Содержание

нуклеиновые кислоты | Тест по биологии (9 класс) по теме:

1 вариант

  1. Общим между вторичной структурой белка и комплементарными цепями ДНК являются:

А) состав мономеров;

Б) образование пептидных связей;

В) удержание структуры водородными связями;

Г) способность к репликации.

  1. Нуклеотид  ДНК состоит из:

А) рибозы, остатка фосфорной кислоты, тимина;

Б) дезоксирибозы, остатка фосфорной кислоты, урацила;

В) дезоксирибозы, остатка фосфорной кислоты, аденина;

Г) рибозы, остатка фосфорной кислоты, гуанина.

  1. Напишите цепь ДНК, комплементарную показанной цепи и-РНК:

УАА-ЦГГ-ААЦ-ГАУ

  1. В состав нуклеотидов ДНК не входит:

А) аденин                                Б) гуанин

В) урацил                                Г) тимин

  1. Если фрагмент ДНК имеет строение ГТТ-АГЦ-ТГА, то образовавшаяся в результате считывания  и-РНК будет  состоять из:

А) ГТТ-АГЦ-ТГА

Б) ГУУ-АГЦ-УГА

В) ЦАА-УЦГ-АЦУ

Г) ЦАА-ТЦГ-АЦТ

  1. Если в молекуле ДНК находится 200 адениновых нуклеотидов, что составляет 20% от общего количества, то сколько всего нуклеотидов в ней содержится:

А) 1000;                 Б) 600;                        В) 300;                                Г) 200.

2 вариант

  1. Мономерами ДНК и РНК являются:

А) азотистые основания;

Б) дезоксирибоза и рибоза;

В) азотистые основания  и фосфатные группы;

Г) нуклеотиды.

  1. Нуклеотид РНК состоит из:

А) рибозы, остатка фосфорной кислоты, тимина;

Б) дезоксирибозы, остатка фосфорной кислоты, урацила;

В) дезоксирибозы, остатка фосфорной кислоты, аденина;

Г) рибозы, остатка фосфорной кислоты, урацила.

  1. Напишите цепь ДНК, комплементарную показанной цепи и-РНК:

ААГ-УЦУ-ЦГА-ТЦУ

  1. В состав нуклеотидов РНК не входит:

А) аденин                                Б) гуанин

В) урацил                                Г) тимин

  1. Если фрагмент ДНК имеет строение ГАТ-ЦГА-ТЦТ, то образовавшаяся в результате считывания  и-РНК будет  состоять из:

А) ГАТ-ЦГА-ТЦТ

Б) ГАУ-ЦГТ-ТЦУ

В) ЦУУ-ГЦТ-АГУ

Г) ЦУА-ГЦУ-АГА

  1. Если в молекуле ДНК находится 300 адениновых нуклеотидов, что составляет 15% от общего количества, то сколько всего нуклеотидов в ней содержится:

А) 1000;                 Б) 2000;                        В) 300;                                Г) 1200.

Тест: Тест «Нуклеиновые кислоты» — Биология 10 класс

Тест «Нуклеиновые кислоты»

Из предложенных вариантов ответов выбирете только один правильный.

Биология 10 класс | ID: 742 | Дата: 7.1.2014

«;} else {document.getElementById(«torf1″).innerHTML=»»;}; if (answ.charAt(1)==»1″) {document.getElementById(«torf2″).innerHTML=»»;} else {document.getElementById(«torf2″).innerHTML=»»;}; if (answ.charAt(2)==»1″) {document.getElementById(«torf3″).innerHTML=»»;} else {document.getElementById(«torf3″).innerHTML=»»;}; if (answ.charAt(3)==»1″) {document.getElementById(«torf4″).innerHTML=»»;} else {document.getElementById(«torf4″).innerHTML=»»;}; if (answ.charAt(4)==»1″) {document.getElementById(«torf5″).innerHTML=»»;} else {document.getElementById(«torf5″).innerHTML=»»;}; if (answ.charAt(5)==»1″) {document.getElementById(«torf6″).innerHTML=»»;} else {document.getElementById(«torf6″).innerHTML=»»;}; if (answ.charAt(6)==»1″) {document.getElementById(«torf7″).innerHTML=»»;} else {document.getElementById(«torf7″).innerHTML=»»;}; if (answ.charAt(7)==»1″) {document.getElementById(«torf8″).innerHTML=»»;} else {document.getElementById(«torf8″).innerHTML=»»;}; if (answ.charAt(8)==»1″) {document.getElementById(«torf9″).innerHTML=»»;} else {document.getElementById(«torf9″).innerHTML=»»;}; if (answ.charAt(9)==»1″) {document.getElementById(«torf10″).innerHTML=»»;} else {document.getElementById(«torf10″).innerHTML=»»;}; if (answ.charAt(10)==»1″) {document.getElementById(«torf11″).innerHTML=»»;} else {document.getElementById(«torf11″).innerHTML=»»;}; if (answ.charAt(11)==»1″) {document.getElementById(«torf12″).innerHTML=»»;} else {document.getElementById(«torf12″).innerHTML=»»;}; if (answ.charAt(12)==»1″) {document.getElementById(«torf13″).innerHTML=»»;} else {document.getElementById(«torf13″).innerHTML=»»;}; if (answ.charAt(13)==»1″) {document.getElementById(«torf14″).innerHTML=»»;} else {document.getElementById(«torf14″).innerHTML=»»;}; if (answ.charAt(14)==»1″) {document.getElementById(«torf15″).innerHTML=»»;} else {document.getElementById(«torf15″).innerHTML=»»;}; if (answ.charAt(15)==»1″) {document.getElementById(«torf16″).innerHTML=»»;} else {document.getElementById(«torf16″).innerHTML=»»;}; if (answ.charAt(16)==»1″) {document.getElementById(«torf17″).innerHTML=»»;} else {document.getElementById(«torf17″).innerHTML=»»;}; if (answ.charAt(17)==»1″) {document.getElementById(«torf18″).innerHTML=»»;} else {document.getElementById(«torf18″).innerHTML=»»;}; if (answ.charAt(18)==»1″) {document.getElementById(«torf19″).innerHTML=»»;} else {document.getElementById(«torf19″).innerHTML=»»;}; if (answ.charAt(19)==»1″) {document.getElementById(«torf20″).innerHTML=»»;} else {document.getElementById(«torf20″).innerHTML=»»;}; if (answ.charAt(20)==»1″) {document.getElementById(«torf21″).innerHTML=»»;} else {document.getElementById(«torf21″).innerHTML=»»;}; if (answ.charAt(21)==»1″) {document.getElementById(«torf22″).innerHTML=»»;} else {document.getElementById(«torf22″).innerHTML=»»;}; if (answ.charAt(22)==»1″) {document.getElementById(«torf23″).innerHTML=»»;} else {document.getElementById(«torf23″).innerHTML=»»;}; if (answ.charAt(23)==»1″) {document.getElementById(«torf24″).innerHTML=»»;} else {document.getElementById(«torf24″).innerHTML=»»;}; if (answ.charAt(24)==»1″) {document.getElementById(«torf25″).innerHTML=»»;} else {document.getElementById(«torf25″).innerHTML=»»;}; if (answ.charAt(25)==»1″) {document.getElementById(«torf26″).innerHTML=»»;} else {document.getElementById(«torf26″).innerHTML=»»;}; if (answ.charAt(26)==»1″) {document.getElementById(«torf27″).innerHTML=»»;} else {document.getElementById(«torf27″).innerHTML=»»;}; if (answ.charAt(27)==»1″) {document.getElementById(«torf28″).innerHTML=»»;} else {document.getElementById(«torf28″).innerHTML=»»;}; if (answ.charAt(28)==»1″) {document.getElementById(«torf29″).innerHTML=»»;} else {document.getElementById(«torf29″).innerHTML=»»;}; if (answ.charAt(29)==»1″) {document.getElementById(«torf30″).innerHTML=»»;} else {document.getElementById(«torf30″).innerHTML=»»;}; } }

Получение сертификата
о прохождении теста

Всероссийская интернет-олимпиада по нанотехнологиям

Комплекс предметов

Категория участников: школьники 5-11 классов

Начало теста: 23 ноября 2020 г.

Завершение теста: 31 января 2021 г.

Максимальный балл по тесту: 40

В тесте собраны очень простые (для 5-7 класса), простые (8-9 класс) и обычные (10-11 класс) вопросы в области нанотехнологий и наноматериалов, в том числе основанные на материалах занятий в Заочной НаноТехнологической Школе (ЗНТШ). Некоторые из вопросов требуют простых рассуждений и несложных расчетов.

 

В каждом вопросе только один ответ правильный, он оценивается 1 баллом для простых и очень простых вопросов и 2 баллами для «обычных вопросов».

 

Половина балла(ов) дается за правильный номер ответа в каждом вопросе, а половина – за правильные краткие обоснования выбранного ответа, которые будет оценивать жюри во время ручной проверки.

 

Тест ЗНТШ могут пройти все участники Олимпиады и получить дополнительные баллы (25% от набранных, максимум 10 баллов) за отборочный тур вплоть до окончания сроков приема работ на конкурс по комплексу предметов «химия, физика, математика, биология» (до 25 января 2021 г.). Даже те участники, которые не занимались в ЗНТШ в дистанционном режиме или не смотрели записи занятий, могут пройти тест для получения дополнительных баллов и повышения шансов попасть на заключительный тур Олимпиады, но без получения сертификатов ЗНТШ. В то же время, сертификаты слушателей (выпускников) ЗНТШ будут выданы только тем участникам, кто успешно прослушает лекции ЗНТШ, а также до 30 ноября 2020 г. пройдет данный контрольный тест, по итогам которого наберет не менее 60% баллов.

 

Материалы (видеозаписи) ЗНТШ собраны в этой новости.

 

Скачать официальное решение

 

Тест закрыт.

Вопросы

Вопрос №1

СОВСЕМ ПРОСТОЙ ВОПРОС 1.

 

Бакибол представляет собой:

1) выпуклый многогранник, состоящий из правильных пяти- и шестиугольников, в вершинах которого сходятся по три ребра;

2) усеченный икосаэдр;

3) Архимедово тело.

 

верно только первое утверждение

верно только второе утверждение

верно только третье утверждение

верны только первое и второе утверждения

верны только первое и третье утверждения

верны только второе и третье утверждения

все три утверждения верны

ни одно утверждение не верно


Вопрос №2

СОВСЕМ ПРОСТОЙ ВОПРОС 2.

 

Какой из многогранников НЕ является Платоновым телом?

 

правильная треугольная пирамида

правильная треугольная бипирамида

правильная треугольная антипризма

правильная четырехугольная бипирамида

скручено удлиненная правильная пятиугольная бипирамида


Вопрос №3

СОВСЕМ ПРОСТОЙ ВОПРОС 3.

 

К углеродным наноматериалам НЕ относится:

 

графан

графен

грифон

все относятся

все не относятся


Вопрос №4

СОВСЕМ ПРОСТОЙ ВОПРОС 4.

 

Во сколько раз увеличится удельная площадь поверхности (то есть, приходящаяся на один грамм) материала, если размер составляющих его кубических частиц уменьшить в 1000 раз?

 

в 10

в 100

в 1000

в 10000

в 100000

в 1000000

не изменится


Вопрос №5

СОВСЕМ ПРОСТОЙ ВОПРОС 5.

 

На конец 2020 самая высокая из достигнутых плотность размещения транзисторов в микропроцессоре ‒ 250 миллионов на 1 мм2. Закон Мура гласит, что количество транзисторов, размещаемых на кристалле интегральной схемы, удваивается каждые 2 года, следовательно, при постоянстве размера микросхемы, в 2030 году на один транзистор будет приходиться площадь, равная:

 

3,9 нм2

10 нм2

12,5 нм2

62,5 нм2

125 нм2

150 нм2

250 нм2

500 нм2

1000 нм2

2000 нм2


Вопрос №6

СОВСЕМ ПРОСТОЙ ВОПРОС 6.

 

Приобретенный иммунитет связан с одним из указанных типов клеток:

 

эритроциты

тромбоциты

нейтрофилы

базофилы

макрофаги

лимфоциты

астроциты

адипоциты

миоциты

остеокласты


Вопрос №7

СОВСЕМ ПРОСТОЙ ВОПРОС 7.

 

К сумчатым не относится (ВНИМАНИЕ! Слово «сумчатый» в названии животного может быть пропущено!!!):

 

опоссум

мышь

вомбат

валлаби

опоссум

куница

бандикут

ехидна

коала

крот


Вопрос №8

СОВСЕМ ПРОСТОЙ ВОПРОС 8.

 

Определите по диаграмме, к какому семейству относится данный цветок?

 

злаковые (Poaceae)

астровые (Asteraceae)

крестоцветные (Brassicaceae)

зонтичные (Apiaceae)

пасленовые (Solanaceae)

вьюнковые (Convolvulaceae)

бобовые (Fabaceae)

розовые (Rosaceae)

лилейные (Liliaceae)


Вопрос №9

СОВСЕМ ПРОСТОЙ ВОПРОС 9.

 

У каких животных отсутствуют специализированные органы дыхания и кровеносная система?

 

плоские черви

кольчатые черви

моллюски

ракообразные

паукообразные

насекомые

рыбы


Вопрос №10

СОВСЕМ ПРОСТОЙ ВОПРОС 10.

 

Присутствуют жабры, незамкнутая кровеносная и отсутствуют почки у:

 

кишечнополостных и губок

плоских червей

круглых червей

кольчатых червей

моллюсков

ракообразных

паукообразных

насекомых

рыб


Вопрос №11

ПРОСТОЙ ВОПРОС 11.

 

Митохондрии – это клеточные «электростанции». Исходя из их основной функции, ответьте на вопрос, в каком из этих типов клеток в норме наименьшее количество митохондрий?

 

кардиомиоциты

астроциты

гепатоциты

белые адипоциты

тромбоциты

бурые адипоциты

нейроны

макрофаги

фибробласты

миоциты


Вопрос №12

ПРОСТОЙ ВОПРОС 12.

 

Согласно системе Вёзе, введенной в 1990 году, древо жизни состоит из трех доменов (надцарств): археи, бактерии и эукариоты. Какие из этих структур отсутствуют у эукариот?

 

плазмолемма

рибосомы

митохондрии

ядро

пили

клеточная стенка

ядрышки

лизосомы

комплекс Гольджи

вакуоли


Вопрос №13

ПРОСТОЙ ВОПРОС 13.

 

Каково наиболее полное определение гликолиза?

 

Катаболический путь в клетке, в результате которого образуется 4 молекулы АТФ.

Процесс расщепления глюкозы на две молекулы пировиноградной кислоты.

Процесс расщепления глюкозы на две молекулы лактата.

Катаболический путь обмена веществ в цитоплазме.

Процесс клеточного дыхания, в котором глюкоза расщепляется с образованием 2 молекул НАДН.

Процесс в результате которого потребляется две молекулы АТФ.


Вопрос №14

ПРОСТОЙ ВОПРОС 14.

 

В прошлом веке шахтеры использовали в качестве светильников сушеную рыбу. Как называется явление, благодаря которому рыба светилась (выберите наиболее точный ответ)?

 

фосфоресценция

флуоресценция

хемилюминесценция

радиолюминесценция

термолюминесценция

электролюминесценция

сонолюминесценция

триболюминесценция

абсорбция

рассеяние


Вопрос №15

ПРОСТОЙ ВОПРОС 15.

 

Активные формы кислорода (АФК) – соединения кислорода с высокой реакционной способностью, окисляющие практически все классы биомолекул – белки, липиды, нуклеиновые кислоты и углеводы. В организме они в небольшом количестве образуются в норме и выполняют различные функции, выступая в роли сигнальных молекул или участвуя в иммунном ответе. Какая из АФК является продуктом одноэлектронного восстановления молекулярного кислорода?

 

синглетный кислород

перекись водорода

гидроксил радикал

супероксид-анион радикал

гидроперекиси липидов

пероксинитрит-анион

оксид азота NO

хлорноватистая кислота HClO

алкоксил радикал RO

ион нитрозония NO+


Вопрос №16

ПРОСТОЙ ВОПРОС 16.

 

Электронная микроскопия позволяет изучать нанообъекты, которые невозможно рассмотреть в оптический микроскоп. Связано это с принципиальным отличием этих методов исследования: в электронном микроскопе изображение формируется вследствие взаимодействия ускоренных электронов с изучаемым объектом, а в оптическом – в результате облучения светом в видимом диапазоне. Почему при изучении наноразмерных объектов из оксида алюминия методом электронной микроскопии их рёбра и вершины оказываются более яркими, чем грани?

 

Это связано с особенностями освещения исследуемого объекта в камере электронного микроскопа.

Это связано с люминесценцией оксида алюминия.

Это связано с более интенсивным накоплением электрического заряда на рёбрах и вершинах по сравнению с плоской поверхностью граней.

Это связано с более интенсивным поглощением электронов плоской поверхностью граней по сравнению с рёбрами и вершинами.

Это связано с испарением оксида алюминия и свечением молекул в газовой фазе.

Это всего лишь дефект микрофотографии, который не связан с какими-либо физическими явлениями.


Вопрос №17

ПРОСТОЙ ВОПРОС 17.

 

Одним из наиболее перспективных мембранных материалов является анодный оксид алюминия, в котором все поры, имеющие практически одинаковый диаметр (бывает в диапазоне от 10 до 200 нм), образуют высокоупорядоченную структуру. На рисунке представлена микрофотография такой мембраны с увеличением 200000 раз. Чем являются чёрные кружки на микрофотографии?

 

мембранами, каждая из которых закреплена в своей шестиугольной ячейке

атомами алюминия

атомами кислорода

интерференционными рефлексами

порами одной мембраны

контактами, обеспечивающими закрепление мембраны на предметном столике


Вопрос №18

ПРОСТОЙ ВОПРОС 18.

 

Одним из наиболее известных двумерных материалов является графен, который представляет собой углеродный слой толщиной в один атом. В идеальном бездефектном графеновом листе атомы углерода расположены так, что занимают вершины правильных шестиугольников. Какой из перечисленных ниже нанообъектов невозможно получить при сворачивании графенового листа или его части?

 

одностенная углеродная нанотрубка

многостенная углеродная нанотрубка

наноалмаз

фуллерен


Вопрос №19

ПРОСТОЙ ВОПРОС 19.

 

Известно, что истинный и коллоидный растворы можно легко отличить, если посветить на них лазером: в одном из растворов луч будет хорошо различим, а через другой пройдёт, не оставляя никакого следа. Описанное явление носит название «эффект Тиндаля». С чем связано различное поведение луча в истинном и коллоидном растворе?

 

В отличие от истинного раствора, любой коллоидный раствор флуоресцирует под действием лазера.

В отличие от истинного раствора, коллоидный раствор сильно рассеивает свет.

В отличие от коллоидного раствора, любой истинный раствор сильно поглощает свет, поэтому луч в нём не виден.

В отличие от коллоидного раствора, любой истинный раствор не пропускает через себя свет в видимом диапазоне.

Под действием света в любом коллоидном растворе взвешенные наночастицы слипаются в более крупные структуры, которые видны невооружённым глазом.

Истинный раствор сильный рассеивает свет, а коллоидный раствор, напротив, фокусирует его в яркий луч.


Вопрос №20

ПРОСТОЙ ВОПРОС 20.

 

Потенциальной областью применения углеродных нанотрубок является изготовление волокон и канатов для подъёма различных грузов, что связано с их уникальными свойствами. Какое из перечисленных ниже свойств углеродных нанотрубок НЕ имеет значения при создании таких волокон?

 

высокая прочность на разрыв

высокий модуль Юнга

высокая электропроводность

низкая плотность

малая концентрация структурных дефектов


Вопрос №21

ВОПРОС 21.

 

По медному проводнику протекает ток, сила которого равна I1 = 1 нА, а по алюминиевому – ток силой I2 = 2 нА. Проводники имеют одинаковую площадь сечения. Чему равно отношение мощности, выделяющейся в алюминии, к мощности, выделяющейся в меди, если длины проводников одинаковы?

 

0,5

2

4

1

6,5


Вопрос №22

ВОПРОС 22.

 

В масс-спектрометр попадают два сорта ионов. Оба сорта имеют элементарный заряд. Масса ионов второго сорта в 6 раз больше, чем первого. Но скорость ионов второго сорта в 2 раз меньше, чем первого. Как отличаются радиусы траекторий частиц первого и второго сорта?

 

у частиц второго сорта в 12 раз больше радиус

у частиц второго сорта в 3 раза больше радиус

у частиц первого сорта в 12 раз больше радиус

у частиц первого сорта в 24 раза больше радиус

у частиц второго сорта в 3 раза меньше радиус


Вопрос №23

ВОПРОС 23.

 

Для исследования нанообъектов используется электронный микроскоп. Какова скорость электрона, если ускоряющее напряжение U = 120 В.

 

6,5•103 м/с

6,5•103 км/с

2,9•105 км/с

1,9•10-17 м/с

4,4•10-9 м/с


Вопрос №24

ВОПРОС 24.

 

Для опытов по фотоэффекту металлическую пластину с работой выхода 1,9 эВ облучают светом с длиной волны λ = 3•10-7 м. Затем длину волны увеличивают в 2 раза, а число фотонов в 3 раза. Как изменится число электронов, покидающих пластину?

 

увеличится в 6 раз

увеличится в 2 раза

увеличится в 3 раза

станет равным нулю

уменьшится в 6 раз


Вопрос №25

ВОПРОС 25.

 

Мнимое прямое увеличенное изображение формируется:

 

рассеивающей линзой, если предмет находится между фокусом и линзой

рассеивающей линзой, если предмет находится за фокусом

собирающей линзой, если предмет находится между фокусом и линзой

собирающей линзой, если предмет находится за фокусом

собирающей линзой, если предмет находится за двойным фокусным расстоянием


Вопрос №26

ВОПРОС 26.

 

Конструкция в виде полусферы, состоящей из треугольников, − геодезический купол − была изобретена в середине XX века архитектором Ричардом Бакминстером Фуллером.
Если каркас беседки, приведенный на рисунке, уменьшить до наноразмеров и мысленно полностью «достроить» до соответствующего ему многогранника (обладающего симметрией икосаэдра), а в центре каждой из треугольных граней такого многогранника расположить атом углерода, то сколько атомов будет содержать полученный фуллерен?

 

20

60

80

120

180

240

полученный многогранник не отвечает никакой молекуле фуллерена


Вопрос №27

ВОПРОС 27.

 

Длина генома РНК-вируса SARS-CoV-2, ответственного за пандемию COVID-19, составляет 29896 нуклеотидов. Сколько байт памяти потребуется, чтобы записать такой геном, если молекула РНК состоит из 4 «букв»-нуклеотидов, а каждая из них кодируется самым простым двоичным кодом?

 

3737

7474

14948

29896

59792

119584


Вопрос №28

ВОПРОС 28.

 

Оцените, как масса фотонного кристалла, сложенного из микросфер SiO2 способом а), отличается от массы фотонного кристалла того же объема, но сложенного из этих микросфер способом б).

 

в 4 раза больше

в 4 раза меньше

в 2,6 раза больше

в 2,6 раза меньше

в 1,4 раза больше

в 1,4 раза меньше

в 0,7 раз больше

в 0,7 раз меньше

не отличается


Вопрос №29

ВОПРОС 29.

 

Из атомов, лежащих в поверхностном слое кубического нанокластера, на ребро которого приходится n атомов металла, можно без остатка «собрать» нанокластер в форме тетраэдра, на ребро которого приходится n + 2 атома. Чему равно n?


Общее число атомов металла в тетраэдрическом нанокластере, на ребро которого приходится m атомов, составляет Td(m) = (m3 + 3m2 + 2m)/6.

 

2

3

4

5

6

7

8

задача не имеет решения

задача имеет больше одного решения


Вопрос №30

ВОПРОС 30.

 

При равной плотности и величине удельной площади поверхности (в м2/г) НАИБОЛЬШИЙ размер (как диаметр описанной вокруг нее сферы) имеет наночастица в форме:

 

шара

куба

цилиндра с h = d

все три частицы имеют одинаковый размер



Тестовая проверочная работа по теме «Нуклеиновые кислоты»

Проверочная работа по теме «Нуклеиновые кислоты», 10 класс

ЧАСТЬ 1

  1. Какой процент нуклеотидов с цитозином содержит ДНК, если доля её адениновых нуклеотидов составляет 20% от общего числа?

А) 40% Б) 45% В)80% Г) 30%

2. Укажите состав одного из нуклеотидов ДНК:

а) рибоза, остаток фосфорной кислоты, тимин

б) фосфорная кислота, урацил, дезоксирибоза

в) остаток фосфорной кислоты, дезоксирибоза, аденин

г) остаток фосфорной кислоты, рибоза, гуанин

3. Мономерами ДНК и РНК являются:

а) азотистые основания б) дезоксирибоза или рибоза

в) аминокислоты г) нуклеотиды

4. Фосфорная кислота входит в состав:

а) углеводов б) нуклеиновых кислот в) белков

  1. Молекулы ДНК:

а) доставляют к рибосоме аминокислоты

б) передают информацию о строении белка в цитоплазму

в) хранят наследственную информацию о всех свойствах клетки и организма в целом

г) определяют структуру рибосом

6. Комплементарными основаниями являются:

а) аденин – цитозин б) гуанин — аденин в) тимин – аденин

7. Укажите неверное утверждение: молекулы ДНК находятся в:

а) митохондриях б) хлоропластах в) ядрах г) комплексе Гольджи

8. Тимин образует комплементарную связь с :

а) цитозином б) гуанином в) аденином

9. Вторичную структуру в виде двойной спирали имеют молекулы:

а) белка б) ДНК в) РНК г) АТФ

10. Молекула ДНК состоит из:

а) нуклеотидов б) белков в) липидов г) все ответы верны

11. Нуклеотиды состоят из:

а) азотистого основания б) дезоксирибозы (рибозы)

в) остатка фосфорной кислоты г) все ответы верны

12. Фермент, участвующий в репликации ДНК:

а) амилаза б) ДНК – полимераза в) РНК – полимераза

13. В молекуле РНК в отличие от молекулы ДНК тимин замещен на:

а) цитозин б) гуанин в) урацил г) аденин

14. Репликация молекулы ДНК это:

а) образование белка б) синтез РНК в) удвоение молекулы ДНК

ЧАСТЬ 2

1. Установите соответствие между названием вещества и особенностями его строения.

ОСОБЕННОСТИ СТРОЕНИЯ ВЕЩЕСТВА ВЕЩЕСТВО

А) Одноцепочечная молекула

Б) Состоит из нуклеотидов: АУГЦ 1. ДНК

В) Состоит из нуклеотидов: АТГЦ 2. РНК

Г) Спиралевидная молекула

Д) Содержит рибозу

Е) Содержит дезоксирибозу

Ответы на тест «Нуклеиновые кислоты» 10 класс

ФИО ______________________________________________________________________________

ЧАСТЬ 1

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

ЧАСТЬ 2

Балл _______ Отметка______

,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

Ответы на тест «Нуклеиновые кислоты» 10 класс

ФИО ______________________________________________________________________________

ЧАСТЬ 1

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

ЧАСТЬ 2

Балл _______ Отметка______

,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

Ответы на тест «Нуклеиновые кислоты» 10 класс

ФИО ______________________________________________________________________________

ЧАСТЬ 1

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

ЧАСТЬ 2

Балл _______ Отметка______

,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

Ответы на тест «Нуклеиновые кислоты» 10 класс

ФИО ______________________________________________________________________________

ЧАСТЬ 1

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

ЧАСТЬ 2

Балл _______ Отметка______

,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

Ответы на тест «Нуклеиновые кислоты» 10 класс

ФИО ______________________________________________________________________________

ЧАСТЬ 1

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

ЧАСТЬ 2

Балл _______ Отметка______

ОБРАЗЕЦ

Ответы на тест «Нуклеиновые кислоты» 10 класс

ФИО ______________________________________________________________________________

ЧАСТЬ 1

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

г

в

г

б

в

в

г

в

б

а

г

в

в

в

ЧАСТЬ 2

А

Б

В

Г

Д

Е

2

2

1

1

2

1

Балл _______ Отметка______

,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

Тест по биологии 9 класс Химический состав клетки с ответами

Тесты по биологии 9 класс. Тема: «Химический состав клетки»

Правильный вариант ответа отмечен знаком +

1) Живая клетка отличается повышенным содержанием двух компонентов, укажите каких:

А) вода, минеральные вещества;

Б) аминокислоты, простые сахара;

В) соли, белки;

+Г) вода, сложные органические вещества.

2) Способность клетки сохранять устойчивость состава и свойств называется:

А) гемодиализ;

+Б) гомеостаз;

В) гемодилюция;

Г) гемодинамика.

3) Укажите неорганические веществ, входящие в состав клетки:

А) вода;

Б) минеральные соли;

В) углекислый газ;

+Г) все ответы верны.

4) Укажите органические вещества, входящие в состав клеток:

А) нуклеиновые кислоты;

Б) белки;

В) жиры;

+Г) все ответы верны.

5) Проведите группировку характеристик воды и минеральных солей в соответствие с их признаками и функциями в клетке:

Наименование

А. Вода

Б. Минеральные соли

Характеристика

1

Занимает 1,5% массы клетки

2

Занимает 70% массы клетки

3

Может быть в форме кристаллов

4

Участвует в построении органических молекул

5

Обеспечивает постоянство состава

6

В растворенном виде создает необходимую среду для химических процессов в клетке

7

Придает клетки упругость и объем

+А) А: 2,4,5,7; Б: 1,3,6;

Б) А: 1,2,6; Б: 3,4,5,7;

В) А: 1,3,6; Б: 2,4,5,7.

6) Самым важным элементом органических соединений является:

А) йод;

+Б) углерод;

В) кальций;

Г) азот.

7) Укажите функцию углеводов в клетке:

А) энергетическая, защитная;

Б) входят в состав гормонов, участвуют в регуляции обмена веществ

В) резервная;

Г) верны ответы А, Б;

+Д) верны ответы: А, В.

8) Укажите пример полимера углеводов:

+А) гликоген;

Б) пентоза;

В) гексоза;

Г) все ответы верны.

9) Укажите ультрамикроэлемент, входящий в состав клеток:

А) кислород;

Б) водород;

+В) ртуть;

Г) кальций.

тест 10) Что изображено на рисунке?

А) молекула мономера;

+Б) молекула полимера;

В) молекула воды;

Г) атом углерода.

11) Мономерами углеводов являются:

+А) моносахариды;

Б) гликоген;

В) крахмал;

Г) целлюлоза.

12) Выберите неверное утверждение об углеводах:

А) моносахариды сладкие на вкус;

Б) полисахариды безвкусны;

+В) полисахариды растворяются в воде;

Г) примером полисахаридов является целлюлоза.

13) Выберите неверное утверждение о липидах:

А) липиды выполняют защитную и энергетическую функции;

Б) липиды участвуют в регуляции обмена веществ;

В) липиды не растворяется в воде;

+Г) липиды не растворяется в органических растворителях.

14) Выберите верное определение понятия нуклеотид:

А) это белковый компонент клеточной ДНК;

Б) это дисахарид углеводов;

+В) это мономер нуклеиновых кислот;

Г) все ответы верны.

15) Выберите верные компоненты нуклеотида:

А) азотистое основание, кислород, остаток фосфорной кислоты;

Б) остаток фосфорной кислоты, углеводород, тиамин;

В) азотистое основание, урацил, дезоксирибонуклеиновая кислота;

+Г) азотистое основание, углевод, остаток фосфорной кислоты.

16) Закончите предложение: в состав ДНК входит углевод

+А) дезоксирибоза;

Б) рибоза;

В) пентоза;

Г) гексоза.

17) Закончите предложение: мономерами белков являются

А) глицерин;

+Б) аминокислоты;

В) жирные кислоты;

Г) белковые биополимеры.

18) Укажите функцию белковых молекул:

А) структурная;

Б) транспортная;

В) ферментативная;

Г) регуляторная;

+Д) все ответы верны.

19) Что изображено на рисунке?

+А) молекула мономера;

Б) молекула полимера;

В) молекула воды;

Г) атом углерода.

тест-20) Что указывает на общность живой и неживой природы? Укажите верный ответ:

А) общее космическое происхождение;

Б) присутствие в живой и неживой природе элемента кальция;

В) абсолютное сходство количественного состава неживой и живой природы;

+Г) абсолютно все химические элементы, присутствующие в неживой природе, содержатся в живых организмах.

21) 98% от массы любой клетки приходится на четыре элемента, выберите ответ с верным перечнем этих элементов:

А) кислород, азот, кальций водород;

+Б) кислород, углерод, водород, азот;

В) водород, кислород, селен, гелий;

22) Укажите макроэлементы клеток:

+А) натрий, калий, кальций;

Б) медь, цинк, йод;

В) селен, ртуть, золото;

Г) бром, молибден, кобальт.

23) Укажите неверное утверждение:

А) гликоген — сложное органическое вещество;

+Б) натрий — это ультрамикроэлемент;

В) РНК — это нуклеиновая кислота;

Г) вода – это неорганическое вещество.

24) Вставьте пропущенное слово в предложение: многочисленные превращения молекул и образование различных крупных молекул органических соединений происходит, благодаря четырехвалентной связи атома…

А) водорода;

Б) кислорода;

+В) углерода;

Г) азота.

25) Что изображено на рисунке?

А) споры;

Б) вирусы;

В) растительные клетки;

+Г) кристаллы солей в клетке.

Тест по биологии для 9 класса «Строение органических веществ, входящие в состав клетки»

Тест по биологии для 9 класса

«Строение органических веществ, входящие в состав клетки»

По линии учебников Н.И.Сонина, В.Б.Захарова, С.Г. Мамонтова

Подготовила: учитель биологии

филиала МБОУ Мурзицкой СОШ – Кочетовская ООШ

с. Кочетовка Мокеева Светлана Николаевна

Тестовые задания с выбором одного правильного ответа

1. К органическим веществам клетки относят…

А) Белки, липиды, углеводы, нуклеиновые кислоты

Б) Минеральные соли, липиды, углеводы, нуклеиновые кислоты

В) Белки, липиды, углеводы, диполи воды

Г) Белки, липиды, углеводороды, нуклеиновые кислоты

2. Среди органических веществ в живых клетках больше всего …

А) Углеводов

Б) Липидов

В) Белков

Г) Нуклеиновых кислот

3. Хранят, переносят и передают наследственную информацию дочерним клеткам…

А) Углеводы

Б) Липиды

В) Белки

Г) Нуклеиновые кислоты

4. Общую формулу С n 2О) m имеют

А) Углеводы

Б) Липиды

В) Белки

Г) Нуклеиновые кислоты

5. Воск растений и животных, является производным …

А) Углеводов

Б) Липидов

В) Белков

Г) Нуклеиновых кислот

6. Мономером белков служат…

А) Глюкоза

Б) Нуклеотиды

В) Аминокислоты

Г) Жирные кислоты

7. Структуру нуклеиновых кислот в 1953 году установили …

А) И.И.Мечников и Дж. Уотсон

Б) Дж. Уотсон и Ф. Крик

В) Дж. Уотсон и К. Бэр

Г) И.И.Мечников и Ф. Крик

8. Примером моносахаридов служит…

А) Глюкоза

Б) Целлюлоза

В) Крахмал

Г) Сахароза

9. Липиды – это …

А) Растворимые в воде органические вещества

Б) Активные в воде неорганические вещества

В) Нерастворимые в воде органические вещества

Г) Растворимые в воде неорганические вещества

10. В живых организмах встречается только … разных аминокислот

А) 10

Б) 20

В) 30

Г) 40

11. Мономером нуклеиновых кислот служат…

А) Глюкоза

Б) Нуклеотиды

В) Аминокислоты

Г) Жирные кислоты

12. Мальтозу, лактозу, сахарозу относят к …

А) Полисахаридам

Б) Моносахаридам

В) Дисахаридам

Г) Сложным углеводам

13. Жиры и масла входят в группу …

А) Простых углеводов

Б) Нуклеотидов

В) Сложных углеводов

Г) Нейтральных жиров

14. Крахмал, гликоген, целлюлозу относят к …

А) Полисахаридам

Б) Моносахаридам

В) Дисахаридам

Г) Простым углеводам

15. Рибонуклеиновая кислота (РНК) бывает следующих видов …

А) Информационная, транспортная, фосфолипидная

Б) Информационная, фосфолипидная, рибосомальная

В) Транспортная, фосфолипидная, рибосомальная

Г) Информационная, транспортная, рибосомальная

Правильные ответы:

1-А

2-В

3-Г

4-А

5-Б

6-В

7-Б

8-А

9-В

10-Б

11-Б

12-В

13-Г

14-А

15-Г

ПРЕЗЕНТАЦИЯ ДЛЯ 9 КЛАССА ПО ТЕМЕ: НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ. Учитель биологии ГБОУ СОШ 8. О.Ю. Ветренко

«Нуклеиновые кислоты»

Государственное бюджетное общеобразовательное учреждение Самарской области средняя общеобразовательная школа 8 пгт Алексеевка городского округа Кинель Самарской области Методическая разработка урока биологии

Подробнее

Конкурсный открытый урок

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РБ ГАОУ СПО Нефтекамский нефтяной колледж Посвящается году охраны окружающей среды Конкурсный открытый урок На тему: Нуклеиновые кислоты Тема урока: Нуклеиновые кислоты Цели урока:

Подробнее

БЛОК 2 Клетка как биологическая система.

1. К макроэлементам относятся: БЛОК 2 Клетка как биологическая система. 1) кислород, углерод, водород, азот 2) кислород, железо, золото 3) углерод, водород, бор 4) селен, азот, кислород 1) 2. Органоид,

Подробнее

Отложенные задания (30)

Отложенные задания (30) Вставьте в текст «ДНК» пропущенные термины из предложенного перечня, используя для этого цифровые обозначения. Запишите в текст цифры выбранных ответов, а затем получившуюся последовательность

Подробнее

Основные генетические механизмы

Основные генетические механизмы Тренинг «Использование методики Xpert MTB/RIF», г.душанбе, 29 июля 2 августа 2013 г. Презентация подготовлена в рамках проекта USAID «Посилення контролю за туберкульозом

Подробнее

Белки, их строение и функции

2.3.3. Белки, их строение и функции Белки это биологические гетерополимеры, мономерами которых являются аминокислоты. Белки синтезируются в живых организмах и выполняют в них определенные функции. В состав

Подробнее

ОРГАНИЗАЦИЯ НАСЛЕДСТВЕННОГО МАТЕРИАЛА

Занятие 6. Тема: ОРНИЗИЯ НСЛЕДСТВЕННОО МТЕРИЛ (занятие I) » » 200 г ель занятия: изучить молекулярную природу гена, его свойства; научиться решать задачи, раскрывающие строение молекул ДНК и РНК, по репликации,

Подробнее

Тема: «Нуклеиновые кислоты. ДНК»

Глава I. Основы цитологии На дом: 12 Тема: «Нуклеиновые кислоты. ДНК» Задачи: Дать характеристику нуклеиновым кислотам: видам НК, локализации их в клетке, строению, функциям. Изменено, дополнено Нуклеиновые

Подробнее

ОБЩАЯ И МЕДИЦИНСКАЯ ГЕНЕТИКА

УЧЕБНОЕ ПОСОБИЕ ОБЩАЯ И МЕДИЦИНСКАЯ ГЕНЕТИКА ЗАДАЧИ Под редакцией профессора М.М. Азовой Министерство образования и науки Р Рекомендовано Координационным советом по области образования «Здравоохранение

Подробнее

Решение задач. по молекулярной биологии.

Учитель биологии Зозуля Е.В.. Ноябрь 2014. Решение задач по молекулярной биологии. Молекулярная биология изучает механизмы хранения и передачи наследственной информации. Задачи по молекулярной биологии

Подробнее

ID_2853 1/6 neznaika.pro

1 Клетка, её жизненный цикл (установление соответствия) Ответами к заданиям являются слово, словосочетание, число или последовательность слов, чисел. Запишите ответ без пробелов, запятых и других дополнительных

Подробнее

Тема: Учение о клетке

Государственное бюджетное образовательное учреждение среднего профессионального образования «Кущевский медицинский колледж» министерства здравоохранения Краснодарского края Задания в тестовой форме по

Подробнее

РЕШЕНИЕ ЗАДАЧ ПО МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ

РЕШЕНИЕ ЗАДАЧ ПО МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ Шарлаева Елена Анатольевна, к.б.н., доцент каф. экологии, биохимии и биотехнологии АлтГУ, зам. председ. предм. комиссии ЕГЭ по биологии Для решения задач необходимо

Подробнее

Репликация ДНК Биосинтез белка

Репликация ДНК Биосинтез белка Репликация удвоение молекулы ДНК Происходит в S (синтетический)период митотического цикла Образующиеся дочерние молекулы — точные копии материнской Принципы репликации Комплементарность

Подробнее

Молекулярная биология

Молекулярная биология Курс лекций для студентов IV курса факультета биологии РГПУ им. А.И. Герцена Профессор кафедры Зоологии, д.б.н., профессор Цымбаленко Надежда Васильевна СТРУКТУРА БЕЛКА ЛЕКЦИЯ 9 Структура

Подробнее

Задание 4, (25 баллов)

Задание 4, вариант 1. Гены эукариотических клеток имеют «мозаичное» строение и состоят из кодирующих элементов (экзонов) и некодирующих участков (интронов). По завершении транскрипции образуется «незрелый»

Подробнее

Терминологический диктант

Терминологический диктант Органы цветковых растений. 1 Часть тела организма выполняет определенную функцию… 2 В почве растение удерживает.. 3 Многочисленные разветвленные корни образуют. 4 В корневой

Подробнее

Задания B6 по биологии

Задания B6 по биологии 1. Установите соответствие между особенностями строения и свойств вещества и веществом, имеющим эти особенности. ОСОБЕННОСТИ СТРОЕНИЯ И СВОЙСТВ ВЕЩЕСТВА А) неполярны, нерастворимы

Подробнее

O, H, C, N + S, P — макроэлементы. Na, K, Mg, Ca, Cl — микроэлементы Fe, Zn, Cu, Co, Mn, I, Se следовые элементы

O, H, C, N + S, P — макроэлементы Na, K, Mg, Ca, Cl — микроэлементы Fe, Zn, Cu, Co, Mn, I, Se следовые элементы Представленность макроэлементов в различных группах веществ Макромолекулы Сахара (углеводы)

Подробнее

Дальтон единица измерения массы вещества, равная 1,661 x г, используемая для измерения массы вирусов, клеток, хромосом, митохондрий, рибосом, а

Д Дальтон единица измерения массы вещества, равная 1,661 x 10 24 г, используемая для измерения массы вирусов, клеток, хромосом, митохондрий, рибосом, а также молекул ДНК, РНК и белков. Дарвинизм теория,

Подробнее

9 класс Биология П1 ПРОФИЛЬ.

9 класс Биология П1 ПРОФИЛЬ. Мономером ДНК является: Задание 1 нуклеозид нуклеотид глюкоза аминокислота Задание 2 Вторичная структура каждой т-рнк имеет не сколько петель благодаря тому, что соседние с

Подробнее

10класс Биология погружение 3

10класс Биология погружение 3 Тема: Энергетический обмен. 1. Наибольшее количество энергии освобождается при расщеплении молекул 1) белков 2) жиров 3) углеводов 4) нуклеиновых кислот 2. В бескислородной

Подробнее

вопросов и ответов о CRISPR

В: Что такое CRISPR?

A: «CRISPR» (произносится «четче») означает кластерные регулярные короткие палиндромные повторы, которые являются отличительной чертой системы защиты бактерий, составляющей основу технологии редактирования генома CRISPR-Cas9. В области геномной инженерии термин «CRISPR» или «CRISPR-Cas9» часто используется в широком смысле для обозначения различных систем CRISPR-Cas9 и -CPF1 (и других), которые могут быть запрограммированы для нацеливания на определенные участки генетического кода. и для редактирования ДНК в точных местах, а также для других целей, например, для новых диагностических инструментов.С помощью этих систем исследователи могут постоянно изменять гены в живых клетках и организмах, а в будущем, возможно, сделать возможным исправление мутаций в определенных местах генома человека для лечения генетических причин заболевания. В настоящее время доступны другие системы, такие как CRISPR-Cas13, в которых РНК-мишень предоставляют альтернативные возможности для использования и обладают уникальными характеристиками, которые использовались для чувствительных диагностических инструментов, таких как SHERLOCK.

Вопрос: Откуда берутся CRISPR?

Ответ: CRISPR были впервые обнаружены у архей (а затем и у бактерий) Франсиско Мохика, ученым из Университета Аликанте в Испании.Он предположил, что CRISPR служат частью бактериальной иммунной системы, защищающей от вторгшихся вирусов. Они состоят из повторяющихся последовательностей генетического кода, прерванных последовательностями-спейсерами — остатками генетического кода прошлых захватчиков. Система служит генетической памятью, которая помогает клетке обнаруживать и уничтожать захватчиков (называемых «бактериофагами»), когда они возвращаются. Теория Мойки была экспериментально продемонстрирована в 2007 году группой ученых во главе с Филиппом Хорватом.

В январе 2013 года лаборатория Чжана опубликовала первый метод разработки CRISPR для редактирования генома в клетках мыши и человека.

Чтобы узнать больше о многих ученых и группах, которые внесли свой вклад в понимание и развитие системы CRISPR от первоначального открытия до первых демонстраций редактирования генома с помощью CRISPR, посетите нашу хронологию CRISPR.

Q: Как работает система?

A: «Спейсерные» последовательности CRISPR транскрибируются в короткие последовательности РНК («РНК CRISPR» или «crRNA»), способные направлять систему к сопоставлению последовательностей ДНК.Когда целевая ДНК обнаружена, Cas9 — один из ферментов, продуцируемых системой CRISPR — связывается с ДНК и разрезает ее, отключая целевой ген. Используя модифицированные версии Cas9, исследователи могут активировать экспрессию генов вместо того, чтобы разрезать ДНК. Эти методы позволяют исследователям изучать функцию гена.

Исследования также предполагают, что CRISPR-Cas9 можно использовать для нацеливания и модификации «опечаток» в последовательности из трех миллиардов букв генома человека с целью лечения генетических заболеваний.


Художественное изображение системы CRISPR в действии.
Иллюстрация Стивена Диксона

В: Чем CRISPR-Cas9 отличается от других инструментов редактирования генома?

О: CRISPR-Cas9 оказался эффективной и настраиваемой альтернативой другим существующим инструментам редактирования генома. Поскольку сама система CRISPR-Cas9 способна разрезать нити ДНК, CRISPR не нужно сочетать с отдельными расщепляющими ферментами, как это делают другие инструменты. Их также можно легко сопоставить с индивидуальными последовательностями «направляющей» РНК (гРНК), предназначенными для того, чтобы вести их к их ДНК-мишеням.Десятки тысяч таких последовательностей гРНК уже созданы и доступны исследовательскому сообществу. CRISPR-Cas9 также можно использовать для одновременного нацеливания на несколько генов, что является еще одним преимуществом, которое отличает его от других инструментов редактирования генов.

Вопрос: Чем CRISPR-Cpf1 отличается от CRISPR-Cas9?

CRISPR-Cpf1 по ряду важных отличий от ранее описанного Cas9 имеет важное значение для исследований и терапии.

Во-первых, в своей естественной форме ДНК-режущий фермент Cas9 образует комплекс с двумя небольшими РНК, обе из которых необходимы для режущей активности. Система Cpf1 проще в том, что для нее требуется только одна РНК. Фермент Cpf1 также меньше стандартного SpCas9, что облегчает его доставку в клетки и ткани.

Во-вторых, что, возможно, наиболее важно, Cpf1 разрезает ДНК иначе, чем Cas9. Когда комплекс Cas9 разрезает ДНК, он разрезает обе нити в одном и том же месте, оставляя «тупые концы», которые часто претерпевают мутации при повторном соединении.В комплексе Cpf1 разрезы в двух нитях смещены, оставляя короткие выступы на открытых концах. Ожидается, что это поможет с точной вставкой, что позволит исследователям более эффективно и точно интегрировать фрагмент ДНК.

В-третьих, Cpf1 разрезает далеко от сайта узнавания, что означает, что даже если целевой ген становится мутированным в сайте разреза, он, вероятно, все еще может быть повторно разрезан, что дает множество возможностей для правильного редактирования.

В-четвертых, система Cpf1 обеспечивает новую гибкость в выборе целевых сайтов.Подобно Cas9, комплекс Cpf1 должен сначала присоединиться к короткой последовательности, известной как PAM, и должны быть выбраны мишени, которые соседствуют с встречающимися в природе последовательностями PAM. Комплекс Cpf1 распознает последовательности PAM, сильно отличающиеся от таковых Cas9. Это может быть преимуществом при нацеливании, например, на геном малярийного паразита и даже геном человека.

Q: Какие еще научные применения CRISPR могут быть помимо редактирования генома?

О: Редактирование генома CRISPR позволяет ученым быстро создавать модели клеток и животных, которые исследователи могут использовать для ускорения исследований таких заболеваний, как рак и психические заболевания.Кроме того, CRISPR сейчас разрабатывается как средство быстрой диагностики. Чтобы способствовать развитию этого типа исследований во всем мире, Фэн Чжан и его команда обучили тысячи исследователей использованию технологии редактирования генома CRISPR посредством прямого обучения и обмена более чем 40 000 компонентов CRISPR с академическими лабораториями по всему миру.

Решения для анализа и исследований SARS-CoV-2 / COVID-19

Наши лучшие в своем классе решения для COVID-19

Bio-Rad предлагает широкий спектр продуктов для поддержки диагностического скрининга COVID-19, подтверждения результатов тестов, надзора, а также исследований и разработок терапии / вакцин.От молекулярного тестирования с использованием ПЦР в реальном времени или цифровой капельной ПЦР до иммунологических анализов — наш широкий спектр решений обеспечивает лучшую в своем классе чувствительность и точность.

На этих страницах перечислены наши продукты в этих областях. Доступность некоторых продуктов в регионах ограничена. Если у вас есть конкретный вопрос о решениях для коронавируса, пожалуйста, свяжитесь с вашим местным офисом продаж или представителем . Поскольку мы во всем мире соблюдаем правила предоставления убежища на месте, компания Bio-Rad продолжает обрабатывать заказы и предлагать обслуживание клиентов и техническую поддержку.


Диагностика и подтверждение

Вакцины и терапевтические исследования и разработки

Последние новости

Контактное лицо для СМИ: Тина Куччиа | Менеджер по корпоративным коммуникациям | Телефон: 510-741-6063 | [email protected]

Ресурсы по COVID-19

Пандемия коронавируса 2019-20 (COVID-19; 2019-nCoV)

Новый коронавирус, идентифицированный как возбудитель случаев пневмонии, впервые обнаруженный в городе Ухань, Китай, в декабре 2019 года. был официально обозначен как SARS-CoV-2.11 марта 2020 года ВОЗ объявила COVID-19 глобальной пандемией. Для получения последней информации о пандемии нового коронавируса COVID-19/2019-nCoV посетите веб-сайт Всемирной организации здравоохранения:

WHO.int> Чрезвычайные ситуации> Заболевания> Коронавирусная болезнь 2019

Центры США по контролю и профилактике заболеваний предоставляют ценную информацию для жителей США и других стран. Обзор ситуации с новым коронавирусом 2019 г., руководство для путешественников, информацию для специалисты в области здравоохранения и общественного здравоохранения, руководство для лабораторных специалистов, справочная информация и последние новости:

CDC.gov> Новый коронавирус

2019 г.

Хотя в настоящее время нет клинических диагностических средств для коронавируса 2019-nCoV, одобренных Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) США, 4 февраля 2020 года FDA выдало разрешение на экстренное использование, чтобы временно расширить использование анализов RT-PCR для выявление 2019-nCoV. Последние новости можно найти на веб-сайте Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США:

.

FDA.gov> Инициатива по медицинским контрмерам (MCMi)> Новый коронавирус (2019-nCoV)
FDA.gov> Инициатива по медицинскому противодействию (MCMi)> Разрешение на использование в чрезвычайных ситуациях

Прокрутка

Обнаружение SARS-CoV-2 с использованием изотермической амплификации и быстрого и недорогого протокола инактивации и очистки образцов

Значимость

В этой работе описывается оптимизация конвейера подготовки и обнаружения образцов для быстрого диагностического теста SARS-CoV-2 и не требует специального оборудования. Этот конвейер включает инактивацию вирусов, делающую образцы более безопасными для работы, с последующей чувствительной 30-минутной изотермической реакцией обнаружения с отображением от красного к желтому на основе цвета.Чувствительность можно дополнительно улучшить, используя простой и недорогой протокол очистки. Этот конвейер может помочь решить проблему нехватки возможностей тестирования и может работать в различных условиях.

Abstract

Текущая пандемия тяжелого острого респираторного синдрома, вызванная коронавирусом 2 (SARS-CoV-2), оказала огромное влияние на общество во всем мире, угрожая жизни и средствам к существованию многих людей. Последствия будут продолжать расти и ухудшаться, если экономика начнет открываться без надлежащих мер предосторожности, включая расширенные диагностические возможности.Чтобы удовлетворить эту потребность в расширении тестирования, мы разработали чувствительный анализ изотермической амплификации, опосредованной петлей обратной транскрипции (RT-LAMP), совместимый с текущими реагентами, который использует колориметрическое считывание всего за 30 минут. Протокол быстрой инактивации, способный инактивировать вирионы, а также эндогенные нуклеазы, был оптимизирован для повышения чувствительности и стабильности образца. Этот протокол в сочетании с анализом RT-LAMP имеет чувствительность не менее 50 копий вирусной РНК на микролитр в образце.Для дальнейшего повышения чувствительности был разработан протокол очистки, совместимый с этим методом инактивации. Протокол инактивации и очистки в сочетании с анализом RT-LAMP обеспечивает чувствительность по крайней мере до 1 копии вирусной РНК на микролитр в образце. Этот простой конвейер инактивации и очистки является недорогим, совместим с другими платформами для обнаружения РНК, расположенными ниже по цепочке, и использует легко доступные реагенты. Это должно повысить доступность тестирования SARS-CoV-2, а также расширить настройки, в которых это тестирование может быть выполнено.

Нынешняя пандемия коронавируса 2 (SARS-CoV-2) тяжелого острого респираторного синдрома оказала и будет продолжать оказывать огромное влияние на общество во всем мире, угрожая жизни и средствам к существованию многих людей. По мере распространения болезни потребность в инструментах быстрой диагностики по месту оказания медицинской помощи стала огромной. В настоящее время прилагается много усилий для разработки анализов, которые можно использовать в различных условиях (1). Идеальный анализ не требует специального оборудования и дает быстрый, легко читаемый результат.С этой целью мы разработали анализ, основанный на методе изотермической амплификации, опосредованной обратной транскрипцией (RT-LAMP). Чтобы повысить чувствительность, мы также разработали метод подготовки образцов, который можно использовать в качестве первого шага для многих различных типов последующих анализов. Протокол простой, недорогой и быстрый, и в нем используются реагенты, которые легко приготовить в больших количествах.

LAMP — это метод изотермической репликации ДНК, который использует в ускоренном формате шесть олигонуклеотидов ДНК, которые гибридизуются с восемью различными участками молекулы-мишени (2, 3).При использовании замещающей цепи полимеразы и петель, образующихся во время этой реакции, происходит быстрая реакция амплификации при правильном связывании олигонуклеотидов с желаемой мишенью. Такие реакции генерируют микрограммы ДНК за очень короткий период времени при одной температуре реакции. Кроме того, хотя замещающая цепь полимераза обладает активностью обратной транскриптазы, обратная транскриптаза может быть включена для повышения чувствительности реакции при обнаружении РНК-мишени (RT-LAMP), такой как РНК SARS-CoV-2.Анализы LAMP имеют различные показания из-за большого количества генерируемой ДНК, включая флуоресценцию с использованием интеркалирующего красителя ДНК, мутность или падение pH, если реакция минимально забуферена (1, 4, 5). Это изменение pH, достаточное для того, чтобы индикаторный краситель pH заметно изменил цвет, является оптимальным методом диагностики на основе LAMP в месте оказания медицинской помощи.

Мы разработали и протестировали 11 наборов праймеров для анализа RT-LAMP и использовали реактивы LAMP от New England Biolabs (NEB) для колориметрического считывания.Они были протестированы относительно других праймеров, недавно опубликованных NEB. Оптимальный набор праймеров, направленных на неконсервативную область гена SARS-CoV-2 Orf1a, был идентифицирован как особо чувствительный, но не подверженный фоновым сигналам. Помимо разработки надежного набора праймеров RT-LAMP, мы также стремились оптимизировать подготовку образцов таким образом, чтобы максимизировать чувствительность и сделать образцы стабильными и безопасными для персонала, проводящего тестирование. Мы исследовали толерантность реакции RT-LAMP к детергентам и хаотропным солям, которые могут способствовать лизису вирионов и очистке геномов вирусной РНК и информационной РНК.Кроме того, мы оптимизировали очень простой и быстрый протокол, основанный на методе HUDSON (6), для инактивации вирионов, а также эндогенных РНКаз, скорректировав состав, чтобы обеспечить его совместимость с показаниями на основе pH. Эта последняя модификация имела преимущество снижения температуры, при которой инактивируются РНКазы. Эти методы позволяют добавить в реакцию не менее 5 мкл образца (мазки из носоглотки [NP] в физиологическом растворе / фосфатно-солевом буфере [PBS] или чистая слюна), чтобы довести чувствительность до 10-50 копий РНК на микролитр образца.Мы также разработали простой и быстрый процесс, с помощью которого вирусную РНК можно очистить и сконцентрировать из 0,5 мл среды для сбора, так что при использовании с нашим набором праймеров Orf1a предел обнаружения падает как минимум до 2 копий РНК на микролитр. В отличие от схем очистки, используемых для текущего одобренного Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) теста на основе qRT-PCR, эта очистка не требует коммерческого набора. Он связывает нуклеиновые кислоты с диоксидом кремния в форме суспензии, известной как «стеклянное молоко» (7), которая легко доступна в промышленных количествах по невысокой цене.Общая стоимость инактивации и очистки составляет приблизительно 0,07 доллара США за образец. Ранняя клиническая проверка этих протоколов на образцах пациентов, состоящих из мазков в физиологическом растворе, показала, что инактивация сама по себе увеличивает чувствительность до> 95% образцов со значениями Ct <30 qRT-PCR и общей чувствительностью 85% (8). Стеклянная очистка молока увеличивает эту чувствительность как минимум в 10 раз. Кроме того, было обнаружено, что специфичность составляет 100%, без ложноположительных результатов (8).

Результаты

Чувствительность анализов HMS и NEB RT-LAMP.

Мы разработали и протестировали 11 наборов праймеров LAMP для геномов SARS-CoV-2 с использованием V5 (https://primerexplorer.jp/e/), за исключением праймеров петель для Orf1a. PrimerExplorer не смог найти набор для этой области генома, поэтому петлевые праймеры для Orf1a-Гарвардской медицинской школы (Orf1a-HMS; SI, приложение , таблица S1) были сконструированы вручную. Orf1a-HMS находится в области SARS-CoV-2, которая не сохраняется ни с SARS, ни с изолятом SARS-подобного летучих мышей коронавируса Rs4084, двумя близкородственными коронавирусами (рис.1 А ). Несмотря на отсутствие консервативности среди коронавирусов, данные секвенирования клинических изолятов SARS-CoV-2 со всего мира, полученные через Nextstrain (9), не показывают, что эта область-мишень мутирует быстрее, чем остальная часть генома (рис. 1 B и C ). Первоначальные тесты показали, что праймеры Orf1a-HMS превосходят другие наши наборы праймеров. Затем мы создали Orf1a-Harvard Medical School Enhanced (Orf1a-HMSe, SI, приложение , таблица S1) путем модификации прямого внутреннего праймера (FIP) и обратного внутреннего праймера (BIP), чтобы включить линкер «TTTT» между F1c и F2. области, так как сообщалось, что это еще больше улучшает реакцию (10).Orf1a-HMS и Orf1a-HMSe были протестированы с использованием набора NEB WarmStart LAMP Kit (NEB E1700) со считыванием данных на основе флуоресценции в реальном времени (рис. 2). В этой схеме реакции каждый цикл составляет 30 с при 65 ° C. В идеале положительный результат будет считываться через 30 минут или 60-й цикл, временную точку, используемую Zhang et al. (1). Мы использовали РНК положительного контроля от Twist Bioscience (Sku 102019) в реакциях объемом 10 мкл в трех экземплярах, включая 0, 100, 200 или 300 копий вирусной РНК на реакцию. Как видно, оба набора праймеров способны обнаруживать вирусную РНК с низким числом копий.Для дальнейшей оценки чувствительности мы провели повторные реакции с использованием того же считывания на основе флуоресценции с Orf1a-HMS, Orf1a-HMSe и NEB Orf1a-C ( SI, приложение , рис. S1). Для каждого мы провели 48 реакций по 10 мкл с 200 копиями вирусной РНК каждая и 48 реакций по 10 мкл без добавления вирусной РНК. Как можно видеть, как Orf1a-HMS, так и Orf1a-HMSe работали хорошо, показывая высокую амплификацию в 45 и 47 из 48 реакций с 200 копиями РНК, соответственно. Кроме того, ни в одной из реакций без вирусной РНК не наблюдалось амплификации через 60 мин.NEB Orf1a-C не работал так же хорошо, так как время до амплификации в реакциях с 200 копиями РНК сильно варьировало, и многие из них не амплифицировались до или после 30-минутной точки. Более того, две реакции без вирусной РНК показали амплификацию, но мы не можем исключить возможность того, что эти реакции, какими бы чувствительными они ни были, были загрязнены. Эти данные предполагают, что Orf1a-HMS и Orf1a-HMSe являются более надежными наборами праймеров для этого анализа.

Рис. 1.

Консервация последовательности целевой области Orf1a-HMS между родственными коронавирусами и внутри изолятов SARS-CoV-2.( A ) Выравнивание (blastn, megablast) SARS, изолята Rs4084 коронавируса типа Bat SARS и последовательности, обнаруженной с помощью Orf1a-HMS / Orf1a-HMSe. ( B и C ) Измерение секвенированных нуклеотидных мутаций в подмножестве глобальных данных, предоставленных Nextstrain (энтропия нуклеотидов), адаптированных из визуального интерфейса Nextstrain. Указана целевая область Orf1a-HMS / Orf1a-HMSe (от 2245 до 2441). ( B ) Просмотр всего генома. ( C ) Крупный план целевой области.

Фиг.2.

Тест начальной чувствительности выбранных наборов праймеров RT-LAMP. Флуоресцентные реакции RT-LAMP проходят в течение 120 30-секундных циклов при 65 ° C: 0 (синий), 100 (зеленый), 200 (красный) или 300 (фиолетовый) контрольных копий РНК, включенных в реакцию ( n = 4) . Были выполнены анализы ( A ) Orf1a-HMS и ( B ) Orf1a-HMSe. RFU, относительные единицы флуоресценции.

Допуск моющих средств.

Чтобы потенциально улучшить чувствительность реакции RT-LAMP при использовании образцов пациентов, мы предположили, что увеличение количества детергента в реакции может помочь лизировать вирионы, делая их геномную РНК более доступной для обратной транскрипции и амплификации.Используя Orf1a-HMS и те же флуоресцентные реакции объемом 10 мкл, как описано выше, мы провели реакции с 500 копиями вирусной РНК и различными количествами добавленного Tween20 или TritonX100. Реакция вполне толерантна к добавленным детергентам, и можно наблюдать устойчивую амплификацию, по крайней мере, до 1,5% Tween20 и 1% TritonX100 (рис. 3). Амплификация все еще могла быть обнаружена для обоих детергентов до 3%, но реакции, по-видимому, выходили на плато при более низком уровне флуоресценции, когда уровни детергента увеличивались.

Фиг.3.

Оценка толерантности к моющим средствам RT-LAMP. Флуоресцентные реакции RT-LAMP проходят в течение 120 30-секундных циклов при 65 ° C. Все реакции содержат 500 копий контрольной РНК, набор праймеров Orf1a-HMS и от 0 до 3% добавленных ( A ) Tween20 или ( B ) TritonX100, как указано.

Сравнение чувствительности праймеров NEB и HMS к хаотропным солям с использованием колориметрических данных.

Чтобы оптимизировать протоколы, которые используют хаотропные соли во время очистки, мы проверили толерантность колориметрических реакций RT-LAMP к GuSCN и NaI, двум таким хаотропным солям, обнаружив, что реакция толерантна к любой из них до 50 мМ ( SI Приложение , рис.S2) (7, 11). Хотя наш окончательный рекомендуемый протокол (ниже) не использует GuSCN (отчасти из-за проблем с производственными масштабами, а также из-за опасности смешивания GuSCN с отбеливателем), мы разработали протокол, который его использует, для ситуаций, когда GuSCN является хаотропным. агент в использовании. Мы протестировали влияние 50 мМ GuSCN на чувствительность анализа RT-LAMP с различными наборами праймеров. Это также служило для прямого сравнения чувствительности Orf1a-HMS, Orf1a-HMSe, NEB Gene N-A и NEB Orf1a-C в реакциях RT-LAMP.

NEB Orf1a-C показал худшие результаты с GuSCN или без него (рис. 4 A ), обнаружив 2/40 с 100 копиями вирусной РНК и 5/40 с 200 копиями вирусной РНК. Этот результат был неожиданным, поэтому мы снова провели эксперимент, переработав все реагенты, включая смеси праймеров, и включив четыре реакции Orf1a-HMSe с 200 копиями вирусной РНК в качестве контроля планшета ( SI, приложение , рис. S3). Результаты были такими же: NEB Orf1a-C обнаруживал 1/40 при 100 копиях вирусной РНК и 1/40 или 2/40 при 200 копиях вирусной РНК (одна из реакций на 200 копий РНК стала заметно оранжевой, но не желтой). .NA гена NEB показала лучшие результаты, обнаруживая от 11/40 до 13/40 с использованием 100 копий вирусной РНК (в зависимости от того, считаются ли пограничные оранжевые реакции положительными) и от 22/40 до 29/40 с 200 копиями вирусной РНК (рис.4 ). В ). Orf1a-HMS и Orf1a-HMSe были гораздо более чувствительными. При 100 копиях вирусной РНК Orf1a-HMS и Orf1a-HMSe детектировали 26/40 и 31/40 соответственно (фиг. 4 C и D ). При 200 копиях вирусной РНК Orf1a-HMS и Orf1a-HMSe обнаруживали 36/40 и 39/40 соответственно.Кроме того, все положительные реакции были полностью желтыми, без неоднозначных оранжевых реакций. Ни одна из реакций без вирусной РНК не привела к положительной реакции ни в одном из протестированных анализов (рис. 4). Также не было разницы в чувствительности между реакциями, которые содержали 50 мМ GuSCN, и реакциями, которые не содержали, при использовании праймеров Orf1a-HMSe.

Рис. 4.

Оценка влияния GuSCN на чувствительность колориметрических анализов RT-LAMP. Колориметрические реакции RT-LAMP проводят с отмеченным количеством копий контрольной РНК (0, 100 или 200).Реакции проводили с 50 мМ GuSCN (+) или без GuSCN (-), как указано. ( A ) Набор праймеров NEB Orf1a-C. ( B ) Набор праймеров NEB Gene N-A. ( C ) Набор праймеров Orf1a-HMS. ( D ) Набор праймеров Orf1a-HMSe. Звездочкой * обозначены реакции, которые были заметно оранжевыми, но не полностью желтыми.

Цели для оптимизированного протокола быстрой инактивации / стабилизации и очистки.

Текущие методы сбора образцов, используемые для тестирования SARS-CoV-2, требуют помещения тампонов в 2–3 мл коммерческой среды для сбора, такой как среда для сбора вирусов Quest Diagnostics (VCM) (7).Этот метод представляет собой серьезную проблему для обнаружения на основе RT-LAMP, поскольку очень мало (не более 1 мкл) можно использовать в реакции объемом 25 мкл из-за присутствия красителей и буферов в VCM, которые могут препятствовать визуализации сдвиг pH в положительной реакции (8). Другие среды для сбора, такие как 0,9% физиологический раствор, обладают меньшим ингибирующим действием. Наконец, важно отметить, что обработка образцов сопряжена с риском, поскольку такие образцы могут содержать инфекционный вирус. Таким образом, мы решили разработать серию протоколов, которая включает быструю инактивацию вирионов в различных типах образцов при сохранении инактивированной РНКазы.Кроме того, наша цель состояла в том, чтобы этот протокол повысил чувствительность, при этом он был совместим как с прямым добавлением к реакциям RT-LAMP, так и с очисткой на основе NaI (схематично на рис. 5).

Рис. 5.

Простая и быстрая схема дезактивации и очистки образцов. ( A ) Схема, изображающая инактивацию образца и прямое тестирование RT-LAMP. ( B ) Схема процедуры очистки и тестирования постинактивации мазков. ( C ) Схема процедуры очистки и тестирования для постинактивации образцов слюны.

Протокол инактивации.

Чтобы быстро инактивировать / лизировать вирионы, одновременно защищая их РНК от эндогенных РНКаз, мы использовали простой протокол, основанный на протоколе HUDSON (6), с использованием стабильного при хранении восстанавливающего агента, Трис (2-карбоксиэтил) фосфина ( TCEP), хелатор двухвалентных катионов этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA) и кратковременное нагревание при 95 ° C. (Тем не менее, более низкие температуры могут быть достаточными; SI Приложение , рис. S6.) В этом протоколе 1/100 объема образца смеси 100 × TCEP / EDTA (реагент инактивации) добавляется к образцу, который затем смешивается и нагревали при 95 ° C в течение 5 мин.Этот протокол быстро денатурирует белки, используя TCEP для уменьшения любых дисульфидных мостиков. Любые двухвалентные катионы, необходимые для активности РНКазы, высвобождаются из денатурированных белков и секвестрируются ЭДТА, делая любые ренатурированные РНКазы инертными. Мы обнаружили, что этого достаточно, чтобы инактивировать активность РНКазы; Дополнительным преимуществом является то, что восстановители снижают вязкость слюны и слизи (12). Полученный инактивированный образец полностью совместим с прямым добавлением к реакции RT-LAMP, при этом допускается не менее 5 мкл.Этого протокола должно быть достаточно для инактивации любых вирионов SARS-CoV-2 в образце, что делает образец гораздо более безопасным для последующей обработки и транспортировки (13, 14). Ранее разработанные методы лизиса РНК-вирусов используют стадию лизиса при 95 ° C, а ближневосточный респираторный синдром-CoV очень чувствителен даже к 1 минуте при 65 ° C (6, 14).

Используя этот протокол, в реакцию можно добавить не менее 5 мкл инактивированного образца, включая мазки в физиологическом растворе и 1 × PBS, а также чистую слюну (без какого-либо другого препарата), что обеспечивает надежное обнаружение при 50 копиях РНК. на микролитр в исходной пробе (рис.6). Этот протокол также может быть дополнен только этим реагентом для инактивации и источником кипящей воды, что обеспечивает быструю инактивацию и стабилизацию образца в самых разных условиях. В результате инактивации образец остается со слабощелочным pH с 2,5 мМ TCEP и 1 мМ EDTA, поэтому такие инактивированные образцы, вероятно, будут совместимы с различными тестами на обнаружение нуклеиновых кислот, а не только с анализом RT-LAMP. Мы также обнаружили, что дитиотреитол (DTT) может работать вместо TCEP с незначительным изменением используемого гидроксида натрия (NaOH), поскольку DTT не такой кислый, как TCEP.Однако DTT гораздо менее стабилен, поэтому мы выбрали TCEP в качестве оптимального стабильного при хранении реагента.

Рис. 6. Тест на чувствительность

с набором праймеров Orf1a-HMSe после инактивации образца. Прямое обнаружение в восстановленных мазках из горла и носа в ( A ) физиологическом растворе, ( B ) 1 × PBS или ( C ) восстановленной слюне. Копии контрольной РНК добавляли в образцы во время инактивации (указана концентрация). Образцы отрицательного контроля (-) не содержали добавленной РНК. После инактивации 5 мкл образца добавляли в колориметрическую реакцию RT-LAMP с праймерами Orf1a-HMSe.Положительные контрольные реакции (+) содержали дополнительно 1000 контрольных копий РНК, добавленных непосредственно в реакцию.

Протокол очистки.

Чтобы еще больше повысить чувствительность этого теста, сделав его недорогим, доступным и легко масштабируемым, мы стремились оптимизировать протокол очистки, позволяющий сконцентрировать вирусную РНК из большего объема образца в одну реакцию. Таким образом, мы протестировали очень недорогую и высокодоступную суспензию частиц диоксида кремния, известную как «стеклянное молоко» (7).Эта суспензия получается путем очистки мелких частиц диоксида кремния и их суспендирования в равном объеме воды. Одна лаборатория может подготовить достаточно для десятков миллионов очисток в день по цене менее 45 долларов за 1 миллион очисток. Эта суспензия является предшественником обычно используемых наборов для очистки колонок на основе диоксида кремния, используемых сегодня. Как и в случае с этими колонками, нуклеиновые кислоты будут связываться с диоксидом кремния в присутствии хаотропных солей, таких как GuSCN или NaI (7, 11).

Наш предпочтительный протокол очистки РНК основан на NaI, который часто использовался в качестве хаотропной соли выбора для очистки ДНК от агарозных гелей с использованием стеклянного молока (7).В таких протоколах три объема 6 М NaI добавляли к срезам геля, чтобы расплавить гель и связать ДНК со стеклянным молоком. Мы обнаружили, что конечной концентрации 2 М NaI было достаточно для концентрирования геномов контрольной РНК с помощью стеклянного молока. Это довольно удобно, поскольку использование меньшего объема связующего позволяет обрабатывать больший объем образца.

Очистка мазков в физиологическом растворе / PBS.

Для образцов, которые состоят из тампонов в физиологическом растворе или 1 × PBS, к образцу добавляют 1/2 объема связующего раствора на основе NaI (6 M NaI, 2% TritonX100, 10 мМ HCl) и 5 ​​мкл стеклянного молока. после описанного ранее этапа тепловой инактивации (рис.5 В ). Затем образец перемешивают и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 минут, чтобы позволить РНК связать (образцы переворачивают каждые 1–2 минуты, чтобы диоксид кремния оставался в суспензии). Затем образцы подвергают импульсному центрифугированию в настольной микроцентрифуге, такой как VWR Galaxy Mini (или в более крупной настольной центрифуге при 2000 × g), для осаждения кремнезема, и супернатант сливают. Выполняется однократная промывка 80% этанолом с последним отжимом и использованием микропипетки или пипетки для переноса с тонким наконечником для удаления последних следов 80% этанола.Осадок частиц диоксида кремния со связанной РНК сушат либо при комнатной температуре, либо при 65 ° C. После сушки можно напрямую добавить 25 мкл LAMP-реакционной смеси и ресуспендировать диоксид кремния, после чего РНК элюируется в реакцию. Затем реакция может быть запущена напрямую, или образец может быть перенесен в другой реакционный сосуд с включенными частицами кремнезема. По мере протекания реакции частицы кремнезема опускаются на дно трубки и остаются инертными. При очистке мазков в физиологическом растворе или 1 × PBS это обеспечивает высокую чувствительность, по крайней мере, до одного генома на микролитр в исходном образце (рис.7 A и B ).

Рис. 7.

Тест на чувствительность с набором праймеров Orf1a-HMSe после очистки образца. Прямое обнаружение в восстановленных мазках из горла и носа в ( A ) физиологическом растворе, ( B ) 1 × PBS или ( C ) восстановленной слюне. Копии контрольной РНК добавляли в образцы во время инактивации (указана концентрация). Образцы отрицательного контроля (-) не содержали добавленной РНК. После инактивации образцы очищали с использованием стеклянного молока с помощью центрифуги и непосредственно добавляли колориметрическую реакцию RT-LAMP с праймерами Orf1a-HMSe.Положительные контрольные реакции (+) содержали дополнительно 1000 контрольных копий РНК, добавленных непосредственно в реакцию. Как указано, реакции проводились в течение от 30 до 40 минут при 65 ° C.

Мы обнаружили, что описанный выше протокол может быть легко адаптирован к ситуациям, в которых центрифуга недоступна. После связывания РНК с диоксидом кремния образцы можно просто оставить в покое от 5 до 10 минут, позволяя большей части диоксида кремния осесть на дно пробирки; затем можно слить супернатант.Для этой процедуры мы включили две промывки 80% этанолом, чтобы гарантировать удаление ингибиторов, давая 2 мин диоксиду кремния опускаться на дно пробирки между промывками. Мы использовали пипетку для переноса с тонким наконечником, чтобы удалить последнюю промывку перед сушкой гранулы и проведением реакции, как описано выше. Хотя некоторые частицы диоксида кремния теряются, особенно мельчайшие частицы, которые нелегко выпадают из раствора, мы все же смогли достичь чувствительности по крайней мере до 1 копии РНК на микролитр при очистке от 0.5 мл тампонов в физиологическом растворе 1 × PBS ( SI Приложение , рис. S4).

Очистка от слюны.

Мы также стремились разработать протокол очистки вирусной РНК из слюны, поскольку запасы мазков могут стать ограниченными, а сбор слюны не требует помощи медицинского работника, как это делает текущий протокол мазка NP. Мы начали со слюны, инактивированной описанным выше протоколом инактивации (рис. 5 C ). Перед добавлением NaI или стеклянного молока образцы вращают в настольной микроцентрифуге, такой как VWR Galaxy Mini, или другой центрифуге, при 2000 × g в течение от 10 до 15 секунд.На этом этапе флокулянт в этих образцах осаждается, что позволяет вылить очищенный образец в новую пробирку. После завершения этого этапа «предварительной очистки» очистка очищенного супернатанта может продолжаться точно так же, как описано выше для образцов мазков в среде, что позволяет снизить чувствительность по крайней мере до 1 копии РНК на микролитр при запуске с 0,5 мл слюны (рис. 7 С ).

К сожалению, нам не удалось усовершенствовать протокол очистки от слюны, не основанный на использовании небольшой центрифуги, хотя недавние инновации, такие как портативное устройство «paperfuge», которое легко сделать, могут помочь решить эту проблему (15).Мы пытались дать материалу флокулянта осесть под действием силы тяжести в течение 30 минут (в течение которых большая часть его оседает на дно пробирки, но не все) и безуспешно переносили остаток в новую пробирку. Мы продолжим работать над этим и пригласим других сделать это, чтобы сделать протоколы очистки на основе слюны как можно более доступными.

Очистка от коммерческих коллекционных сред.

Мы также оптимизировали протоколы для очистки от часто используемых носителей для сбора, включая Quest Diagnostics VCM и PrimeStore MTM.Вирусная РНК может быть очищена от VCM после тепловой инактивации с помощью TCEP и EDTA, после чего желатин в собирающей среде вылетает из раствора. Образец можно центрифугировать, а очищенный супернатант можно использовать для очистки с добавлением связывающего раствора NaI с добавлением немного большего количества HCl. Образцы в PrimeStore MTM можно обрабатывать так же, как образцы физиологического раствора / PBS, которые уже были инактивированы. Таким образом, можно напрямую добавить 1/2 объема реагента, связывающего NaI, и можно будет продолжить очистку.Для обоих образцов наблюдалась сопоставимая чувствительность по сравнению с другими типами образцов, описанными выше ( SI, приложение , рис. S5).

Стабильность РНК после инактивации и в процессе очистки.

Чтобы убедиться, что эндогенные РНКазы полностью инактивированы с помощью этих протоколов, мы инактивировали образцы слюны, а также мазки в физиологическом растворе или 1 × PBS, а затем добавили контрольную вирусную РНК (100 копий на микролитр) для проверки деградации. Инактивированные образцы с этими контрольными РНК инкубировали при 37 ° C в течение 30 минут, что давало возможность любой остаточной РНКазной активности разрушить контрольные РНК.Когда 5 мкл этих образцов были использованы в 25-мкл реакций RT-LAMP с праймерами Orf1a-HMSe, все реакции дали положительный результат (фиг. 8 A ). Мы также инкубировали аналогично инактивированную слюну и смеси 1: 1 слюна / физиологический раствор в течение 24 часов при комнатной температуре перед проведением тех же реакций. И снова все реакции из образцов с контрольными копиями РНК дали положительный результат (фиг. 8 A ). Мы также обнаружили, что РНК в высушенном осадке РНК / диоксид кремния достаточно стабильна. После очистки мы инкубировали высушенный осадок РНК / диоксид кремния в течение 48 ч при комнатной температуре перед проведением 25-мкл реакции RT-LAMP с праймерами Orf1a-HMSe.Все реакции из образцов с добавленными копиями контрольной РНК (до двух копий РНК на микролитр) дали положительный результат (фиг. 8 B ). Это указывает на то, что РНКазы полностью инактивированы этим протоколом. Мы также протестировали инактивацию при различных температурах. Инкубация при температуре от 25 ° C до 65 ° C не полностью инактивировала РНКазы ( SI Приложение , рис. S6, A и B ). Однако с использованием нашего реагента для инактивации, который является щелочным, чтобы быть совместимым с колориметрическими показаниями на основе pH, активность РНКазы была отменена при инактивации при 75 ° C.Образцы, инактивированные щелочным инактивирующим реагентом при температуре 75 ° C или выше ( SI Приложение , рис. S6, C и E ). Если к таким инактивированным образцам добавить контрольные РНК и затем инкубировать при 37 ° C в течение 30 минут с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 24 часов, они дали положительный результат ( SI Приложение , рис. S6 C и E ). Однако при использовании реагента для инактивации при нейтральном pH требовалась инактивация при 95 ° C. Это говорит о том, что РНКазы легче инактивировать в щелочном растворе, потенциально сокращая любое окно между вирусным лизисом и инактивацией РНКазы.Активность РНКазы также ингибировалась концентрацией NaI, использованной во время связывания для очистки (2 M) (фиг. 8, C и D ).

Рис. 8.

Доказательства стабильности РНК от инактивации путем очистки. ( A ) Мазки в физиологическом растворе, мазки в 1 × PBS, слюне или смеси слюны и физиологического раствора 1: 1 инактивировали и добавляли контрольную РНК до 100 копий на микролитр. После инактивации образцы инкубировали в течение 30 минут при 37 ° C в течение 30 минут или 24 часов при комнатной температуре, как указано, перед тем, как 5 мкл добавляли к колориметрической реакционной смеси RT-LAMP с праймерами Orf1a-HMSe.( B ) Тампоны объемом 500 мкл в физиологическом растворе очищали с использованием стеклянного молока на центрифуге. Высушенные гранулы РНК / диоксида кремния оставляли при комнатной температуре на 48 ч перед добавлением колориметрической реакционной смеси RT-LAMP с праймерами Orf1a-HMSe. Образец отрицательного контроля (-) не содержал копий РНК, добавленных к образцу. Положительные контрольные реакции (+) имели 1000 копий РНК, добавленных непосредственно в реакцию. ( C и D ) РНКазная активность тампонов, помещенных непосредственно в растворы NaI (указана концентрация).Реакции RNase Alert инкубируют в течение 30 мин при 37 ° C; ( C ) светлое поле, ( D ) канал флуоресценции 488 нм; флуоресценция указывает на активность РНКазы.

Обсуждение

В этом отчете мы представили доказательства того, что чувствительный анализ RT-LAMP для вируса SARS-CoV-2 стал еще более чувствительным благодаря быстрой и очень доступной схеме инактивации и очистки. Схема совместима с современными методами сбора, при которых мазки помещаются в большой объем собирающей среды, а также образцы прямой слюны.Эта схема инактивации и очистки, а также анализ RT-LAMP просты и быстры, недороги и не требуют специального оборудования. Реакционные смеси RT-LAMP можно лиофилизировать, при этом смесь остается стабильной в течение многих лет при 4 ° C или недель при комнатной температуре (16, 17). Это устранит барьер холодовой цепи для развертывания в районах с ограниченными ресурсами, где холодная доставка и замороженное хранение могут оказаться невозможными. Такие лиофилизированные реакционные форматы также позволят добавлять увеличенные объемы образцов в каждую реакцию.

Протокол инактивации быстро инактивирует как вирионы (13, 14), так и эндогенные РНКазы (6). Это работает как для стабилизации вирусной РНК перед обнаружением, так и для того, чтобы сделать образцы более безопасными для последующей обработки. Кроме того, этот протокол инактивации должен быть совместим с большинством других анализов обнаружения нуклеиновых кислот, включая используемый в настоящее время одобренный FDA тест qRT-PCR. Используемый здесь щелочной раствор для инактивации также снижает температуру, необходимую для инактивации, с 95 ° C до 75 ° C ( SI Приложение , рис.S6), что может повысить безопасность работы с образцами.

Используемые для очистки частицы диоксида кремния состоят из неочищенного порошка диоксида кремния и могут быть очень быстро получены в огромных количествах. Кроме того, для каждой очистки требуется очень мало (1 л достаточно для 200 000 очисток). Одна лаборатория может легко сделать достаточно для миллионов тестов, что позволяет учреждениям с базовым оборудованием, таким как центрифуги и автоклавы, производить достаточное количество для удовлетворения высокого спроса.Очистку каждого образца тампона можно выполнить за считанные минуты в одной пробирке без центрифуги, используя только два раствора. Множественные очистки могут выполняться параллельно, что позволяет медицинскому персоналу в медицинских учреждениях эффективно проводить очистку. Очищенные образцы можно хранить при комнатной температуре после процедуры очистки стеклянного молока, что позволяет собирать и хранить образцы перед анализом в различных типах анализов.

Эти протоколы могут использоваться вместе в одном конвейере.Образцы пациентов могут быть сначала инактивированы и протестированы непосредственно в анализе RT-LAMP с праймерами Orf1a-HMSe с чувствительностью не менее 50 копий вирусной РНК на микролитр за 30 мин. Образцы, показывающие отрицательные результаты в этом анализе, затем могут быть непосредственно использованы в протоколе очистки стеклянного молока и повторно протестированы, увеличивая чувствительность к 1 копии вирусной РНК на микролитр. Гибкость, обеспечиваемая использованием непосредственно инактивированных образцов или использованием очищенных образцов, позволяет использовать несколько схем.Кроме того, стеклянная очистка молока с отстаиванием под действием силы тяжести должна быть совместима с роботизированными дозирующими платформами с медленной аспирацией, чтобы гранулы диоксида кремния оставались после промывки. В качестве альтернативы более крупные частицы диоксида кремния доступны в керамической промышленности. Если используются более крупные размеры, потребуется использовать больший объем частиц, чтобы компенсировать уменьшение отношения поверхности к объему. Однако для некоторых приложений может быть оправдан компромисс при расчетах.

Образец может быть обработан изначально с использованием нескольких наборов праймеров (либо в одной реакции, либо в параллельных реакциях, либо в последовательных реакциях) для обеспечения специфичности и чувствительности.Например, если образцы пациентов тестировались отдельно с помощью тестов Orf1a-HMSe и NEB N-A, двойной положительный результат был бы более определенным положительным результатом. Также возможно, что наборы праймеров, нацеленные на области генома к 3′-концу вируса, которые более многочисленны в субгеномных РНК, таких как ген нуклеокапсида, в инфицированных клетках, будут иметь повышенную чувствительность, если эти РНК будут обнаружены в образцах пациентов (18) . Это не отразилось бы на наших контрольных РНК, которые содержали равные уровни всех геномных областей.Более того, если геномная мутация помешала одному анализу дать положительный результат, второй анализ, нацеленный на другую область генома, все равно мог бы обнаружить вирусную РНК. Также важно, чтобы тесты, используемые для образцов пациентов, включали внутренний контроль, такой как бета-актин, используемый при клинической валидации этого анализа (8), чтобы гарантировать сохранение целостности РНК в образце и отрицательный результат не из-за деградация.

При использовании с образцами пациентов Orf1a-HMSe показал себя очень хорошо, а инактивация значительно повысила предел обнаружения (8).Инактивация и использование праймеров Orf1a-HMSe обеспечили чувствительность ~ 85% от используемого в настоящее время анализа qRT-PCR с высокой чувствительностью (> 95%) для образцов со значениями Ct менее 30, что соответствует образцам с ~ 40 вирионов на микролитр. Оказалось, что стеклянная очистка молока увеличивает чувствительность как минимум в 10 раз. Кроме того, было обнаружено, что специфичность составляет 100% без ложных срабатываний. Несмотря на то, что он не такой чувствительный, как используемый в настоящее время метод qRT-PCR, простота и скорость в самых разных условиях могут все же сделать этот анализ полезным для борьбы с инфекциями.Мало что известно о диапазоне концентраций вируса, который делает человека особенно заразным для других. Люди с очень низкой вирусной нагрузкой, безусловно, менее заразны, и поэтому их идентификация может не иметь решающего значения для снижения распространения вируса. Кроме того, вероятно, будет применяться эпиднадзорное тестирование для достаточно широкого и случайного мониторинга популяций (19, 20). Объединение без очистки может быть достаточным для обнаружения высокоинфекционных особей. Однако, поскольку относительно большие объемы могут быть сконцентрированы с помощью процедуры стеклянного молока, образцы могут быть объединены и очищены по протоколу стеклянного молока, вероятно, без ущерба для чувствительности.Это позволило бы проводить надзорные испытания без значительного увеличения стоимости (21).

Мы понимаем, что многие экспресс-тесты разрабатываются ежедневно и получают одобрение FDA. Однако, учитывая невероятный спрос, необходимы различные тесты с различными компонентами из разных промышленных источников, чтобы решить немедленную нехватку тестов перед лицом широкомасштабной пандемии. Каждый протокол выполняет важную функцию, поскольку разные тесты имеют разные требования, разную чувствительность и разные расходы.

Материалы и методы

Дизайн грунтовки Orf1a-HMS / Orf1a-HMSe.

Первичные олигонуклеотиды для праймеров Orf1a-HMS / Orf1a-HMSe, F3, B3, FIP и BIP были разработаны PrimerExplorer V5 (https://primerexplorer.jp/e/). Праймеры петель (LF и LB) были разработаны вручную, проверены соответствующие температуры плавления с использованием прогнозов программного обеспечения SnapGene.

Oligos.

Все олигонуклеотиды были заказаны у IDT и ресуспендированы в воде UltraPure при концентрации 100 мкМ.Олиго объединяли для получения 100 мкл 10-кратной смеси праймеров следующим образом: 16 мкл FIP, 16 мкл BIP, 2 мкл F3, 2 мкл B3, 4 мкл LF и 4 мкл LB, и доводили до 100 мкл. мкл воды UltraPure.

RT-LAMP Реакции.

Все реакции RT-LAMP проводили, как описано в протоколах NEB (E1700 и M1800), и проводили при 65 ° C. Реакции, основанные на флуоресценции, запускали как реакции объемом 10 мкл в термоциклере Bio-Rad CFX96 в течение 60 мин, контролируя каждые 30 с флуоресценцию в канале SYBR. Колориметрические анализы проводили как 25-мкл реакции в течение 30 минут при 65 ° C в термоциклере Eppendorf, за исключением реакций после очистки образцов с помощью 0.От 5 до 1 копий вирусной РНК на микролитр образца, которые обрабатывали в течение 40 минут для улучшения изменения цвета. Колориметрические анализы были получены с помощью смартфона Pixel 2 с настройками по умолчанию.

Контрольная РНК.

Все последовательности вирусной РНК, использованные в этом исследовании, были очищенными контрольными РНК от Twist Bioscience (SKU 102019, 1 × 10 6 копий РНК на микролитр), соответствующим образом разведенных в воде, свободной от нуклеаз. Это были неперекрывающиеся РНК, представляющие фрагменты генома, соответствующие каждому набору зондов.Для проверки концентраций Twist РНК контрольные РНК обрабатывали методом RT и количественно оценивали с помощью цифровой капельной ПЦР (ddPCR) с использованием праймеров HMS Orf1e F3 / B3 и NEB N-A F3 / B3 для их геномных областей. Полученные значения составили 33% и 40%, соответственно, от значений, предоставленных Twist, при условии, что частота RT и обнаружение ddPCR были 100%. Поскольку 100% маловероятно, эти значения RT-ddPCR считались подтверждением заявленных концентраций.

Настройка чистой реакции.

Все реакции были собраны и запечатаны перед запуском в специальной чистой комнате, которая регулярно дезактивировалась отбеливателем и имела ограниченный доступ для персонала.После проведения реакции реакционные пробирки или планшеты больше никогда не открывали, чтобы предотвратить постамплификационное загрязнение будущих реакций.

Решения.

Все растворы были созданы из реагентов молекулярной степени чистоты. Чтобы приготовить 5 мл 100-кратного реагента для инактивации, сначала 358 мг TCEP-HCl (Millipore Sigma 580567) растворяли в воде, чтобы получить 2,5 мл 0,5-М раствора. Затем добавляли 1 мл 0,5 М EDTA, pH = 8 (ThermoFisher Scientific AM9260G). Наконец, добавляли 10 н. NaOH и воду UltraPure (ThermoFisher Scientific 10977015), чтобы довести конечный объем до 5 мл и концентрацию NaOH до 1.От 1 до 1,15 N NaOH (1,1 N для мазков в физиологическом растворе 1 × PBS, 1,15 N для использования со слюной с pH ~ 6,5). Для других сред для сбора необходимо будет оптимизировать концентрацию NaOH, чтобы гарантировать, что pH конечной инактивированной пробы находится в приемлемом диапазоне, чтобы проба при добавлении не вызывала немедленного пожелтения LAMP-реакции или предотвращения LAMP-реакции. от пожелтения при успешном усилении.

Для приготовления раствора для связывания NaI 224,8 г NaI (Millipore Sigma 793558) растворяли в воде UltraPure до конечного объема ~ 230 мл.К этому добавляли 2,5 мл 1 н. HCl (из 37% исходного материала, Millipore Sigma 320331) и 5 ​​мл tritonX100 и перемешивали перед доведением объема до 250 мл водой UltraPure. Со временем этот раствор может немного пожелтеть, предположительно из-за окисления, которое приводит к образованию молекулярного йода. Однако при добавлении к инактивированному образцу, содержащему TCEP, этот йод быстро восстанавливается, делая раствор бесцветным. Похоже, что это не влияет на очистку. Кроме того, это окрашивание можно предотвратить, уменьшив воздействие света на раствор (например,г., обернув емкость с раствором фольгой).

1 × PBS был приобретен как есть (ThermoFisher 10010023), и 0,9% физиологический раствор был получен путем внесения 1,54 мл 5 M NaCl в 50 мл с водой UltraPure.

Приготовление стеклянного молока.

Для приготовления стеклянного молока диоксид кремния 325 меш (Spectrum Chemicals, SI108) был объединен с избыточным объемом 10% HCl (~ 3 н. HCl), полученным из 37% HCl (Millipore Sigma 320331) и воды MilliQ (Millipore). в вытяжном шкафу (нельзя вдыхать сухой кремнезем).После промывки кислотой в течение 4-8 часов при комнатной температуре диоксид кремния осаждали центрифугированием в течение 2 минут при 5000 × г , и супернатант сливали. Гранулы ресуспендировали в четырех объемах гранул воды MilliQ, а затем снова гранулировали. Эту стадию промывки повторяли всего шесть промывок. Затем осадок промывали четырьмя объемами осадка 10 мМ Tris HCl, pH = 8 (ThermoFisher Scientific AM9855G) и 1 мМ EDTA (ThermoFisher Scientific 15575020) и осаждали. Наконец, осадок ресуспендировали в одном объеме гранулы 10 мМ Трис HCl и 1 мМ ЭДТА и автоклавировали.Однако этот этап автоклавирования, вероятно, излишний, поскольку промывка кислотой должна очищать шарики от загрязняющих веществ. Полученная 50% -ная стеклянная суспензия молока может храниться при комнатной температуре. Перед использованием необходимо тщательно ресуспендировать частицы, поскольку они начинают быстро оседать.

Определение активности РНКазы. Активность РНКазы

тестировали с использованием субстрата IDT RNaseAlert (IDT 11-04-02-03). Вкратце, субстрат обнаружения (олигонуклеотид РНК с фтором и гасителем) ресуспендировали в воде UltraPure при концентрации 10 мкМ.Для каждого теста 5 мкл этого субстрата и 5 мкл 10-кратного буфера объединяли с 40 мкл раствора, который тестировался на активность РНКазы. Тестовый раствор для проверки активности РНКазы в NaI был создан путем погружения и энергичного взбалтывания аппликатора с ватным наконечником (Puritan 806-WC), который был тщательно протерт в задней части горла, в 500 мкл указанного раствора NaI. Положительный контроль был создан путем погружения тампона в воду, а отрицательный контроль содержал чистую воду UltraPure без каких-либо добавок.Для тестирования влияния температуры инактивации на инактивацию РНКазы с флуоресцентным считыванием мазки из зева аналогичным образом помещали в физиологический раствор с 1-кратным реагентом для инактивации, причем отрицательный контроль состоял из этого раствора без добавления тампона. Затем эти реакции инкубировали в течение 30 или 60 минут для NaI и тестов на инактивацию, соответственно, при 37 ° C и отображали в светлом поле и 488 нм с помощью стереоскопа Leica.

Мок-образцы.

Образцы мазков были созданы как в физиологическом растворе, так и в 1 × PBS.Чтобы смоделировать типичный сбор мазков, один НЧ и один ротоглоточный мазок погружали и перемешивали в 3 мл любого раствора. Для сбора слюны сначала полоскали рот водой. Через 30 минут без еды и питья была собрана слюна.

Инактивация образцов и прямое тестирование RT-LAMP.

Во всех экспериментах с инактивированными образцами использовались либо имитирующие образцы мазков, либо контроли слюны и РНК. К каждому образцу добавляли 1/100 объема 100 × инактивирующего реагента. Затем образцы были смешаны и помещены в термоблок, установленный на 95 ° C.Через ~ 2 мин, когда образцы достигли 95 ° C, были добавлены РНК положительного контроля, и продолжалась оставшаяся 5-минутная инактивация. Затем образцы охлаждали на льду. Для тестирования остаточной активности РНКазы образцы после охлаждения помещали на 30 мин при 37 ° C, а затем снова помещали на лед. Для тестирования RT-LAMP 5 мкл образца добавляли к 20 мкл 1,25-кратной колориметрической смеси RT-LAMP, содержащей набор праймеров Orf1a-HMSe. Для проверки стабильности образцов, инактивированных при различных температурах, инактивацию проводили в течение 5 мин при указанной температуре.Для инактивации реагентом для инактивации при нейтральном pH готовили 100-кратный реагент для инактивации с 0,75 М NaOH. После инактивации, непосредственно перед добавлением образца в реакцию, добавляли 1/100 объема 0,35 М NaOH, чтобы довести pH образца до надлежащего щелочного диапазона, необходимого для колориметрического считывания.

Очистка образцов — с помощью центрифуги.

Во всех экспериментах по очистке использовалось 500 мкл образца (тампоны или слюна), и они проводились в пробирках объемом 1,5 мл (Fisher Scientific 14-222-155), коническая форма которых обеспечивала очень эффективное удерживание гранул диоксида кремния.Образцы инактивировали, как описано выше, и охлаждали. Для очистки слюны эти образцы центрифугировали при 2000 × g в центрифуге VWR Galaxy Mini в течение от 10 с до 15 с, и очищенный супернатант переносили в свежую пробирку для очистки. Этот шаг был пропущен для образцов мазков. Затем добавляли 250 мкл реагента, связывающего NaI, вместе с 5 мкл стеклянного молока (их можно было заранее объединить в формат мастер-микса, по 255 мкл которого было добавлено в каждый). Затем пробирки перемешивали путем переворачивания и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин; их переворачивали каждые 2 мин для ресуспендирования кремнезема.Затем образцы центрифугировали от 2 до 3 с при 2000 × г для осаждения кремнезема, и супернатант сливали. Затем добавляли 700 мкл 80% этанола и пробирки переворачивали два или три раза для промывки (осадок не нужно ресуспендировать). Образцы снова центрифугировали от 2 до 3 с, и супернатант сливали. Образцы центрифугировали в последний раз, чтобы весь остаточный 80% этанол опустился на дно. Для удаления остаточного раствора из осадка использовалась микропипетка или пипетка для переноса с тонким наконечником (например, Thomas Scientific 232-11).Затем гранулы полностью сушили на воздухе (до тех пор, пока они не стали напоминать сухой пергамент), оставляя пробирки открытыми при комнатной температуре или в нагревательном блоке 65 ° C для более быстрого высыхания. Затем добавляли 25 мкл 1 × колориметрической смеси RT-LAMP с праймерами Orf1a-HMSe и осадок ресуспендировали пипетированием или встряхиванием. Реакцию переносили в пробирку для ПЦР объемом 0,2 мл перед проведением при 65 ° C в течение 30 мин (этот формат пробирки упрощает визуализацию).

Очистка образцов — без центрифуги.

Очистка с использованием только силы тяжести для осаждения частиц диоксида кремния была успешной только с использованием тампонов, а не слюны.Пятьсот микролитров образца были инактивированы, и РНК была связана с диоксидом кремния с помощью реагента, связывающего NaI, как описано выше для использования с центрифугой. Затем образцы оставляли в покое в течение 5-10 минут, чтобы дать кремнезему осесть, и супернатант сливали (в супернатанте остаются некоторые мелкие частицы, которые будут мутными, но значительное количество кремнезема осядет на дно. трубки). Затем добавляли 700 мкл 80% этанола и пробирки переворачивали два или три раза для промывки (осадок не нужно ресуспендировать).Образцам давали отстояться от 2 до 3 минут, и супернатант сливали. Добавляли дополнительно 700 мкл 80% этанола, и образцы оставляли на от 2 до 3 минут. Затем супернатант удаляли пипеткой для переноса с тонким наконечником умеренно медленно (от 2 до 3 с), чтобы осталось как можно меньше 80% этанола. Затем гранулы полностью сушили на воздухе (до тех пор, пока они не стали напоминать сухой пергамент), оставляя пробирки открытыми при комнатной температуре или в тепловом блоке 65 ° C для более быстрой сушки. Затем проводили реакции, как описано выше для очистки на центрифуге.

Очистка образцов с помощью коммерческих сред для сбора.

Вирусная РНК была добавлена ​​непосредственно в чистые образцы Quest Diagnostics VCM или PrimeStore MTM. Для образцов VCM (750 мкл) добавляли 1/100 объема 100 × инактивационного реагента, описанного выше, и образцы нагревали при 95 ° C в течение 5 минут и охлаждали. Затем образцы VCM центрифугировали при 10000 × г в центрифуге в течение 15 с для осаждения желатина на дне пробирки, и очищенный супернатант переносили в свежую пробирку (2/3 исходного объема пробы, 500 мкл). .Затем добавляли половину этого очищенного объема надосадочного раствора связывающего раствора NaI с дополнительными 12,5 мМ HCl вместе с 5 мкл стеклянного молока. Затем очистку проводили на центрифуге, как описано выше. Для образцов в PrimeStore MTM инактивация не проводилась. Добавляли половину объема образца связывающего раствора NaI и 5 мкл стеклянного молока, а затем проводили очистку на центрифуге, как описано выше.

Доступность данных.

Все данные исследования включены в статью SI и приложение .

Благодарности

Работа поддержана Медицинским институтом Говарда Хьюза. Мы благодарны Натану Таннеру из NEB за обмен идеями и реактивами. Мы также выражаем благодарность за полезные обсуждения с Майклом Спрингером из отдела системной биологии HMS, особенно в отношении предложений по этапу инактивации. При разработке этих анализов нас также направили в ходе полезных обсуждений с нашими коллегами, Мелисом Анахтаром и Грэмом МакГратом из отделения клинической микробиологии Массачусетской больницы общего профиля.Мы благодарим Дженн Эттер, руководителя исследовательской работы отдела генетики HMS, а также сотрудников службы безопасности, оборудования и доставки HMS за поддержку нашей работы в это непростое время. Мы также благодарим Элизабет Рэйб, Джозефа Рэба и Майкла Берка за их помощь в редактировании этой рукописи.

  • Copyright © 2020 Автор (ы). Опубликовано PNAS.

вопросов по структуре ДНК

вопросов по структуре ДНК Вопросы по структуре ДНК для студентов
Структура ДНК: http: // molvis.sdsc.edu/dna
Учителя: см. План урока.

От вас не ждут, что вы узнаете все ответы. Использовать кнопки в учебнике ДНК, чтобы исследовать. Поиграть с молекулой ДНК, чтобы попытаться выяснить ответ на вопрос! Если вы находите вопросы слишком сложными, возможно, вам будет полезно визит Вступительный рассказ Эндрю Картера о структуре ДНК.

    Набор вопросов A (для детей 14 лет и старше)

  1. Что такое «нить» ДНК?
  2. Сколько нитей образуют двойную спираль ДНК?
  3. Каждая нить состоит из двух зон или областей.Одна зона каждой нити состоит из идентичных повторяющихся звеньев, в то время как другая зона состоит из разных единиц. Что это зоны каждой пряди называются?
  4. Что удерживает одну нить другой в двойной спирали?
  5. Как клетки делают точные копии ДНК?
  6. Когда клетки дублируют свою ДНК?
  7. Какая информация закодирована в ДНК?
  8. Что такое «кодон»?
  9. Что такое «транскрипция» ДНК?
  10. Что такое «трансляция» ДНК?
    Набор вопросов B (для детей от 18 лет и старше)
  11. Какие четыре пары оснований ДНК образуют двойную спираль?
  12. Как А может отличить Т от С?
  13. Какую двойную спираль ДНК, по вашему мнению, сложнее? разделены на две цепи: ДНК, состоящая преимущественно из основания AT пар или пар оснований GC? Почему?
  14. Что такое мутация?
  15. Двойная спираль ДНК выглядит как витая лестница.Какие составляет каждую ступеньку лестницы? Что скрепляет перекладины по бокам?
  16. Есть ли в двойной спирали ДНК в основном пустое пространство между атомами?
  17. Одна пара оснований не может сформировать нормальный Watson-Crick водородные связи. Вы можете это найти? (Примечание: нажав на любой основе в D. Концы, антипараллельность сообщает свою букву и порядковый номер в нижней части браузера в строке состояния после слова «Группа». Используйте эту функцию для получения букв и порядковых номеров аномальная пара оснований, как только вы ее обнаружите.)
  18. Как белки распознают определенные последовательности ДНК? (Подробнее об этом.)
    Набор вопросов C (для детей от 20 лет и старше)
  19. Какие основания являются пуринами? Пиримидины?
  20. Если пурин был заменен на пиримидин на одном положение в одной цепи двойной спирали ДНК, что произойдет?
  21. Почему в двойной спирали ДНК не образуют две буквы А или Т? водородные связи (из трех возможных) с G или C?
  22. Сколько видов 5-членных колец в ДНК?
  23. Сколько видов 6-членных колец в ДНК?
  24. Имеет ли «свободное плечо» дезоксирибоза (углерод, не являющийся член пентозного кольца) указывают в направлении, в котором кодировка читается или против?
  25. На основе показанных кодонов (в фильме Codons в разделе Б.Код ), это показанная нить ДНК. нить шаблона или нить кодирования?

Ответы доступны преподавателям, которые задают вопросы электронное письмо на адрес [email protected] с подтверждением должности преподавателей, например, со ссылкой на школу или факультет перечисления веб-сайта колледжа. Я буду не отправлять ответы , если вы назовите свое полное имя, должность (студент, преподаватель и т. д.), учреждение, город штат Страна. Если вы не учитель, скажите, пожалуйста, имя и адрес электронной почты вашего учителя, а также веб-сайт вашего учителя, если он есть.


Вопросы Фриды Райхсман (MoleculesInMotion.Com) а также Эрик Марц. Отзыв Эрику Марцу.

Структура и функции ДНК

Цели обучения

  • Опишите биохимическую структуру дезоксирибонуклеотидов
  • Определите пары оснований, используемые в синтезе дезоксирибонуклеотидов
  • Объясните, почему двойная спираль ДНК описывается как антипараллельная

В разделе «Микробный метаболизм» мы обсудили три класса макромолекул: белки, липиды и углеводы.В этой главе мы обсудим четвертый класс макромолекул: нуклеиновые кислоты. Как и другие макромолекулы, нуклеиновых кислот состоят из мономеров, называемых нуклеотидами , которые полимеризуются с образованием больших цепей. Каждая цепь нуклеиновой кислоты содержит определенные нуклеотиды, которые появляются в определенном порядке внутри цепи, называемые ее последовательностью оснований . Последовательность оснований дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) отвечает за перенос и сохранение наследственной информации в клетке.В разделе «Механизмы микробной генетики» мы подробно обсудим способы, которыми ДНК использует свою собственную последовательность оснований для управления собственным синтезом, а также синтез РНК и белков, что, в свою очередь, дает продукты с различными структура и функции. В этом разделе мы обсудим основную структуру и функцию ДНК.

Нуклеотиды ДНК

Строительными блоками нуклеиновых кислот являются нуклеотиды. Нуклеотиды, составляющие ДНК, называются дезоксирибонуклеотидами .Три компонента дезоксирибонуклеотида — это пятиуглеродный сахар, называемый дезоксирибоза , фосфатная группа и азотистое основание , азотсодержащая кольцевая структура, которая отвечает за комплементарных пар оснований между цепями нуклеиновых кислот (рис. ). Атомы углерода пятиуглеродной дезоксирибозы пронумерованы 1ʹ, 2ʹ, 3ʹ, 4ʹ и 5ʹ (1ʹ читается как «один простой»). Нуклеозид состоит из пятиуглеродного сахара и азотистого основания.

Рисунок 1.(а) Каждый дезоксирибонуклеотид состоит из сахара, называемого дезоксирибозой, фосфатной группы и азотистого основания — в данном случае аденина. (b) Пять атомов углерода в дезоксирибозе обозначены как 1ʹ, 2ʹ, 3ʹ, 4ʹ и 5ʹ.

Дезоксирибонуклеотид назван в соответствии с азотистыми основаниями (рис. 2). Азотистые основания аденин (A) и гуанин (G) представляют собой пурины ; они имеют двойную кольцевую структуру с шестиуглеродным кольцом, конденсированным с пятиуглеродным кольцом. пиримидинов , цитозин (C) и тимин (T), представляют собой более мелкие азотистые основания, которые имеют только шестиуглеродную кольцевую структуру.

Рис. 2. Азотистые основания в ДНК подразделяются на пурины с двумя кольцами, аденин и гуанин, и пиримидины с одним кольцом, цитозин и тимин. Тимин уникален для ДНК.

Отдельные нуклеозидтрифосфаты соединяются друг с другом ковалентными связями, известными как 5ʹ-3ʹ фосфодиэфирные связи , или связями, посредством которых фосфатная группа, присоединенная к 5ʹ атому углерода одного нуклеотида, связывается с гидроксильной группой 3ʹ углерода сахара. следующего нуклеотида.Фосфодиэфирная связь между нуклеотидами образует сахарно-фосфатный каркас , чередующуюся сахарно-фосфатную структуру, составляющую каркас цепи нуклеиновой кислоты (рис. 3). В процессе полимеризации используются дезоксинуклеотидтрифосфаты (dNTP). Чтобы построить сахарно-фосфатный остов, два концевых фосфата высвобождаются из dNTP в виде пирофосфата. Полученная цепь нуклеиновой кислоты имеет свободную фосфатную группу на 5′-углеродном конце и свободную гидроксильную группу на 3′-углеродном конце.Две неиспользованные фосфатные группы из нуклеотидтрифосфата высвобождаются в виде пирофосфата во время образования фосфодиэфирной связи. Впоследствии пирофосфат гидролизуется, высвобождая энергию, используемую для полимеризации нуклеотидов.

Рис. 3. Фосфодиэфирные связи образуются между фосфатной группой, присоединенной к 5ʹ атому углерода одного нуклеотида, и гидроксильной группой 3ʹ углерода в следующем нуклеотиде, вызывая полимеризацию нуклеотидов в цепи нуклеиновой кислоты. Обратите внимание на 5ʹ и 3ʹ концы этой цепи нуклеиновой кислоты.

Подумай об этом

  • Что означают 5ʹ и 3ʹ концы цепи нуклеиновой кислоты?

Открытие двойной спирали

К началу 1950-х годов накопилось немало свидетельств того, что ДНК является генетическим материалом клеток, и теперь гонка открыла ее трехмерную структуру. Примерно в это же время австрийский биохимик Эрвин Чаргафф (1905–2002) исследовал содержание ДНК у разных видов и обнаружил, что аденин, тимин, гуанин и цитозин не были обнаружены в равных количествах и что оно варьировалось от вида к виду. виды, но не между особями одного и того же вида.Он обнаружил, что количество аденина было очень близко к количеству тимина, а количество цитозина было очень близко к количеству гуанина, или A = T и G = C. Эти отношения также известны как правила Чаргаффа . .

Рис. 4. Рентгенограмма ДНК показывает ее спиральную природу. (кредит: Национальный институт здоровья)

Другие ученые также активно изучали эту область в середине 20-го века. В 1952 году американский ученый Линус Полинг (1901–1994) был ведущим в мире химиком-строителем и вероятным фаворитом в исследовании структуры ДНК.Полинг ранее открыл структуру α-спиралей белка, используя рентгеновскую дифракцию , и, основываясь на изображениях дифракции рентгеновских лучей ДНК, сделанных в его лаборатории, он предложил трехцепочечную модель ДНК. В то же время британские исследователи Розалинд Франклин (1920–1958) и ее аспирант Р.Г. Gosling также использовали дифракцию рентгеновских лучей, чтобы понять структуру ДНК (рис. 4). Благодаря научным знаниям Франклина были получены более четкие рентгеновские дифракционные изображения ДНК, которые ясно показали бы общую структуру двойной спирали ДНК.

Джеймс Уотсон (1928–), американский ученый, и Фрэнсис Крик (1916–2004), британский ученый, работали вместе в 1950-х годах над открытием структуры ДНК. Они использовали правил Чаргаффа и Франклина и Уилкинса рентгеновских дифракционных изображений волокон ДНК, чтобы соединить воедино пурин-пиримидиновые пары двойной спиральной молекулы ДНК (рис. 5). В апреле 1953 года Watson и Crick опубликовали свою модель двойной спирали ДНК в Nature .В этот же выпуск включены статьи Уилкинса и его коллег, каждая из которых описывает различные аспекты молекулярной структуры ДНК. В 1962 году Джеймс Уотсон, Фрэнсис Крик и Морис Уилкинс были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине. К сожалению, к тому времени Франклин умер, и Нобелевские премии в то время не были присуждены посмертно. Однако работа по изучению структуры ДНК продолжалась. В 1973 году Александр Рич (1924–2015) и его коллеги смогли проанализировать кристаллы ДНК для подтверждения и дальнейшего выяснения структуры ДНК.

Рис. 5. В 1953 году Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик построили эту модель структуры ДНК, показанную здесь на выставке в Музее науки в Лондоне.

Подумай об этом

  • Каким ученым больше всего доверяют описание молекулярной структуры ДНК?

Структура ДНК

Уотсон и Крик предположили, что ДНК состоит из двух нитей, которые скручены друг вокруг друга, образуя правую спираль.Две цепи ДНК антипараллельны , так что 3ʹ конец одной цепи обращен к 5ʹ концу другой (рис. 6). 3′-конец каждой цепи имеет свободную гидроксильную группу, а 5′-конец каждой цепи имеет свободную фосфатную группу. Сахар и фосфат полимеризованных нуклеотидов образуют основу структуры, в то время как азотистые основания укладываются в стопку внутри. Эти азотистые основания внутри молекулы взаимодействуют друг с другом, образуя пары оснований.

Анализ дифрактограмм ДНК показал, что в ДНК содержится примерно 10 оснований на один виток.Асимметричное расположение сахарно-фосфатных скелетов формирует большие бороздки (где скелет находится далеко друг от друга) и малые бороздки (где скелет находится близко друг к другу) (Рисунок 6). Эти бороздки — места, где белки могут связываться с ДНК. Связывание этих белков может изменять структуру ДНК, регулировать репликацию или регулировать транскрипцию ДНК в РНК.

Рис. 6. Уотсон и Крик предложили модель двойной спирали для ДНК. (а) Сахарно-фосфатные скелеты находятся снаружи двойной спирали, а пурины и пиримидины образуют «ступеньки» лестницы спирали ДНК.(b) Две цепи ДНК антипараллельны друг другу. (c) Направление каждой цепи определяется нумерацией атомов углерода (от 1 до 5) в каждой молекуле сахара. 5ʹ конец — это тот, где углерод №5 не связан с другим нуклеотидом; 3ʹ конец — это тот, где углерод №3 не связан с другим нуклеотидом.

Спаривание оснований происходит между пурином и пиримидином. В ДНК аденин (A) и тимин (T) представляют собой комплементарных пар оснований , а цитозин (C) и гуанин (G) также являются комплементарными парами оснований, что объясняет правила Чаргаффа (рис. 7).Пары оснований стабилизированы водородными связями; аденин и тимин образуют между собой две водородные связи, тогда как цитозин и гуанин образуют между собой три водородные связи.

Рис. 7. Водородные связи образуются между комплементарными азотистыми основаниями внутри ДНК.

В лаборатории, подвергая две цепи ДНК двойной спирали воздействию высоких температур или определенных химических веществ, можно разорвать водородные связи между комплементарными основаниями, тем самым разделив цепи на две отдельные одинарные цепи ДНК (однониточная ДНК [ оцДНК ]).Этот процесс называется денатурацией ДНК и аналогичен денатурации белка, как описано в разделе «Белки». Нити оцДНК также могут быть снова собраны вместе в виде двухцепочечной ДНК ( дцДНК ) путем повторного отжига или ренатурации путем охлаждения или удаления химических денатурантов, позволяя этим водородным связям реформироваться. Способность искусственно манипулировать ДНК таким образом лежит в основе нескольких важных методов биотехнологии (рис. 8). Из-за дополнительной водородной связи между парой оснований C = G ДНК с высоким содержанием GC денатурировать труднее, чем ДНК с более низким содержанием GC.

Рис. 8. В лаборатории двойная спираль может быть денатурирована в одноцепочечную ДНК под воздействием тепла или химикатов, а затем ренатурирована путем охлаждения или удаления химических денатурантов, чтобы позволить цепям ДНК повторно отожиться. (кредит: модификация работы Эрнандеса-Лемуса Э., Никасио-Коллазо, Л.А., Кастаньеда-Приего, Р.)

Просмотрите анимацию о структуре ДНК в Центре обучения ДНК, чтобы узнать больше.

Подумай об этом

  • Какие две дополнительные пары оснований ДНК и как они связаны друг с другом?

Функция ДНК

ДНК

хранит информацию, необходимую для построения клетки и управления ею.Передача этой информации от матери к дочерним клеткам называется вертикальным переносом генов и происходит в процессе репликации ДНК. ДНК реплицируется, когда клетка создает дубликат своей ДНК, затем клетка делится, что приводит к правильному распределению одной копии ДНК в каждой полученной клетке. ДНК также может подвергаться ферментативной деградации и использоваться в качестве источника нуклеозидов и нуклеотидов для клетки. В отличие от других макромолекул, ДНК не играет структурной роли в клетках.

Подумай об этом

  • Как ДНК передает генетическую информацию потомству?

Прокладывая путь для женщин в науке и медицине

Исторически женщины были недопредставлены в науке и медицине, и часто их новаторский вклад оставался относительно незамеченным. Например, хотя Розалинда Франклин выполнила исследований дифракции рентгеновских лучей , демонстрирующих двойную спиральную структуру ДНК, именно Уотсон и Крик прославились этим открытием, опираясь на свои данные.До сих пор остаются большие разногласия по поводу того, было ли уместным получение ими ее данных и способствовали ли личные конфликты и гендерная предвзятость задержке признания ее значительного вклада. Точно так же Барбара МакКлинток провела новаторскую работу в области генетики кукурузы (кукурузы) с 1930-х по 1950-е годы, открыв транспозонов (прыгающие гены), но она была признана намного позже, получив Нобелевскую премию по физиологии и медицине в 1983 году ( Рисунок 9).

Сегодня женщины по-прежнему недопредставлены во многих областях науки и медицины. В то время как более половины ученых степеней бакалавра естественных наук присуждается женщинам, только 46% ученых степеней доктора наук присуждаются женщинам. В академических кругах число женщин на каждом уровне карьерного роста продолжает уменьшаться, при этом женщины занимают менее одной трети должностей ученых с докторской степенью на штатных должностях и менее четверти должностей. полное профессорство в 4-летних колледжах и университетах.Даже в медицинских профессиях, как и почти во всех других областях, женщины часто недопредставлены во многих медицинских профессиях и зарабатывают значительно меньше, чем их коллеги-мужчины, как показано в исследовании 2013 года, опубликованном в журнале Американской медицинской ассоциации .

Почему такое неравенство продолжает существовать и как нам разорвать эти циклы? Ситуация сложна и, вероятно, является результатом сочетания различных факторов, в том числе того, как общество определяет поведение девочек с раннего возраста и поддерживает их интересы как в профессиональном, так и в личном плане.Некоторые считают, что женщины не принадлежат к лаборатории, в том числе лауреат Нобелевской премии Тим Хант, чьи публичные комментарии 2015 года о том, что женщины слишком эмоциональны для науки, были встречены повсеместным осуждением.

Возможно, девочек с раннего возраста следует больше поддерживать в области естественных наук и математики (рис. 9). Программы в области науки, технологий, инженерии и математики (STEM), спонсируемые Американской ассоциацией женщин с университетским образованием (AAUW) и Национальным управлением по аэронавтике и исследованию космического пространства (NASA), являются прекрасными примерами программ, которые предлагают такую ​​поддержку.Вклад женщин в науку должен быть более широко известен общественности, а маркетинг, ориентированный на молодых девушек, должен включать больше изображений исторически и профессионально успешных женщин-ученых и медицинских работников, поощряя все яркие молодые умы, включая девушек и женщин, к продолжению карьеры. в науке и медицине.

Рис. 9. (a) Работа Барбары МакКлинток по генетике кукурузы в 1930-1950-х годах привела к открытию транспозонов, но в то время ее значение не было признано.(b) Усилия по наставничеству и постоянной социальной поддержке женщин в науке и медицине могут когда-нибудь помочь решить некоторые из проблем, препятствующих гендерному равенству на всех уровнях в науке и медицине. (кредит a: модификация работы Смитсоновского института; кредит b: модификация работы Haynie SL, Hinkle AS, Jones NL, Martin CA, Olsiewski PJ, Roberts MF)

Клиническое направление: Аамир, часть 2

Этот пример продолжает историю Аамира, начатую с книги «Использование микробиологии для открытия секретов жизни».

Основываясь на симптомах, врач Аамира подозревает, что он страдает пищевым заболеванием, которое он приобрел во время своих путешествий. Возможные варианты включают бактериальную инфекцию (например, энтеротоксигенный E. coli , Vibrio cholerae , Campylobacter jejuni , Salmonella ), вирусную инфекцию (ротавирусную или протозойную инфекцию), Giardia lamblia , Cryptosporidium parvum или Entamoeba histolytica ).

Его врач назначает образец стула для выявления возможных возбудителей (например, бактерий, кист) и поиска крови из-за определенных типов инфекционных агентов (например, C. jejuni , Salmonella и E. histolytica). ) связаны с выделением кровавого стула.

Образец стула Аамира не показал ни крови, ни кист. После анализа образца стула и на основании его недавней истории путешествий врач больницы заподозрил, что Аамир страдает диареей путешественников, вызванной энтеротоксигенным возбудителем E.coli ( ETEC ), возбудитель диареи большинства путешественников. Чтобы проверить диагноз и исключить другие возможности, врач Аамира заказал диагностический лабораторный анализ его стула для поиска последовательностей ДНК, кодирующих специфические факторы вирулентности ETEC. Врач посоветовал Аамиру пить много жидкости, чтобы восполнить то, что он теряет, и выписал его из больницы.

ETEC продуцирует несколько факторов вирулентности, кодируемых плазмидами, которые делают его патогенным по сравнению с типичным E.coli . К ним относятся секретируемые токсины , термолабильный энтеротоксин (LT) и термостабильный энтеротоксин (ST) (ST) , а также фактор колонизации (CF) . И LT, и ST вызывают выведение ионов хлора из кишечных клеток в просвет кишечника, вызывая, как следствие, потерю воды из кишечных клеток, что приводит к диарее. CF кодирует бактериальный белок, который помогает бактериям прилипать к слизистой оболочке тонкой кишки.

  • Почему врач Аамира использовал генетический анализ вместо выделения бактерий из образца стула или прямого окрашивания по Граму только образца стула?

Мы вернемся к примеру Аамира на следующих страницах.

Основные понятия и краткое изложение

  • Нуклеиновые кислоты состоят из нуклеотидов , каждый из которых содержит пентозный сахар, фосфатную группу и азотистого основания . дезоксирибонуклеотидов в ДНК содержат дезоксирибозу в качестве пентозного сахара.
  • ДНК
  • содержит пиримидинов цитозин и тимин , а также пуринов аденин и гуанин .
  • Нуклеотиды связаны друг с другом фосфодиэфирными связями между 5′-фосфатной группой одного нуклеотида и 3′-гидроксильной группой другого. Нить нуклеиновой кислоты имеет свободную фосфатную группу на 5′-конце и свободную гидроксильную группу на 3′-конце.
  • Чаргафф обнаружил, что количество аденина примерно равно количеству тимина в ДНК, и что количество гуанина примерно равно цитозину .Позднее было установлено, что эти отношения связаны с дополнительным спариванием оснований.
  • Уотсон и Крик, опираясь на работы Чаргаффа, Франклина, Гослинга и Уилкинса, предложили модель двойной спирали и спаривание оснований для структуры ДНК.
  • ДНК
  • состоит из двух комплементарных цепей, ориентированных на антипараллельно друг другу с фосфодиэфирными остовами на внешней стороне молекулы. Азотистые основания каждой нити обращены друг к другу, а дополнительные водородные связи оснований связываются друг с другом, стабилизируя двойную спираль.
  • Тепло или химические вещества могут разорвать водородные связи между комплементарными основаниями, денатурируя ДНК. Охлаждение или удаление химикатов может привести к ренатурации или повторному отжигу ДНК, позволяя водородным связям реформироваться между дополнительными основаниями.
  • ДНК хранит инструкции, необходимые для создания клетки и управления ею. Эта информация передается от родителей к потомству посредством вертикального переноса генов .

Множественный выбор

Что из перечисленного не встречается в ДНК?

  1. тимин
  2. фосфодиэфирные связи
  3. комплементарная пара оснований
  4. аминокислот
Показать ответ

Ответ d.Аминокислоты не обнаруживаются в ДНК.

Если 30% оснований в молекуле ДНК составляют аденин, каков процент тимина?

  1. 20%
  2. 25%
  3. 30%
  4. 35%
Показать ответ

Ответ c. 30% основ будет тимин.

Какое из следующих утверждений о спаривании оснований в ДНК неверно?

  1. Пурины всегда пары оснований с пиримидинами.
  2. Аденин связывается с гуанином.
  3. Пары оснований стабилизированы водородными связями.
  4. Спаривание оснований происходит внутри двойной спирали.
Показать ответ

Ответ б. Аденин связывается с гуанином.

Если цепь ДНК содержит последовательность 5ʹ-ATTCCGGATCGA-3ʹ, что из следующего является последовательностью комплементарной цепи ДНК?

  1. 5ʹ-TAAGGCCTAGCT-3ʹ
  2. 5ʹ-ATTCCGGATCGA-3ʹ
  3. 3ʹ-TAACCGGTACGT-5ʹ
  4. 5ʹ-TCGATCCGGAAT-3ʹ
Показать ответ

Ответ d. 5ʹ-TCGATCCGGAAT-3ʹ представляет собой комплементарную цепь ДНК.

Что происходит во время денатурации ДНК?

  1. Водородные связи между комплементарными основаниями разрываются.
  2. Фосфодиэфирные связи разрываются в сахарно-фосфатной цепи.
  3. Водородные связи в сахарно-фосфатной основной цепи разрываются.
  4. Фосфодиэфирные связи между комплементарными основаниями разрываются.
Показать ответ

Ответ а. Разрываются водородные связи между комплементарными основаниями.

Заполните пропуск

Конец цепи нуклеиновой кислоты со свободной фосфатной группой называется ________.

Показать ответ

Конец цепи нуклеиновой кислоты со свободной фосфатной группой называется 5ʹ концом .

Верно / Неверно

Работа Розалинды Франклин и Р.Г. Гослинг сыграл важную роль в демонстрации спиральной природы ДНК.

Пара оснований A-T имеет больше водородных связей, чем пара оснований C-G.

Подумай об этом

  1. Какова роль фосфодиэфирных связей в сахарно-фосфатной основе ДНК?
  2. Что означает термин «антипараллельный»?
  3. Почему ДНК с высоким содержанием GC труднее денатурировать, чем ДНК с низким содержанием GC?
  4. Рассматривая структуру двойной спирали ДНК, как бы вы ожидали, что структура будет отличаться, если бы между двумя пуринами было спаривание оснований? Между двумя пиримидинами?
  5. Определенный образец ДНК имеет состав, состоящий на 22% из тимина.Используйте правила Чаргаффа, чтобы ввести проценты для трех других азотистых оснований.
основание аденин гуанин тимин цитозин
% 22%

Наука о ВИЧ и СПИДе — обзор

Ключевые точки

  • ВИЧ — это вирус иммунодефицита человека, патоген, который действует, нападая на иммунную систему человека.
  • ВИЧ специально нацелен на клетки CD4, основных защитников организма от инфекции, используя их для создания собственных копий.
  • Антиретровирусные препараты нацелены на определенные этапы «жизненного цикла ВИЧ», чтобы остановить репликацию ВИЧ.

Изучите эту страницу, чтобы узнать больше о структуре ВИЧ, жизненном цикле ВИЧ, клинических стадиях ВИЧ и резервуарах ВИЧ.

ВИЧ — это вирус иммунодефицита человека, патоген, который действует, нападая на иммунную систему человека.Он принадлежит к классу вирусов, называемых ретровирусами, а точнее, к подгруппе, называемой лентивирусами, или вирусами, которые медленно вызывают заболевание.

ВИЧ не может реплицироваться сам по себе, поэтому для создания новых копий он должен заразить клетки иммунной системы человека, называемые клетками CD4. Клетки CD4 — это белые кровяные тельца, которые играют центральную роль в реагировании на инфекции в организме.

Со временем клетки CD4 убиваются ВИЧ, и способность организма распознавать некоторые типы инфекций и бороться с ними начинает снижаться.Если ВИЧ не контролируется лечением, потеря клеток CD4 приводит к развитию серьезных заболеваний или «оппортунистических инфекций». У людей с нормальным уровнем клеток CD4 эти инфекции распознаются и устраняются иммунной системой.

Совокупность этих инфекций — наиболее поздняя стадия ВИЧ, когда считается, что человек болен СПИДом (синдром приобретенного иммунодефицита). Эффективное тестирование и лечение ВИЧ означает, что подавляющее большинство людей, живущих с ВИЧ, не достигают этой стадии.

ВИЧ называют ретровирусом, потому что он действует по прямой схеме. В отличие от других вирусов, ретровирусы хранят свою генетическую информацию, используя РНК вместо ДНК, что означает, что им нужно «создавать» ДНК, когда они входят в человеческую клетку, чтобы создавать новые копии самих себя.

ВИЧ — это вирус сферической формы. Внешняя оболочка вируса называется оболочкой, и она покрыта шипами «гликопротеинов» gp120 и gp41, которые позволяют ВИЧ закрепляться на рецепторе CD4 на Т-лимфоцитах CD4 и проникать в клетку.

Внутри оболочки вируса находится слой, называемый матрицей. Ядро вируса, или ядро, удерживается в капсиде, конусообразной структуре в центре вириона. Капсид содержит два фермента, необходимых для репликации ВИЧ, молекулы обратной транскриптазы и интегразы. Он также содержит две цепи РНК, которые содержат генетический материал ВИЧ.

РНК

ВИЧ состоит из девяти генов, содержащих все инструкции по созданию новых вирусов. Три из этих генов — gag, pol и env — предоставляют инструкции по созданию белков, которые будут формировать новые вирусные частицы.Например, env предоставляет код для создания белков, которые образуют оболочку или оболочку ВИЧ. gag производит структурные белки, такие как матрица и капсид, а pol производит ферменты, необходимые для создания новых вирусов.

Остальные шесть генов, известные как tat, rev, nef, vif, vpr и vpu , обеспечивают код для создания белков, которые контролируют способность ВИЧ инфицировать клетку, производить новые копии вируса или высвобождать вирусы из инфицированных клеток. клетки.

1. Приложение и запись

Процесс производства новых вирусов начинается, когда ВИЧ проникает в клетку. Этот процесс происходит в два этапа: привязанность и слияние.

ВИЧ заражает клетки иммунной системы, на поверхности которых находится рецептор CD4. Эти клетки включают Т-лимфоциты (также известные как Т-клетки), моноциты, макрофаги и дендритные клетки. Рецептор CD4 используется клеткой для передачи сигнала другим частям иммунной системы о присутствии антигенов.

Когда ВИЧ контактирует с клеткой CD4, шип gp120 на поверхности ВИЧ фиксируется на рецепторе CD4 и другом корецепторе, CCR5 или CXCR4.Белок gp41 используется для слияния оболочки ВИЧ с клеточной стенкой. Этот процесс слияния позволяет капсиду ВИЧ проникать в клетку CD4.

Было разработано несколько типов антиретровирусных препаратов для блокирования различных стадий процессов прикрепления и проникновения:

  • Ингибитор CCR5
  • Ингибитор прикрепления
  • Ингибитор слияния

Белки gp41 и gp120 на поверхности вируса также являются мишенями для вакцин, предназначенных для выработки ответов антител.

2. Обратная транскрипция

Когда РНК ВИЧ попадает в клетку, она должна быть «обратной транскрипцией» в провирусную ДНК, прежде чем она может быть интегрирована в ДНК клетки-хозяина. ВИЧ использует свой фермент обратной транскриптазы для преобразования РНК в провирусную ДНК внутри клетки.

Были разработаны два типа антиретровирусных препаратов, чтобы остановить действие обратной транскриптазы и создание провирусной ДНК:

  • Нуклеозидные и нуклеотидные ингибиторы обратной транскриптазы (НИОТ и НИОТ) блокируют продукцию ВИЧ, вставляя нуклеозид или нуклеотид в цепь ДНК ВИЧ по мере ее создания, обрывая цепь.

Ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (ННИОТ) блокируют продукцию ВИЧ, связываясь непосредственно с ферментом обратной транскриптазы.

3. Интеграция

После преобразования РНК ВИЧ в ДНК фермент интегразы ВИЧ прикрепляется к концу цепей провирусной ДНК и проходит через стенку ядра клетки. Как только провирусная ДНК входит в ядро ​​клетки, она связывается с ДНК-хозяином, а затем цепь ДНК ВИЧ вставляется в ДНК клетки-хозяина.

Ингибиторы интегразы

ВИЧ были разработаны для блокирования переноса цепи ДНК ВИЧ в ДНК клетки-хозяина.

После того, как провирусная ДНК интегрирована в ДНК клетки-хозяина, ВИЧ остается бездействующим в клеточной ДНК. Эта стадия называется задержкой, и ячейка описывается как «латентно инфицированная». Эти латентно инфицированные клетки бывает трудно обнаружить даже при использовании самых чувствительных тестов.

4. Транскрипция и перевод

Клетка будет вырабатывать РНК ВИЧ, если получит сигнал об активности.Клетки CD4 активируются, если они сталкиваются с инфекционным агентом.

Когда клетка становится активной, ВИЧ использует ферментную РНК-полимеразу хозяина для создания информационной РНК. Эта информационная РНК предоставляет инструкции по созданию новых вирусных белков в длинных цепочках.

Длинные цепи белков ВИЧ разрезаются на более мелкие цепи ферментом протеазой ВИЧ.

5. Сборка и раскладка

Эти белковые цепи начинают собираться в новые вирусы в клеточной стенке.

  • Ингибиторы протеазы ВИЧ предназначены для блокирования активности фермента протеазы ВИЧ.

По мере того, как вирус отрывается от клеточной стенки, его геном оказывается заключенным в капсид, продуцируемый из белка gag ВИЧ . После сборки нового вируса он должен покинуть клетку, проталкиваясь через клеточную стенку. Чтобы полностью покинуть клетку и стать заразным, вирус должен забрать липиды (жиры) из клеточной стенки для образования поверхностных гликопротеинов.

  • Ингибиторы созревания разрабатываются для блокирования расщепления белка gag , необходимого для производства зрелого вируса.

1. Первичная (острая) ВИЧ-инфекция

ВИЧ проникает в организм путем инфицирования клеток CD4 на слизистых оболочках влагалища или прямой кишки или путем прямого инфицирования Т-лимфоцитов CD4 в кровотоке.

На этом этапе доконтактная профилактика с использованием антиретровирусных препаратов может предотвратить заражение ВИЧ, если ее принимать постоянно. Постконтактная профилактика с помощью комбинации из трех антиретровирусных препаратов может предотвратить заражение ВИЧ на этой стадии и в течение 72 часов после контакта.

Дендритные клетки одними из первых сталкиваются с ВИЧ, их задача — транспортировать инфекционные агенты к лимфатическим узлам. Когда ВИЧ попадает в лимфатические узлы — примерно через 24–48 часов после контакта — они активируют другие иммунные клетки, такие как Т-клетки CD4, первичную мишень ВИЧ.

Именно здесь, в лимфатических узлах, начинает размножаться ВИЧ. На этом этапе ВИЧ не обнаруживается в крови при тестировании на вирусную нагрузку (РНК ВИЧ) или тестировании на антитела. Эта стадия может длиться от 7 до 21 дня, и в течение этого периода ВИЧ может быть обнаружен только путем взятия образцов непосредственно из ткани лимфатического узла (биопсия).Трехкомпонентная антиретровирусная терапия, начатая на этой стадии ВИЧ-инфекции, может значительно ограничить распространение ВИЧ на долгоживущие клетки иммунной системы, которые образуют «резервуар» ВИЧ-инфекции в организме. Через несколько недель после заражения ВИЧ обнаруживается в крови при тестировании на вирусную нагрузку. На этом этапе люди могут начать испытывать симптомы острой ВИЧ-инфекции, поскольку уровень ВИЧ в крови очень высок. Общие симптомы острой ВИЧ-инфекции включают лихорадку, сыпь на теле, опухшие железы и другие.Хотя лихорадка и сыпь являются наиболее частыми симптомами острой ВИЧ-инфекции, не у всех они возникают.

Симптомы острой инфекции могут длиться до 2 недель. В это время вирусная нагрузка достигает своего пика и может составлять более 1 миллиона копий на мл крови. В это время упадет и уровень клеток CD4. Вероятность передачи ВИЧ наиболее высока в течение первых нескольких месяцев после заражения, когда уровни ВИЧ в крови, семенной жидкости и влагалищной жидкости очень высоки. Примерно через три-четыре недели после заражения антиген ВИЧ (p24) также станет определяемым.Тесты на антитела / антиген «четвертого поколения», которые сочетают в себе определение антител к ВИЧ и антигена p24 ВИЧ, на этом этапе покажут положительный результат. В течение следующих 4-8 дней тесты только на антитела к ВИЧ с использованием крови покажут положительный результат. Уровни ВИЧ в крови начинают падать, а уровни CD4 снова начинают расти, хотя и не до уровня, существовавшего до заражения. Примерно через 6 месяцев вирусная нагрузка и уровни CD4 стабилизируются на уровне, известном как «контрольная точка

».

2. Хроническая инфекция

ВИЧ-инфекция не станет причиной дальнейшего заболевания в течение нескольких лет.Этот период известен как бессимптомная фаза. ВИЧ постепенно снижает количество клеток CD4 в организме до тех пор, пока количество клеток CD4 не упадет ниже 200 клеток / мм3. После того, как количество клеток CD4 упадет ниже этого уровня, значительно возрастет риск развития инфекций, связанных со СПИДом (оппортунистических инфекций).

Бессимптомная фаза длится в среднем около десяти лет. Продолжительность бессимптомной фазы зависит от того, насколько быстро снижается количество клеток CD4. Если у человека очень высокая вирусная нагрузка (более 100 000 копий / мл), он быстрее теряет клетки CD4.

Антиретровирусное лечение подавляет ВИЧ до неопределяемого уровня, восстанавливает количество клеток CD4 до нормального уровня и предотвращает заболевание, если его начать в любое время в течение бессимптомной фазы и принимать каждый день. Все руководства по лечению рекомендуют людям начинать лечение, как только они будут готовы после установления диагноза ВИЧ.

Во время бессимптомной фазы количество лимфоцитов CD4 и тесты на вирусную нагрузку позволяют отслеживать прогрессирование ВИЧ-инфекции.

Хотя ВИЧ можно контролировать с помощью антиретровирусной терапии, его нельзя вывести из организма.Это связано с тем, что ВИЧ уклоняется от нормальных механизмов иммунной системы по избавлению от клеток, инфицированных вирусами.

ВИЧ интегрируется в ДНК клеток иммунной системы человека и реплицируется только тогда, когда клетка стимулируется для ответа на инфекцию. Эти клетки называются латентно инфицированными клетками. Эти клетки не распознаются иммунной системой как инфицированные и не уничтожаются, что позволяет им существовать на протяжении всей жизни клетки.

Некоторые из клеток, инфицированных ВИЧ, представляют собой Т-клетки с очень длительной памятью.Резервуары латентно инфицированных клеток образуются в лимфатических узлах, селезенке и кишечнике. ВИЧ также поражает клетки мозга, но неясно, может ли ВИЧ передаваться из мозга в другие части тела. ВИЧ также может сохраняться в течение многих лет в макрофагах — иммунных клетках, обнаруженных в основном в тканях, — и в дендритных клетках, которые распознают инфекционные агенты и предупреждают другие иммунные клетки об их удалении.

Латентно инфицированные клетки могут пролиферировать без активации, и ВИЧ также может переходить от клетки к клетке в тканях кишечника и других резервуарах.Это означает, что они ускользают от иммунной системы и не подавляются антиретровирусными препаратами до того, как заразят другие клетки.

Неясно, как быстро в организме образуется резервуар ВИЧ-инфицированных клеток. Наблюдения за небольшим числом людей, которые начали антиретровирусное лечение в течение нескольких дней или недель после заражения, показывают, что у них меньше ВИЧ-инфицированных клеток, и если они прекратят антиретровирусное лечение, некоторые смогут контролировать ВИЧ в течение длительного времени без возобновления лечения.

ПОМОГИТЕ НАМ ПОМОГИТЕ ДРУГИМ

Avert.org помогает предотвратить распространение ВИЧ и улучшить сексуальное здоровье, предоставляя людям достоверную и актуальную информацию.

Мы предоставляем все это БЕСПЛАТНО, но чтобы поддерживать Avert.org, нужны время и деньги.

Можете ли вы поддержать нас и защитить наше будущее?

Помогает каждый вклад, даже самый маленький.

Фото: © iStock.com / muzon

Тесты, используемые на биопсийных и цитологических образцах для диагностики рака

Тип и степень рака обычно ясны, когда клетки видны под микроскопом после стандартной обработки и окрашивания, но это не всегда так.Иногда патологу необходимо использовать другие процедуры для постановки диагноза.

Гистохимические пятна

В этих тестах используются различные химические красители, которые привлекают определенные вещества, обнаруженные в некоторых типах раковых клеток. Например, слизь притягивает пятно муцикармина. Капли слизи внутри клетки, подвергшиеся воздействию этого пятна, под микроскопом будут выглядеть розово-красными. Это окрашивание полезно, если патолог подозревает, например, аденокарциному (железистый тип рака) при биопсии легкого.Аденокарциномы могут выделять слизь, поэтому обнаружение розово-красных пятен в клетках рака легких скажет патологу, что диагноз — аденокарцинома.

Помимо того, что они помогают при сортировке различных видов опухолей, в лаборатории используются другие типы специальных красителей для выявления в тканях микроорганизмов (микробов), таких как бактерии и грибки. Это важно, потому что у людей с раком могут развиться инфекции как побочный эффект лечения или даже из-за самого рака. Это также важно при диагностике рака, потому что некоторые инфекционные заболевания вызывают образование шишек, которые можно принять за рак, пока гистохимические исследования не докажут, что у пациента инфекция, а не рак.

Иммуногистохимические красители

Иммуногистохимические (ИГХ) или иммунопероксидазные пятна — еще одна очень полезная категория специальных тестов. Основной принцип этого метода заключается в том, что иммунный белок, называемый антителом , , будет прикрепляться к определенным веществам, называемым антигенами , которые находятся в клетке или внутри нее. Каждый тип антител распознает и прикрепляется к антигенам, которые ему точно подходят. Определенные типы нормальных клеток и раковых клеток имеют уникальные антигены.Если у клеток есть специфический антиген, они будут привлекать антитело, соответствующее этому антигену. Чтобы определить, были ли антитела привлечены к клеткам, добавляются химические вещества, которые заставляют клетки менять цвет только при наличии определенного антитела (и, следовательно, антигена).

Наш организм обычно вырабатывает антитела, которые распознают антигены микробов и помогают защитить нас от инфекций. Антитела, используемые при окрашивании ИГХ, разные. Они созданы в лаборатории для распознавания антигенов, связанных с раком и другими заболеваниями.

Пятна

IHC очень полезны при идентификации определенных типов рака. Например, рутинно обрабатываемая биопсия лимфатического узла может содержать клетки, которые явно выглядят как рак, но патолог может быть не в состоянии определить, начался ли рак в лимфатическом узле или он начался в другом месте тела и распространился на лимфатический узел. Если рак начался в лимфатическом узле, диагноз — лимфома. Если рак начался в другой части тела и распространился на лимфатический узел, это может быть метастатический рак.Это различие очень важно, потому что лечение зависит от типа рака (а также от некоторых других факторов).

Для тестов ИГХ используются сотни антител. Некоторые из них довольно специфичны, что означает, что они реагируют только с одним типом рака. Другие могут реагировать с несколькими типами рака, поэтому можно проверить несколько антител, чтобы решить, какой это тип рака. Рассматривая эти результаты вместе с появлением рака после обработки образца биопсии, его местонахождением и другой информацией о пациенте (возраст, пол и т. Д.)), часто можно классифицировать рак таким образом, чтобы помочь выбрать лучшее лечение.

Хотя красители ИГХ чаще всего используются для классификации клеток, их также можно использовать для обнаружения или распознавания раковых клеток. Когда большое количество раковых клеток распространилось на соседний лимфатический узел, эти клетки обычно легко распознаются, когда патолог смотрит на лимфатическую ткань под микроскопом, используя обычные красители. Но если в узле всего несколько раковых клеток, может быть трудно распознать клетки, используя только обычные красители.Здесь могут помочь пятна IHC. Как только патолог знает, какой вид рака следует искать, он или она может выбрать одно или несколько антител, которые, как известно, реагируют с этими клетками. Добавляется больше химикатов, чтобы раковые клетки меняли цвет и четко выделялись из окружающих их нормальных клеток. Окрашивание IHC обычно не используется для изучения ткани из лимфатических узлов (которые удаляют большое количество узлов), но иногда они используются при биопсии сторожевых лимфатических узлов. (См. Картирование и биопсию Sentinel лимфатических узлов в нашем обзоре типов биопсии.)

Еще одно специальное использование этих красителей — помочь отличить лимфатические узлы, содержащие лимфому, от узлов, увеличенных в результате увеличения количества нормальных лейкоцитов (обычно в ответ на инфекцию). Определенные антигены присутствуют на поверхности белых кровяных телец, называемых лимфоцитами . Доброкачественная (незлокачественная) ткань лимфатических узлов содержит множество различных типов лимфоцитов с множеством антигенов на их поверхности. Напротив, такие виды рака, как лимфома, начинаются с одной аномальной клетки, поэтому раковые клетки, которые растут из этой клетки, обычно имеют химические свойства первой аномальной клетки.Это особенно полезно при диагностике лимфомы. Если большинство клеток при биопсии лимфатического узла имеют одинаковые антигены на своей поверхности, этот результат подтверждает диагноз лимфомы.

Некоторые красители ИГХ могут помочь распознать определенные вещества в раковых клетках, которые влияют на прогноз пациента и / или на то, могут ли они получить пользу от определенных лекарств. Например, ИГХ обычно используется для проверки рецепторов эстрогена на клетках рака груди. Пациенты, клетки которых имеют эти рецепторы, вероятно, получат пользу от препаратов гормональной терапии, которые блокируют выработку или действие эстрогенов.IHC также может помочь определить, каким женщинам с раком груди могут быть полезны препараты, которые блокируют стимулирующие рост эффекты аномально высоких уровней белка HER2.

Электронная микроскопия

В типичном медицинском лабораторном микроскопе для исследования образцов используется луч обычного света. Более крупный и более сложный прибор, называемый электронным микроскопом , использует пучки электронов. Увеличивающая сила электронного микроскопа примерно в 1000 раз больше, чем у обычного светового микроскопа.Такая степень увеличения редко требуется для определения того, является ли клетка раком. Но иногда это помогает найти очень крошечные детали структуры раковой клетки, которые дают ключ к разгадке точного типа рака.

Например, некоторые случаи меланомы, очень агрессивного рака кожи, могут выглядеть как другие виды рака под обычным световым микроскопом. В большинстве случаев эти меланомы можно распознать по определенным пятнам ИГХ. Но если эти тесты не дадут однозначного ответа, можно использовать электронный микроскоп для выявления крошечных структур внутри клеток меланомы, называемых меланосомами .Это помогает установить тип рака и выбрать лучший план лечения.

Проточная цитометрия

Проточная цитометрия часто используется для тестирования клеток костного мозга, лимфатических узлов и образцов крови. Он очень точно определяет, какой у человека тип лейкемии или лимфомы. Это также помогает отличить лимфомы от нераковых заболеваний лимфатических узлов.

Образец клеток из биопсии, цитологического образца или образца крови обрабатывают специальными антителами.Каждое антитело прикрепляется только к определенным типам клеток, которые имеют соответствующие антигены. Затем клетки проходят перед лазерным лучом. Если теперь в клетках есть эти антитела, лазер заставит их излучать свет, который затем измеряется и анализируется компьютером.

При анализе случаев подозрения на лейкоз или лимфому с помощью проточной цитометрии используются те же принципы, которые описаны в разделе по иммуногистохимии:

  • Обнаружение тех же веществ на поверхности большинства клеток в образце предполагает, что они произошли от одной аномальной клетки и, вероятно, являются раком.
  • Обнаружение нескольких различных типов клеток с различными антигенами означает, что образец с меньшей вероятностью будет содержать лейкоз или лимфому.

Проточная цитометрия также может использоваться для измерения количества ДНК в раковых клетках (называемая плоидностью ). Вместо использования антител для обнаружения белковых антигенов клетки можно обрабатывать специальными красителями, которые вступают в реакцию с ДНК.

  • Если количество ДНК нормальное, клетки называют диплоидными .
  • Если количество ненормальное, клетки описываются как анеуплоид . Анеуплоидный рак большинства (но не всех) органов имеет тенденцию расти и распространяться быстрее, чем диплоидный.

Другое применение проточной цитометрии — измерение фракции S-фазы, которая представляет собой процент клеток в образце, которые находятся на определенной стадии деления клеток, называемой синтезом или S-фазой . Чем больше клеток находится в S-фазе, тем быстрее растет ткань и тем более агрессивным может быть рак.

Изображение цитометрии

Как и в проточной цитометрии, в этом тесте используются красители, вступающие в реакцию с ДНК. Но вместо того, чтобы суспендировать клетки в потоке жидкости и анализировать их с помощью лазера, цитометрия изображений использует цифровую камеру и компьютер для измерения количества ДНК в клетках на предметном стекле микроскопа. Как и проточная цитометрия, визуальная цитометрия также может определять плоидность раковых клеток.

Генетические тесты

Цитогенетика

Нормальные клетки человека имеют 46 хромосом (фрагменты ДНК и белка, которые контролируют рост и функцию клеток).Некоторые виды рака имеют одну или несколько аномальных хромосом. Распознавание аномальных хромосом помогает идентифицировать эти типы рака. Это особенно полезно при диагностике некоторых лимфом, лейкозов и сарком. Даже если тип рака известен, цитогенетические тесты могут помочь предсказать состояние пациента. Иногда тесты могут даже помочь предсказать, на какие химиотерапевтические препараты может подействовать рак.

В раковых клетках можно обнаружить несколько типов хромосомных изменений:

  • Транслокация означает, что часть одной хромосомы оторвалась и теперь находится на другой хромосоме.
  • Инверсия означает, что часть хромосомы перевернута (теперь в обратном порядке), но все еще прикреплена к правой хромосоме.
  • Делеция указывает на потерю части хромосомы.
  • Дупликация происходит, когда часть хромосомы была скопирована, и в клетке обнаружено слишком много ее копий.

Иногда раковые клетки могут получить или потерять целую хромосому.

Для цитогенетического тестирования раковые клетки выращивают в лабораторных чашках в течение примерно 2 недель, прежде чем их хромосомы можно будет рассмотреть под микроскопом.Из-за этого на получение результатов обычно уходит около 3 недель.

Флуоресцентная гибридизация in situ

Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) во многом похожа на цитогенетическое тестирование. Он может обнаружить большинство хромосомных изменений, которые можно увидеть под микроскопом в стандартных цитогенетических тестах. Он также может обнаружить некоторые изменения, которые слишком малы, чтобы их можно было увидеть при обычном цитогенетическом исследовании.

FISH использует специальные флуоресцентные красители, связанные с частями ДНК, которые прикрепляются только к определенным частям определенных хромосом.FISH может обнаружить хромосомные изменения, такие как транслокации, которые важны для классификации некоторых видов лейкемии.

Обнаружение определенных хромосомных изменений также важно для определения того, могут ли определенные лекарственные препараты помочь пациентам с некоторыми типами рака. Например, FISH может показать, когда существует слишком много копий (так называемая амплификация ) гена HER2, что может помочь врачам выбрать лучшее лечение для некоторых женщин с раком груди.

В отличие от стандартных цитогенетических тестов, для FISH нет необходимости выращивать клетки в лабораторных чашках.Это означает, что результаты FISH доступны гораздо раньше, обычно в течение нескольких дней.

Молекулярно-генетические тесты

Другие тесты ДНК и РНК могут использоваться для обнаружения большинства транслокаций, обнаруживаемых цитогенетическими тестами. Они также могут обнаружить некоторые транслокации, затрагивающие части хромосом, слишком маленькие, чтобы их можно было увидеть под микроскопом с помощью обычного цитогенетического тестирования. Этот тип расширенного тестирования может помочь классифицировать некоторые лейкемии и, реже, некоторые саркомы и карциномы. Эти тесты также полезны после лечения, чтобы найти небольшое количество оставшихся раковых клеток лейкемии, которые можно пропустить под микроскопом.

Молекулярно-генетические тесты также могут определять мутации (аномальные изменения) в определенных областях ДНК, которые контролируют рост клеток. Некоторые из этих мутаций могут повышать вероятность роста и распространения рака. В некоторых случаях выявление определенных мутаций может помочь врачам выбрать наиболее эффективные методы лечения.

Определенные вещества, называемые антигенными рецепторами , находятся на поверхности клеток иммунной системы, называемых лимфоцитами. Нормальная ткань лимфатических узлов содержит лимфоциты с множеством различных рецепторов антигена, которые помогают организму реагировать на инфекцию.Но некоторые типы лимфомы и лейкемии начинаются с одного аномального лимфоцита. Это означает, что все эти раковые клетки имеют один и тот же рецептор антигена. Лабораторные тесты ДНК генов рецепторов антигенов каждой клетки являются очень чувствительным способом диагностики и классификации этих видов рака.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР): Это очень чувствительный молекулярно-генетический тест для обнаружения специфических последовательностей ДНК, например, при некоторых раковых заболеваниях. ПЦР с обратной транскриптазой (или ОТ-ПЦР) — это метод, используемый для обнаружения очень малых количеств РНК.РНК — это вещество, связанное с ДНК, которое необходимо клеткам для производства белков. Для каждого белка в нашем организме существуют определенные РНК. ОТ-ПЦР можно использовать для поиска и классификации раковых клеток.

Преимущество ОТ-ПЦР заключается в том, что с ее помощью можно обнаружить очень небольшое количество раковых клеток в образцах крови или тканей, которые могут быть пропущены другими тестами. ОТ-ПЦР обычно используется для обнаружения определенных видов лейкозных клеток, которые остаются после лечения, но ее ценность для более распространенных типов рака менее очевидна.Недостатком является то, что врачи не всегда уверены, означает ли наличие нескольких раковых клеток в кровотоке или лимфатических узлах, что у пациента действительно разовьются отдаленные метастазы, которые вырастут достаточно, чтобы вызвать симптомы или повлиять на выживаемость. При лечении пациентов с наиболее распространенными типами рака до сих пор неясно, должно ли обнаружение нескольких раковых клеток с помощью этого теста быть фактором при выборе вариантов лечения.

ОТ-ПЦР также может использоваться для подклассификации раковых клеток. Некоторые тесты RT-PCR измеряют уровни одной или даже нескольких РНК одновременно.Сравнивая уровни важных РНК, врачи иногда могут предсказать, будет ли рак более или менее агрессивным (вероятно, будет расти и распространяться), чем можно было бы ожидать, исходя из того, как он выглядит под микроскопом. Иногда эти тесты могут помочь предсказать, подействует ли рак на определенные методы лечения.

Микромассивы экспрессии генов: Эти крошечные устройства в некотором смысле похожи на компьютерные чипы. Преимущество этой технологии состоит в том, что относительные уровни сотен или даже тысяч различных РНК из одного образца можно сравнивать одновременно.Результаты показывают, какие гены активны в опухоли. Эта информация иногда может помочь предсказать прогноз (перспективы) пациента или реакцию на определенные виды лечения.

Этот тест иногда используют, когда рак распространился на несколько частей тела, но врачи не знают, где он начался. (Это называется раком неизвестной первичной). РНК-паттерн этих злокачественных новообразований можно сравнить с паттернами известных типов рака, чтобы увидеть, совпадают ли они. При выборе лечения полезно знать, где начался рак.Эти тесты могут помочь сузить тип рака, но они не всегда могут с уверенностью определить тип рака. (Чтобы узнать больше об этом типе рака, см. Неизвестный первичный рак.)

Секвенирование ДНК: В течение последних нескольких десятилетий секвенирование ДНК использовалось для выявления людей, унаследовавших генетические мутации, которые значительно повышают риск развития определенных типов рака. В этом случае при тестировании обычно используется ДНК из клеток крови либо пациентов, у которых уже есть определенные виды рака (например, рак груди или рак толстой кишки), либо из крови их родственников, у которых нет никаких известных форм рака, но которые могут подвергаться повышенному риску.

Врачи начали использовать секвенирование ДНК некоторых видов рака, чтобы помочь предсказать, какие целевые препараты с наибольшей вероятностью подействуют на отдельных пациентов. Эту практику иногда называют «персонализированной онкологией» или «точной онкологией». Сначала секвенирование ДНК проводилось только для одного гена или нескольких генов, которые, как было известно, наиболее часто поражались определенными типами рака. Недавний прогресс позволил секвенировать гораздо больше генов или даже все гены рака (хотя это до сих пор не делается в повседневной практике).Эта информация о последовательности иногда показывает неожиданные мутации в генах, которые затрагиваются реже, и может помочь врачу выбрать лекарство, которое в противном случае не было бы рассмотрено, и избегать других лекарств, которые вряд ли будут полезны.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *