использования со слюной с pH ~ 6,5). Для других сред для сбора необходимо будет оптимизировать концентрацию NaOH, чтобы гарантировать, что pH конечной инактивированной пробы находится в приемлемом диапазоне, чтобы проба при добавлении не вызывала немедленного пожелтения LAMP-реакции или предотвращения LAMP-реакции. от пожелтения при успешном усилении.

Для приготовления раствора для связывания NaI 224,8 г NaI (Millipore Sigma 793558) растворяли в воде UltraPure до конечного объема ~ 230 мл.К этому добавляли 2,5 мл 1 н. HCl (из 37% исходного материала, Millipore Sigma 320331) и 5 ​​мл tritonX100 и перемешивали перед доведением объема до 250 мл водой UltraPure. Со временем этот раствор может немного пожелтеть, предположительно из-за окисления, которое приводит к образованию молекулярного йода. Однако при добавлении к инактивированному образцу, содержащему TCEP, этот йод быстро восстанавливается, делая раствор бесцветным. Похоже, что это не влияет на очистку. Кроме того, это окрашивание можно предотвратить, уменьшив воздействие света на раствор (например,г., обернув емкость с раствором фольгой).

1 × PBS был приобретен как есть (ThermoFisher 10010023), и 0,9% физиологический раствор был получен путем внесения 1,54 мл 5 M NaCl в 50 мл с водой UltraPure.

Приготовление стеклянного молока.

Для приготовления стеклянного молока диоксид кремния 325 меш (Spectrum Chemicals, SI108) был объединен с избыточным объемом 10% HCl (~ 3 н. HCl), полученным из 37% HCl (Millipore Sigma 320331) и воды MilliQ (Millipore). в вытяжном шкафу (нельзя вдыхать сухой кремнезем).После промывки кислотой в течение 4-8 часов при комнатной температуре диоксид кремния осаждали центрифугированием в течение 2 минут при 5000 × г , и супернатант сливали. Гранулы ресуспендировали в четырех объемах гранул воды MilliQ, а затем снова гранулировали. Эту стадию промывки повторяли всего шесть промывок. Затем осадок промывали четырьмя объемами осадка 10 мМ Tris HCl, pH = 8 (ThermoFisher Scientific AM9855G) и 1 мМ EDTA (ThermoFisher Scientific 15575020) и осаждали. Наконец, осадок ресуспендировали в одном объеме гранулы 10 мМ Трис HCl и 1 мМ ЭДТА и автоклавировали.Однако этот этап автоклавирования, вероятно, излишний, поскольку промывка кислотой должна очищать шарики от загрязняющих веществ. Полученная 50% -ная стеклянная суспензия молока может храниться при комнатной температуре. Перед использованием необходимо тщательно ресуспендировать частицы, поскольку они начинают быстро оседать.

Определение активности РНКазы. Активность РНКазы

тестировали с использованием субстрата IDT RNaseAlert (IDT 11-04-02-03). Вкратце, субстрат обнаружения (олигонуклеотид РНК с фтором и гасителем) ресуспендировали в воде UltraPure при концентрации 10 мкМ.Для каждого теста 5 мкл этого субстрата и 5 мкл 10-кратного буфера объединяли с 40 мкл раствора, который тестировался на активность РНКазы. Тестовый раствор для проверки активности РНКазы в NaI был создан путем погружения и энергичного взбалтывания аппликатора с ватным наконечником (Puritan 806-WC), который был тщательно протерт в задней части горла, в 500 мкл указанного раствора NaI. Положительный контроль был создан путем погружения тампона в воду, а отрицательный контроль содержал чистую воду UltraPure без каких-либо добавок.Для тестирования влияния температуры инактивации на инактивацию РНКазы с флуоресцентным считыванием мазки из зева аналогичным образом помещали в физиологический раствор с 1-кратным реагентом для инактивации, причем отрицательный контроль состоял из этого раствора без добавления тампона. Затем эти реакции инкубировали в течение 30 или 60 минут для NaI и тестов на инактивацию, соответственно, при 37 ° C и отображали в светлом поле и 488 нм с помощью стереоскопа Leica.

Мок-образцы.

Образцы мазков были созданы как в физиологическом растворе, так и в 1 × PBS.Чтобы смоделировать типичный сбор мазков, один НЧ и один ротоглоточный мазок погружали и перемешивали в 3 мл любого раствора. Для сбора слюны сначала полоскали рот водой. Через 30 минут без еды и питья была собрана слюна.

Инактивация образцов и прямое тестирование RT-LAMP.

Во всех экспериментах с инактивированными образцами использовались либо имитирующие образцы мазков, либо контроли слюны и РНК. К каждому образцу добавляли 1/100 объема 100 × инактивирующего реагента. Затем образцы были смешаны и помещены в термоблок, установленный на 95 ° C.Через ~ 2 мин, когда образцы достигли 95 ° C, были добавлены РНК положительного контроля, и продолжалась оставшаяся 5-минутная инактивация. Затем образцы охлаждали на льду. Для тестирования остаточной активности РНКазы образцы после охлаждения помещали на 30 мин при 37 ° C, а затем снова помещали на лед. Для тестирования RT-LAMP 5 мкл образца добавляли к 20 мкл 1,25-кратной колориметрической смеси RT-LAMP, содержащей набор праймеров Orf1a-HMSe. Для проверки стабильности образцов, инактивированных при различных температурах, инактивацию проводили в течение 5 мин при указанной температуре.Для инактивации реагентом для инактивации при нейтральном pH готовили 100-кратный реагент для инактивации с 0,75 М NaOH. После инактивации, непосредственно перед добавлением образца в реакцию, добавляли 1/100 объема 0,35 М NaOH, чтобы довести pH образца до надлежащего щелочного диапазона, необходимого для колориметрического считывания.

Очистка образцов — с помощью центрифуги.

Во всех экспериментах по очистке использовалось 500 мкл образца (тампоны или слюна), и они проводились в пробирках объемом 1,5 мл (Fisher Scientific 14-222-155), коническая форма которых обеспечивала очень эффективное удерживание гранул диоксида кремния.Образцы инактивировали, как описано выше, и охлаждали. Для очистки слюны эти образцы центрифугировали при 2000 × g в центрифуге VWR Galaxy Mini в течение от 10 с до 15 с, и очищенный супернатант переносили в свежую пробирку для очистки. Этот шаг был пропущен для образцов мазков. Затем добавляли 250 мкл реагента, связывающего NaI, вместе с 5 мкл стеклянного молока (их можно было заранее объединить в формат мастер-микса, по 255 мкл которого было добавлено в каждый). Затем пробирки перемешивали путем переворачивания и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин; их переворачивали каждые 2 мин для ресуспендирования кремнезема.Затем образцы центрифугировали от 2 до 3 с при 2000 × г для осаждения кремнезема, и супернатант сливали. Затем добавляли 700 мкл 80% этанола и пробирки переворачивали два или три раза для промывки (осадок не нужно ресуспендировать). Образцы снова центрифугировали от 2 до 3 с, и супернатант сливали. Образцы центрифугировали в последний раз, чтобы весь остаточный 80% этанол опустился на дно. Для удаления остаточного раствора из осадка использовалась микропипетка или пипетка для переноса с тонким наконечником (например, Thomas Scientific 232-11).Затем гранулы полностью сушили на воздухе (до тех пор, пока они не стали напоминать сухой пергамент), оставляя пробирки открытыми при комнатной температуре или в нагревательном блоке 65 ° C для более быстрого высыхания. Затем добавляли 25 мкл 1 × колориметрической смеси RT-LAMP с праймерами Orf1a-HMSe и осадок ресуспендировали пипетированием или встряхиванием. Реакцию переносили в пробирку для ПЦР объемом 0,2 мл перед проведением при 65 ° C в течение 30 мин (этот формат пробирки упрощает визуализацию).

Очистка образцов — без центрифуги.

Очистка с использованием только силы тяжести для осаждения частиц диоксида кремния была успешной только с использованием тампонов, а не слюны.Пятьсот микролитров образца были инактивированы, и РНК была связана с диоксидом кремния с помощью реагента, связывающего NaI, как описано выше для использования с центрифугой. Затем образцы оставляли в покое в течение 5-10 минут, чтобы дать кремнезему осесть, и супернатант сливали (в супернатанте остаются некоторые мелкие частицы, которые будут мутными, но значительное количество кремнезема осядет на дно. трубки). Затем добавляли 700 мкл 80% этанола и пробирки переворачивали два или три раза для промывки (осадок не нужно ресуспендировать).Образцам давали отстояться от 2 до 3 минут, и супернатант сливали. Добавляли дополнительно 700 мкл 80% этанола, и образцы оставляли на от 2 до 3 минут. Затем супернатант удаляли пипеткой для переноса с тонким наконечником умеренно медленно (от 2 до 3 с), чтобы осталось как можно меньше 80% этанола. Затем гранулы полностью сушили на воздухе (до тех пор, пока они не стали напоминать сухой пергамент), оставляя пробирки открытыми при комнатной температуре или в тепловом блоке 65 ° C для более быстрой сушки. Затем проводили реакции, как описано выше для очистки на центрифуге.

Очистка образцов с помощью коммерческих сред для сбора.

Вирусная РНК была добавлена ​​непосредственно в чистые образцы Quest Diagnostics VCM или PrimeStore MTM. Для образцов VCM (750 мкл) добавляли 1/100 объема 100 × инактивационного реагента, описанного выше, и образцы нагревали при 95 ° C в течение 5 минут и охлаждали. Затем образцы VCM центрифугировали при 10000 × г в центрифуге в течение 15 с для осаждения желатина на дне пробирки, и очищенный супернатант переносили в свежую пробирку (2/3 исходного объема пробы, 500 мкл). .Затем добавляли половину этого очищенного объема надосадочного раствора связывающего раствора NaI с дополнительными 12,5 мМ HCl вместе с 5 мкл стеклянного молока. Затем очистку проводили на центрифуге, как описано выше. Для образцов в PrimeStore MTM инактивация не проводилась. Добавляли половину объема образца связывающего раствора NaI и 5 мкл стеклянного молока, а затем проводили очистку на центрифуге, как описано выше.

Доступность данных.

Все данные исследования включены в статью SI и приложение .

Благодарности

Работа поддержана Медицинским институтом Говарда Хьюза. Мы благодарны Натану Таннеру из NEB за обмен идеями и реактивами. Мы также выражаем благодарность за полезные обсуждения с Майклом Спрингером из отдела системной биологии HMS, особенно в отношении предложений по этапу инактивации. При разработке этих анализов нас также направили в ходе полезных обсуждений с нашими коллегами, Мелисом Анахтаром и Грэмом МакГратом из отделения клинической микробиологии Массачусетской больницы общего профиля.Мы благодарим Дженн Эттер, руководителя исследовательской работы отдела генетики HMS, а также сотрудников службы безопасности, оборудования и доставки HMS за поддержку нашей работы в это непростое время. Мы также благодарим Элизабет Рэйб, Джозефа Рэба и Майкла Берка за их помощь в редактировании этой рукописи.

• Copyright © 2020 Автор (ы). Опубликовано PNAS.

вопросов по структуре ДНК

От вас не ждут, что вы узнаете все ответы. Использовать кнопки в учебнике ДНК, чтобы исследовать. Поиграть с молекулой ДНК, чтобы попытаться выяснить ответ на вопрос! Если вы находите вопросы слишком сложными, возможно, вам будет полезно визит Вступительный рассказ Эндрю Картера о структуре ДНК.

Набор вопросов A (для детей 14 лет и старше)

1. Что такое «нить» ДНК?
2. Сколько нитей образуют двойную спираль ДНК?
3. Каждая нить состоит из двух зон или областей.Одна зона каждой нити состоит из идентичных повторяющихся звеньев, в то время как другая зона состоит из разных единиц. Что это зоны каждой пряди называются?
4. Что удерживает одну нить другой в двойной спирали?
5. Как клетки делают точные копии ДНК?
6. Когда клетки дублируют свою ДНК?
7. Какая информация закодирована в ДНК?
8. Что такое «кодон»?
9. Что такое «транскрипция» ДНК?
10. Что такое «трансляция» ДНК?

    ---

    Набор вопросов B (для детей от 18 лет и старше)
11. Какие четыре пары оснований ДНК образуют двойную спираль?
12. Как А может отличить Т от С?
13. Какую двойную спираль ДНК, по вашему мнению, сложнее? разделены на две цепи: ДНК, состоящая преимущественно из основания AT пар или пар оснований GC? Почему?
14. Что такое мутация?
15. Двойная спираль ДНК выглядит как витая лестница.Какие составляет каждую ступеньку лестницы? Что скрепляет перекладины по бокам?
16. Есть ли в двойной спирали ДНК в основном пустое пространство между атомами?
17. Одна пара оснований не может сформировать нормальный Watson-Crick водородные связи. Вы можете это найти? (Примечание: нажав на любой основе в D. Концы, антипараллельность сообщает свою букву и порядковый номер в нижней части браузера в строке состояния после слова «Группа». Используйте эту функцию для получения букв и порядковых номеров аномальная пара оснований, как только вы ее обнаружите.)
18. Как белки распознают определенные последовательности ДНК? (Подробнее об этом.)

    ---

    Набор вопросов C (для детей от 20 лет и старше)
19. Какие основания являются пуринами? Пиримидины?
20. Если пурин был заменен на пиримидин на одном положение в одной цепи двойной спирали ДНК, что произойдет?
21. Почему в двойной спирали ДНК не образуют две буквы А или Т? водородные связи (из трех возможных) с G или C?
22. Сколько видов 5-членных колец в ДНК?
23. Сколько видов 6-членных колец в ДНК?
24. Имеет ли «свободное плечо» дезоксирибоза (углерод, не являющийся член пентозного кольца) указывают в направлении, в котором кодировка читается или против?
25. На основе показанных кодонов (в фильме Codons в разделе Б.Код ), это показанная нить ДНК. нить шаблона или нить кодирования?

Ответы доступны преподавателям, которые задают вопросы электронное письмо на адрес [email protected] с подтверждением должности преподавателей, например, со ссылкой на школу или факультет перечисления веб-сайта колледжа. Я буду не отправлять ответы , если вы назовите свое полное имя, должность (студент, преподаватель и т. д.), учреждение, город штат Страна. Если вы не учитель, скажите, пожалуйста, имя и адрес электронной почты вашего учителя, а также веб-сайт вашего учителя, если он есть.

Структура и функции ДНК

Цели обучения

• Опишите биохимическую структуру дезоксирибонуклеотидов
• Определите пары оснований, используемые в синтезе дезоксирибонуклеотидов
• Объясните, почему двойная спираль ДНК описывается как антипараллельная

В разделе «Микробный метаболизм» мы обсудили три класса макромолекул: белки, липиды и углеводы.В этой главе мы обсудим четвертый класс макромолекул: нуклеиновые кислоты. Как и другие макромолекулы, нуклеиновых кислот состоят из мономеров, называемых нуклеотидами , которые полимеризуются с образованием больших цепей. Каждая цепь нуклеиновой кислоты содержит определенные нуклеотиды, которые появляются в определенном порядке внутри цепи, называемые ее последовательностью оснований . Последовательность оснований дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) отвечает за перенос и сохранение наследственной информации в клетке.В разделе «Механизмы микробной генетики» мы подробно обсудим способы, которыми ДНК использует свою собственную последовательность оснований для управления собственным синтезом, а также синтез РНК и белков, что, в свою очередь, дает продукты с различными структура и функции. В этом разделе мы обсудим основную структуру и функцию ДНК.

Нуклеотиды ДНК

Строительными блоками нуклеиновых кислот являются нуклеотиды. Нуклеотиды, составляющие ДНК, называются дезоксирибонуклеотидами .Три компонента дезоксирибонуклеотида — это пятиуглеродный сахар, называемый дезоксирибоза , фосфатная группа и азотистое основание , азотсодержащая кольцевая структура, которая отвечает за комплементарных пар оснований между цепями нуклеиновых кислот (рис. ). Атомы углерода пятиуглеродной дезоксирибозы пронумерованы 1ʹ, 2ʹ, 3ʹ, 4ʹ и 5ʹ (1ʹ читается как «один простой»). Нуклеозид состоит из пятиуглеродного сахара и азотистого основания.

Рисунок 1.(а) Каждый дезоксирибонуклеотид состоит из сахара, называемого дезоксирибозой, фосфатной группы и азотистого основания — в данном случае аденина. (b) Пять атомов углерода в дезоксирибозе обозначены как 1ʹ, 2ʹ, 3ʹ, 4ʹ и 5ʹ.

Дезоксирибонуклеотид назван в соответствии с азотистыми основаниями (рис. 2). Азотистые основания аденин (A) и гуанин (G) представляют собой пурины ; они имеют двойную кольцевую структуру с шестиуглеродным кольцом, конденсированным с пятиуглеродным кольцом. пиримидинов , цитозин (C) и тимин (T), представляют собой более мелкие азотистые основания, которые имеют только шестиуглеродную кольцевую структуру.

Рис. 2. Азотистые основания в ДНК подразделяются на пурины с двумя кольцами, аденин и гуанин, и пиримидины с одним кольцом, цитозин и тимин. Тимин уникален для ДНК.

Отдельные нуклеозидтрифосфаты соединяются друг с другом ковалентными связями, известными как 5ʹ-3ʹ фосфодиэфирные связи , или связями, посредством которых фосфатная группа, присоединенная к 5ʹ атому углерода одного нуклеотида, связывается с гидроксильной группой 3ʹ углерода сахара. следующего нуклеотида.Фосфодиэфирная связь между нуклеотидами образует сахарно-фосфатный каркас , чередующуюся сахарно-фосфатную структуру, составляющую каркас цепи нуклеиновой кислоты (рис. 3). В процессе полимеризации используются дезоксинуклеотидтрифосфаты (dNTP). Чтобы построить сахарно-фосфатный остов, два концевых фосфата высвобождаются из dNTP в виде пирофосфата. Полученная цепь нуклеиновой кислоты имеет свободную фосфатную группу на 5′-углеродном конце и свободную гидроксильную группу на 3′-углеродном конце.Две неиспользованные фосфатные группы из нуклеотидтрифосфата высвобождаются в виде пирофосфата во время образования фосфодиэфирной связи. Впоследствии пирофосфат гидролизуется, высвобождая энергию, используемую для полимеризации нуклеотидов.

Рис. 3. Фосфодиэфирные связи образуются между фосфатной группой, присоединенной к 5ʹ атому углерода одного нуклеотида, и гидроксильной группой 3ʹ углерода в следующем нуклеотиде, вызывая полимеризацию нуклеотидов в цепи нуклеиновой кислоты. Обратите внимание на 5ʹ и 3ʹ концы этой цепи нуклеиновой кислоты.

Подумай об этом

• Что означают 5ʹ и 3ʹ концы цепи нуклеиновой кислоты?

Открытие двойной спирали

К началу 1950-х годов накопилось немало свидетельств того, что ДНК является генетическим материалом клеток, и теперь гонка открыла ее трехмерную структуру. Примерно в это же время австрийский биохимик Эрвин Чаргафф (1905–2002) исследовал содержание ДНК у разных видов и обнаружил, что аденин, тимин, гуанин и цитозин не были обнаружены в равных количествах и что оно варьировалось от вида к виду. виды, но не между особями одного и того же вида.Он обнаружил, что количество аденина было очень близко к количеству тимина, а количество цитозина было очень близко к количеству гуанина, или A = T и G = C. Эти отношения также известны как правила Чаргаффа . .

Рис. 4. Рентгенограмма ДНК показывает ее спиральную природу. (кредит: Национальный институт здоровья)

Другие ученые также активно изучали эту область в середине 20-го века. В 1952 году американский ученый Линус Полинг (1901–1994) был ведущим в мире химиком-строителем и вероятным фаворитом в исследовании структуры ДНК.Полинг ранее открыл структуру α-спиралей белка, используя рентгеновскую дифракцию , и, основываясь на изображениях дифракции рентгеновских лучей ДНК, сделанных в его лаборатории, он предложил трехцепочечную модель ДНК. В то же время британские исследователи Розалинд Франклин (1920–1958) и ее аспирант Р.Г. Gosling также использовали дифракцию рентгеновских лучей, чтобы понять структуру ДНК (рис. 4). Благодаря научным знаниям Франклина были получены более четкие рентгеновские дифракционные изображения ДНК, которые ясно показали бы общую структуру двойной спирали ДНК.

Джеймс Уотсон (1928–), американский ученый, и Фрэнсис Крик (1916–2004), британский ученый, работали вместе в 1950-х годах над открытием структуры ДНК. Они использовали правил Чаргаффа и Франклина и Уилкинса рентгеновских дифракционных изображений волокон ДНК, чтобы соединить воедино пурин-пиримидиновые пары двойной спиральной молекулы ДНК (рис. 5). В апреле 1953 года Watson и Crick опубликовали свою модель двойной спирали ДНК в Nature .В этот же выпуск включены статьи Уилкинса и его коллег, каждая из которых описывает различные аспекты молекулярной структуры ДНК. В 1962 году Джеймс Уотсон, Фрэнсис Крик и Морис Уилкинс были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине. К сожалению, к тому времени Франклин умер, и Нобелевские премии в то время не были присуждены посмертно. Однако работа по изучению структуры ДНК продолжалась. В 1973 году Александр Рич (1924–2015) и его коллеги смогли проанализировать кристаллы ДНК для подтверждения и дальнейшего выяснения структуры ДНК.

Рис. 5. В 1953 году Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик построили эту модель структуры ДНК, показанную здесь на выставке в Музее науки в Лондоне.

Подумай об этом

• Каким ученым больше всего доверяют описание молекулярной структуры ДНК?

Структура ДНК

Уотсон и Крик предположили, что ДНК состоит из двух нитей, которые скручены друг вокруг друга, образуя правую спираль.Две цепи ДНК антипараллельны , так что 3ʹ конец одной цепи обращен к 5ʹ концу другой (рис. 6). 3′-конец каждой цепи имеет свободную гидроксильную группу, а 5′-конец каждой цепи имеет свободную фосфатную группу. Сахар и фосфат полимеризованных нуклеотидов образуют основу структуры, в то время как азотистые основания укладываются в стопку внутри. Эти азотистые основания внутри молекулы взаимодействуют друг с другом, образуя пары оснований.

Анализ дифрактограмм ДНК показал, что в ДНК содержится примерно 10 оснований на один виток.Асимметричное расположение сахарно-фосфатных скелетов формирует большие бороздки (где скелет находится далеко друг от друга) и малые бороздки (где скелет находится близко друг к другу) (Рисунок 6). Эти бороздки — места, где белки могут связываться с ДНК. Связывание этих белков может изменять структуру ДНК, регулировать репликацию или регулировать транскрипцию ДНК в РНК.

Рис. 6. Уотсон и Крик предложили модель двойной спирали для ДНК. (а) Сахарно-фосфатные скелеты находятся снаружи двойной спирали, а пурины и пиримидины образуют «ступеньки» лестницы спирали ДНК.(b) Две цепи ДНК антипараллельны друг другу. (c) Направление каждой цепи определяется нумерацией атомов углерода (от 1 до 5) в каждой молекуле сахара. 5ʹ конец — это тот, где углерод №5 не связан с другим нуклеотидом; 3ʹ конец — это тот, где углерод №3 не связан с другим нуклеотидом.

Спаривание оснований происходит между пурином и пиримидином. В ДНК аденин (A) и тимин (T) представляют собой комплементарных пар оснований , а цитозин (C) и гуанин (G) также являются комплементарными парами оснований, что объясняет правила Чаргаффа (рис. 7).Пары оснований стабилизированы водородными связями; аденин и тимин образуют между собой две водородные связи, тогда как цитозин и гуанин образуют между собой три водородные связи.

Рис. 7. Водородные связи образуются между комплементарными азотистыми основаниями внутри ДНК.

В лаборатории, подвергая две цепи ДНК двойной спирали воздействию высоких температур или определенных химических веществ, можно разорвать водородные связи между комплементарными основаниями, тем самым разделив цепи на две отдельные одинарные цепи ДНК (однониточная ДНК [ оцДНК ]).Этот процесс называется денатурацией ДНК и аналогичен денатурации белка, как описано в разделе «Белки». Нити оцДНК также могут быть снова собраны вместе в виде двухцепочечной ДНК ( дцДНК ) путем повторного отжига или ренатурации путем охлаждения или удаления химических денатурантов, позволяя этим водородным связям реформироваться. Способность искусственно манипулировать ДНК таким образом лежит в основе нескольких важных методов биотехнологии (рис. 8). Из-за дополнительной водородной связи между парой оснований C = G ДНК с высоким содержанием GC денатурировать труднее, чем ДНК с более низким содержанием GC.

Рис. 8. В лаборатории двойная спираль может быть денатурирована в одноцепочечную ДНК под воздействием тепла или химикатов, а затем ренатурирована путем охлаждения или удаления химических денатурантов, чтобы позволить цепям ДНК повторно отожиться. (кредит: модификация работы Эрнандеса-Лемуса Э., Никасио-Коллазо, Л.А., Кастаньеда-Приего, Р.)

Подумай об этом

• Какие две дополнительные пары оснований ДНК и как они связаны друг с другом?

Функция ДНК

хранит информацию, необходимую для построения клетки и управления ею.Передача этой информации от матери к дочерним клеткам называется вертикальным переносом генов и происходит в процессе репликации ДНК. ДНК реплицируется, когда клетка создает дубликат своей ДНК, затем клетка делится, что приводит к правильному распределению одной копии ДНК в каждой полученной клетке. ДНК также может подвергаться ферментативной деградации и использоваться в качестве источника нуклеозидов и нуклеотидов для клетки. В отличие от других макромолекул, ДНК не играет структурной роли в клетках.

Подумай об этом

• Как ДНК передает генетическую информацию потомству?

Прокладывая путь для женщин в науке и медицине

Исторически женщины были недопредставлены в науке и медицине, и часто их новаторский вклад оставался относительно незамеченным. Например, хотя Розалинда Франклин выполнила исследований дифракции рентгеновских лучей , демонстрирующих двойную спиральную структуру ДНК, именно Уотсон и Крик прославились этим открытием, опираясь на свои данные.До сих пор остаются большие разногласия по поводу того, было ли уместным получение ими ее данных и способствовали ли личные конфликты и гендерная предвзятость задержке признания ее значительного вклада. Точно так же Барбара МакКлинток провела новаторскую работу в области генетики кукурузы (кукурузы) с 1930-х по 1950-е годы, открыв транспозонов (прыгающие гены), но она была признана намного позже, получив Нобелевскую премию по физиологии и медицине в 1983 году ( Рисунок 9).

Сегодня женщины по-прежнему недопредставлены во многих областях науки и медицины. В то время как более половины ученых степеней бакалавра естественных наук присуждается женщинам, только 46% ученых степеней доктора наук присуждаются женщинам. В академических кругах число женщин на каждом уровне карьерного роста продолжает уменьшаться, при этом женщины занимают менее одной трети должностей ученых с докторской степенью на штатных должностях и менее четверти должностей. полное профессорство в 4-летних колледжах и университетах.Даже в медицинских профессиях, как и почти во всех других областях, женщины часто недопредставлены во многих медицинских профессиях и зарабатывают значительно меньше, чем их коллеги-мужчины, как показано в исследовании 2013 года, опубликованном в журнале Американской медицинской ассоциации .

Почему такое неравенство продолжает существовать и как нам разорвать эти циклы? Ситуация сложна и, вероятно, является результатом сочетания различных факторов, в том числе того, как общество определяет поведение девочек с раннего возраста и поддерживает их интересы как в профессиональном, так и в личном плане.Некоторые считают, что женщины не принадлежат к лаборатории, в том числе лауреат Нобелевской премии Тим Хант, чьи публичные комментарии 2015 года о том, что женщины слишком эмоциональны для науки, были встречены повсеместным осуждением.

Возможно, девочек с раннего возраста следует больше поддерживать в области естественных наук и математики (рис. 9). Программы в области науки, технологий, инженерии и математики (STEM), спонсируемые Американской ассоциацией женщин с университетским образованием (AAUW) и Национальным управлением по аэронавтике и исследованию космического пространства (NASA), являются прекрасными примерами программ, которые предлагают такую ​​поддержку.Вклад женщин в науку должен быть более широко известен общественности, а маркетинг, ориентированный на молодых девушек, должен включать больше изображений исторически и профессионально успешных женщин-ученых и медицинских работников, поощряя все яркие молодые умы, включая девушек и женщин, к продолжению карьеры. в науке и медицине.

Рис. 9. (a) Работа Барбары МакКлинток по генетике кукурузы в 1930-1950-х годах привела к открытию транспозонов, но в то время ее значение не было признано.(b) Усилия по наставничеству и постоянной социальной поддержке женщин в науке и медицине могут когда-нибудь помочь решить некоторые из проблем, препятствующих гендерному равенству на всех уровнях в науке и медицине. (кредит a: модификация работы Смитсоновского института; кредит b: модификация работы Haynie SL, Hinkle AS, Jones NL, Martin CA, Olsiewski PJ, Roberts MF)

Клиническое направление: Аамир, часть 2

Этот пример продолжает историю Аамира, начатую с книги «Использование микробиологии для открытия секретов жизни».

Основываясь на симптомах, врач Аамира подозревает, что он страдает пищевым заболеванием, которое он приобрел во время своих путешествий. Возможные варианты включают бактериальную инфекцию (например, энтеротоксигенный E. coli , Vibrio cholerae , Campylobacter jejuni , Salmonella ), вирусную инфекцию (ротавирусную или протозойную инфекцию), Giardia lamblia , Cryptosporidium parvum или Entamoeba histolytica ).

Его врач назначает образец стула для выявления возможных возбудителей (например, бактерий, кист) и поиска крови из-за определенных типов инфекционных агентов (например, C. jejuni , Salmonella и E. histolytica). ) связаны с выделением кровавого стула.

Образец стула Аамира не показал ни крови, ни кист. После анализа образца стула и на основании его недавней истории путешествий врач больницы заподозрил, что Аамир страдает диареей путешественников, вызванной энтеротоксигенным возбудителем E.coli ( ETEC ), возбудитель диареи большинства путешественников. Чтобы проверить диагноз и исключить другие возможности, врач Аамира заказал диагностический лабораторный анализ его стула для поиска последовательностей ДНК, кодирующих специфические факторы вирулентности ETEC. Врач посоветовал Аамиру пить много жидкости, чтобы восполнить то, что он теряет, и выписал его из больницы.

ETEC продуцирует несколько факторов вирулентности, кодируемых плазмидами, которые делают его патогенным по сравнению с типичным E.coli . К ним относятся секретируемые токсины , термолабильный энтеротоксин (LT) и термостабильный энтеротоксин (ST) (ST) , а также фактор колонизации (CF) . И LT, и ST вызывают выведение ионов хлора из кишечных клеток в просвет кишечника, вызывая, как следствие, потерю воды из кишечных клеток, что приводит к диарее. CF кодирует бактериальный белок, который помогает бактериям прилипать к слизистой оболочке тонкой кишки.

• Почему врач Аамира использовал генетический анализ вместо выделения бактерий из образца стула или прямого окрашивания по Граму только образца стула?

Мы вернемся к примеру Аамира на следующих страницах.

Основные понятия и краткое изложение

• Нуклеиновые кислоты состоят из нуклеотидов , каждый из которых содержит пентозный сахар, фосфатную группу и азотистого основания . дезоксирибонуклеотидов в ДНК содержат дезоксирибозу в качестве пентозного сахара.
ДНК
• содержит пиримидинов цитозин и тимин , а также пуринов аденин и гуанин .
• Нуклеотиды связаны друг с другом фосфодиэфирными связями между 5′-фосфатной группой одного нуклеотида и 3′-гидроксильной группой другого. Нить нуклеиновой кислоты имеет свободную фосфатную группу на 5′-конце и свободную гидроксильную группу на 3′-конце.
• Чаргафф обнаружил, что количество аденина примерно равно количеству тимина в ДНК, и что количество гуанина примерно равно цитозину .Позднее было установлено, что эти отношения связаны с дополнительным спариванием оснований.
• Уотсон и Крик, опираясь на работы Чаргаффа, Франклина, Гослинга и Уилкинса, предложили модель двойной спирали и спаривание оснований для структуры ДНК.
ДНК
• состоит из двух комплементарных цепей, ориентированных на антипараллельно друг другу с фосфодиэфирными остовами на внешней стороне молекулы. Азотистые основания каждой нити обращены друг к другу, а дополнительные водородные связи оснований связываются друг с другом, стабилизируя двойную спираль.
• Тепло или химические вещества могут разорвать водородные связи между комплементарными основаниями, денатурируя ДНК. Охлаждение или удаление химикатов может привести к ренатурации или повторному отжигу ДНК, позволяя водородным связям реформироваться между дополнительными основаниями.
• ДНК хранит инструкции, необходимые для создания клетки и управления ею. Эта информация передается от родителей к потомству посредством вертикального переноса генов .

Множественный выбор

Что из перечисленного не встречается в ДНК?

1. тимин
2. фосфодиэфирные связи
3. комплементарная пара оснований
4. аминокислот