Значение митохондрия: Функции митохондрий в клетке – описание основных

Роль митохондрий в организме функции строение рибосомы

Дата публикации: 06.08.2018 10:00

  Тема эта сложная и комплексная, затрагивающая сразу же огромное количество биохимических процессов происходящих в нашем организме. Но давайте все таки попробуем разобраться, что же такое митохондрии и как они работают.

   И так, митохондрии это одна из самых важных составляющих живой клетки. Если говорить простым языком то можно сказать, что это энергетическая станция клетки. Их деятельность основана на окисление органических соединений и генерации электрического потенциала (энергии освободившейся при распаде молекулы АТФ) для осуществления мышечного сокращения.

   Все мы знаем, что работа нашего организма происходит в строгом соответствии с первым законом термодинамики. Энергия не создается в нашем организме, а лишь превращается. Организм только выбирает форму трансформации энергии, не производя ее, от химической к механической и тепловой. Основным источником всей энергии на планете Земля является Солнце. Приходя к нам в форме света, энергия поглощается хлорофиллом растений, там она возбуждает электрон атома водорода и таким образом дает энергию живой материи.

   Своей жизнью мы обязаны энергии маленького электрона.

 

    Работа митохондрии заключается в ступенчатом переносе энергии электрона водорода между атомами металлов, присутствующих в группах белковых комплексов дыхательной цепи (электронно-транспортной цепи белков), где каждый последующий комплекс обладает более высоким сродством к электрону притягивая его, чем предыдущий, до тех пор, пока электрон не соединиться с молекулярным кислородом, обладающим наибольшим сродством к электрону.

 

      Каждый раз при передачи электрона по цепи высвобождается энергия которая аккумулируется в виде электрохимического градиента и затем реализовывается в виде мышечного сокращения и выделения тепла.

     Серия окислительных процессов в митохондрии позволяющая перенести энергетический потенциал электрона называется «внутриклеточным дыханием» или часто «дыхательной цепью», так как электрон по цепочки передается от атома к атому до тех пор пока не достигнет своей конечной цели атома кислорода.

Митохондриям нужен кислород для переноса энергии в процессе окисления.

Митохондрии потребляют до 80% кислорода который мы вдыхаем.

       Митохондрия представляет из себя постоянную структуру клетки, расположенную в ее цитоплазме. Размер митохондрии обычно составляет от 0,5 до 1 мкм в диаметре. По форме она имеет зернистую структуру и может занимать до 20% объема клетки. Такая постоянная органическая структура клетки называется органелла. К органеллам относятся и миофибриллы – сократительные единицы мышечной клетки; и ядро клетки это тоже органелла. Вообще, любая постоянная структура клетки является органоидом-органеллой.

      Открыл митохондрии и впервые описал немецкий анатом и гистолог Рихард Альтман в 1894 году, а название этой органелле дал другой немецкий гистолог К. Бенд в 1897 году. Но только в 1920 году, опять же немецкий биохимик Отто Вагбург, доказал, что с митохондриями связаны процессы клеточного дыхания.

            Существует теория, согласно которой митохондрии появились в результате захвата примитивными клетками, клетками которые сами не могли использовать кислород для генерации энергии, бактерий протогенотов, которые могли это делать. Именно потому, что митохондрия ранее представляла из себя отдельный живой организм она и по сей день обладает собственным ДНК.

Митохондрии ранее представляли из себя самостоятельный живой организм.

        В ходе эволюции прогеноты предали множество своих генов сформировавшемуся, благодаря повысившейся энергоэффективности, ядру и перестали быть самостоятельными организмами. Митохондрии присутствуют во всех клетках. Даже в сперматозоиде есть митохондрии. Именно благодаря им приводится в движение хвостик сперматозоида осуществляющий его движение. Но особенно много митахондрий в тех местах, где необходима энергия для любых жизненных процессов. И это конечно прежде всего мышечные клетки.

          В мышечных клетках митохондрии могут объединяться в группы гигантских разветвленных митохондрий, связанных друг с другом с помощью межмитохондриальных контактов, в которых они создают согласованную работающую кооперативную систему. Пространство в такой зоне имеет повышенную электронную плотность. Новые митохондрии образуются путем простого деления предыдущих органелл. Наиболее «простой» и доступный всем клеткам механизм энергетического обеспечения чаще всего называют общим понятием гликолиз. 

      Это процесс последовательного разложения глюкозы до пировиноградной кислоты. Если этот процесс происходит без участия молекулярного кислорода или с недостаточным его присутствием, то он называется анаэробный гликолиз. При этом глюкоза расщепляется не до конечных продуктов, а до молочной и пировиноградной кислоты которая далее претерпевает дальнейшие превращения в ходе брожения. Поэтому высвобождающейся энергии бывает меньше, но и скорость получения энергии быстрее. В результате анаэробного гликолиза из одной молекулы глюкозы клетка получает 2 молекулы АТФ и 2 молекулы молочной кислоты. Такой «базовый» энергетический процесс может протекать внутри любой клетки без участия митохондрий. 

        В присутствии молекулярного кислорода внутри митохондрий осуществляется аэробный гликолиз в рамках «дыхательной цепи». Пировиноградная кислота в аэробных условиях вовлекается в цикл трикарбоновых кислот или цикл Кребса. В результате этого многостадийного процесса из одной молекулы глюкозы образуется 36 молекул АТФ. Сравнение энергетического баланса клетки, имеющей развитые митохондрии и клетки, где они не развиты показывает (при достаточном количестве кислорода) различие в полноте использования энергии глюкозы внутри клетки почти в 20 раз!

        Итак, митохондрия — это энергетическая станция в нашем организме и обеспечить ее снабжение топливом помогают продукты серии ТАЙГА8. 

Подробнее о том как они это делают тут и тут.

 

Митохондрии трансформированной клетки как мишень противоопухолевого воздействия | Франциянц

1. Цареградов А.Д., Сухоруков В.С. Митохондриальная медицина — проблемы и задачи. Российский вестник перинатологии и педиатрии. 2012; 4(2): 4–13.

2. Gasparre G, Rossignol R, Sonveaux P. Mitochondria in Cancer. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 2017; 1858(8): 553–732. https://doi.org/10.1016/j.bbabio.2017.05.004

3. Picard M, Wallace DC, Burelle Y. The rise of mitochondria in medicine. Mitochondrion. 2016; 30: 105–116. https://doi.org/10.1016/j.mito.2016.07.003

4. Heekimi S, Wang Y, Noe A. Mitochondrial ROS and the effectors of the intrinsic apoptotic pathway in aging cells: the discerning killers! Front. Genet. 2016; 7: 161. https://doi.org/10.3389/fgene.2016.00161

5. Redza-Dutordoir M, Averill-Bates DA. Activation of apoptosis signalling pathways by reactive oxygen species. Biochim. Biophys. Acta. 2016; 1863(12): 2977–2992. https://doi.org/10.1016/j.bbamcr.2016.09.012

6. Капля А.А., Сорокина Л.В., Хижняк С.В. Перепрограммирование энергетического метаболизма митохондрий в злокачественных новообразованиях. Ukr. Biochem.J. 2015; 87(6): 19–35. https://doi.org/10.15407/ubj87.06.019

7. Zong WX, Rabinowitz JD, White E. Mitochondria and Cancer. Mol Cell. 2016 Mar 3; 61(5): 667–676. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2016.02.011

8. Badrinath N, Yoo SY. Mitochondria in cancer: in the aspects of tumorigenesis and targeted therapy. Carcinogenesis. 2018 Dec 31; 39(12): 1419–1430. https://doi.org/10.1093/carcin/bgy148

9. Куликов В.А., Беляева Л. Е. О биоэнергетике опухолевой клетки. Вестник ВГМУ. 2015; 14(6): 5–14.

10. Srinivasan S, Guha M, Kashina A, Avadhani NG. Mitochondrial dysfunction and mitochondrial dynamics-The cancer connection Biochim. Biophys. 2017; 1858(8): 602–614. https://doi.org/10.1016/j.bbabio.2017.01.004

11. Brandon M, Baldi P, Wallance DC. Mitochondrial mutations in cancer. Oncogene. 2006; 25(34): 4647–4662. https://doi.org/10.1038/sj.onc.1209607

12. Wallace DC. The mitochondrial genome in human adaptive radiation and disease: on the road to therapeutics and performance enhancement. Gene. 2005 Jul 18; 354: 169–80. https://doi.org/10.1016/j.gene.2005.05.001

13. Wallace DC. Mitochondrial DNA mutations in disease and aging. Environ Mol Mutagen. 2010 Jun; 51(5): 440–50. https://doi.org/10.1002/em.20586

14. Wallace DC. Mitochondria and cancer. Nat Rev Cancer. 2012 Oct; 12(10): 685–698. https://doi.org/10.1038/nrc3365

15. Wernick RI, Estes S, Howe DK, Denver DR. Paths of Heritable Mitochondrial DNA Mutation and Heteroplasmy in Reference and gas 1 Strains of Caenorhabditis elegans. Front Genet. 2016; 7: 51. https://doi.org/10.3389/fgene.2016.00051

16. Gustafsson CM, Falkenberg M, Larsson NG. Maintenance and Expression of Mammalian Mitochondrial DNA. Annu Rev Biochem. 2016 Jun 2; 85: 133–160. https://doi.org/10.1146/annurev-biochem-060815–014402

17. Guerra F, Arbini AA, Moro L. Mitochondria and cancer chemoresistance. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 2017; 1858(8): 686–699. https://doi.org/10.1016/j.bbabio.2017.01.012

18. Ostojić J, Panozzo C, Bourand-Plantefol A, Herbert CJ, Dujardin G, Bonnefoy N. Ribosome recycling defects modify the balance between the synthesis and assembly of specific subunits of the oxidative phosphorylation complexes in yeast mitochondria. Nucleic Acids Res. 2016; 44(12): 5785–5797. https://doi.org/10.1093/nar/gkw490

19. Srinivasan S, Guha M, Kashina A, Avadhani NG. Mitochondrial dysfunction and mitochondrial dynamics-The cancer connection Biochim. Biophys. 2017; 1858(8): 602–614. https://doi.org/10.1016/j.bbabio.2017.01.004

20. Guerra F, Guaragnella, N, Arbini AA, Bucci C, Giannattasiom S, Moro L. Mitochondrial Dysfunction: A Novel Potential Driver of Epithelial-to-Mesenchymal Transition in Cancer. Frontiers in oncology. 2017 Dec 1; 7: 295. https://doi.org/10.3389/fonc.2017.00295

21. Yeung KT, Yang J. Epithelial-mesenchymal transition in tumor metastasis. Mol Oncol. 2017; 11(1): 28–39. https://doi.org/10.1002/1878–0261.12017

22. Shibue T, Weinberg RA. EMT, CSCs, and drug resistance: the mechanistic link and clinical implications. Nat Rev Clin Oncol. 2017; 14(10): 611–629. https://doi.org/10.1038/nrclinonc.2

23. Payen VL, Porporato PE, Baselet B, Sonveaux P. Metabolic changes associated with tumor metastasis, part 1: tumor pH, glycolysis and the pentose phosphate pathway. Cell Mol Life Sci. 2016; 73(7): 1333–1348. https://doi.org/10.1007/s00018–015–2098–5

24. Porporato PE, Payen VL, Baselet B, Sonveaux P. Metabolic changes associated with tumor metastasis, part 2: mitochondria, lipid and amino acid metabolism. Cell Mol Life Sci. 2016; 73(7): 1349–1363. https://doi.org/10.1007/s00018–015–2100–2

25. Sciacovelli M, Goncalves E, Johnson TI, Zecchini VR, da Costa AS, Gaude E, et al. Fumarate is an epigenetic modifier that elicits epithelial-to-mesenchymal transition. Nature. 2016; 537(7621): 544–547. https://doi.org/10.1038/nature19353

26. Girolimetti G, Guerra F, Iommarini L, Kurelac I, Vergara D, Maffia M, et al. Platinum-induced mitochondrial DNA mutations confer lower sensitivity to paclitaxel by impairing tubulin cytoskeletal organization. Hum Mol Genet. 2017; 26(15): 2961–2974. https://doi.org/10.1093/hmg/ddx186

27. Schmidt LS, Linehan WM. Hereditary leiomyomatosis and renal cell carcinoma. Int J Nephrol Renovasc Dis. 2014; 7: 253–260. https://doi.org/10.2147/IJNRD.S42097

28. Sciacovelli M, Frezza C. Oncometabolites: unconventional triggers of oncogenic signalling cascades. Free Radic Biol Med. 2016; 100: 175–181. https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2016.04.025

29. Cairns RA, Mak TW. Oncogenic isocitrate dehydrogenase mutations: mechanisms, models, and clinical opportunities. Cancer Discov. 2013; 3(7): 730–741. https://doi.org/10.1158/2159–8290.CD-13–0083

30. Colvin H, Nishida N, Konno M, Haraguchi N, Takahashi H, Nishimura J, et al. Oncometabolite D 2 hydroxyglurate directly induces epithelial-mesenchymal transition and is associated with distant metastasis in colorectal cancer. Sci Rep. 2016; 6: 36289. https://doi.org/10.1038/srep36289

31. Bardella C, Pollard PJ, Tomlinson I. SDH mutations in cancer. Biochim Biophys Acta. 2011; 1807(11): 1432–1443. https://doi.org/10.1016/j.bbabio.2011.07.003

32. Letouze E, Martinelli C, Loriot C, Burnichon N, Abermil N, Ottolenghi C, et al. SDH mutations establish a hypermethylator phenotype in paraganglioma. Cancer Cell. 2013;23(6):739–752. https://doi.org/10.1016/j.ccr.2013.04.018

33. Loriot C, Domingues M, Berger A, Menara M, Ruel M, Morin A, et al. Deciphering the molecular basis of invasiveness in Sdhb-deficient cells. Oncotarget. 2015; 6(32): 32955–32965. https://doi.org/10.18632/oncotarget.5106

34. Aspuria PP, Lunt SY, Varemo L, Vergnes L, Gozo M, Beach JA, et al. Succinate dehydrogenase inhibition leads to epithelial-mesenchymal transition and reprogrammed carbon metabolism. Cancer Metab. 2014; 2: 21. https://doi.org/10.1186/2049–3002–2–21

35. Wang Z, Guo W, Kuang X, Hou S, Liu H. Nanopreparations for mitochondria targeting drug delivery system: current strategies and future prospective. Asian J Pharm Sci. 2017; 12: 498–508. https://doi.org/10.1016/j.ajps.2017.05.006

36. Gaude E, Frezza C. Tissue-specific and convergent metabolic transformation of cancer correlates with metastatic potential and patient survival. Nat Commun. 2016; 7: 13041. https://doi.org/10.1038/ncomms130

37. Stein A, Sia EA. Mitochondrial DNA repair and damage tolerance. Front Biosci (Landmark Ed). 2017; 22: 920–943. https://doi.org/10.2741/4525

38. Vergara D, Stanca E, Guerra F, Priore P, Gaballo A, Franck J, et al. beta-Catenin knockdown affects mitochondrial biogenesis and lipid metabolism in breast cancer cells. Front Physiol. 2017; 8: 544. https://doi.org/10.3389/fphys.2017.00544

39. Weerts MJ, Sieuwerts AM, Smid M, Look MP, Foekens JA, Sleijfer S, et al. Mitochondrial DNA content in breast cancer: impact on in vitro and in vivo phenotype and patient prognosis. Oncotarget. 2016; 7(20): 29166–29176. https://doi.org/10.18632/oncotarget.8688

40. Eisenberg-Bord M, Schuldiner M. Mitochatting — if only we could be a fly on the cell wall. Biochim Biophys Acta. 2017; 1864(9): 1469–1480. https://doi.org/10.1016/j.bbamcr.2017.04.012

41. Picard M, McManus MJ. Mitochondrial Signaling and Neurodegeneration. In: Reeve A, Simcox E, Duchen M, Turnbull D. (eds) Mitochondrial Dysfunction in Neurodegenerative Disorders. Springer, Cham. 2016; 107–137 p. https://doi.org/10.1007/978–3–319–28637–2_5

42. Quiros PM, Mottis A, Auwerx J. Mitonuclear communication in homeostasis and stress. Nat Rev Mol Cell Biol. 2016; 17(4): 213–226. https://doi.org/10.1038/nrm.2016.23

43. Bustos G, Cruz P, Lovy A, Cárdenas C. Endoplasmic Reticulum-Mitochondria Calcium Communication and the Regulation of Mitochondrial Metabolism in Cancer: A Novel Potential Target.Front Oncol. 2017; 7: 199. https://doi.org/10.3389/fonc.2017.0019

44. Naito A, Cook CC, Mizumachi T, Wang M, Xie CH, Evans TT, et al. Progressive tumor features accompany epithelial-mesenchymal transition induced in mitochondrial DNA-depleted cells. Cancer Sci. 2008; 99(8): 1584–1588. https://doi.org/10.1111/j.1349–7006.2008.00879.x

45. Yi EY, Park SY, Jung SY, Jang WJ, Kim YJ. Mitochondrial dysfunction induces EMT through the TGF-beta/Smad/Snail signaling pathway in Hep3B hepatocellular carcinoma cells. Int J Oncol. 2015; 47(5): 1845–1853. https://doi.org/10.3892/ijo.2015.3154

46. Jiang HL, Sun HF, Gao SP, Li LD, Huang S, Hu X, et al. SSBP1 suppresses TGFbeta-driven epithelial-to-mesenchymal transition and metastasis in triple-negative breast cancer by regulating mitochondrial retrograde signaling. Cancer Res. 2016; 76(4): 952–964. https://doi.org/10.1158/0008–5472.CAN-15–16.

47. Guaragnella N, Giannattasio S, Moro L. Mitochondrial dysfunction in cancer chemoresistance. Biochem Pharmacol. 2014; 92(1): 62–72. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2014.07.027

48. Momekova D, Ugrinova I, Slavkova M, Momekov G, Grancharov G, Gancheva V, et al. Superior proapoptotic activity of curcumin-loaded mixed block copolymer micelles with mitochondrial targeting properties. Biomaterials Science. 2018 Nov 20; 6(12): 3309–3317. https://doi.org/10.1039/C8BM00644J

49. Bi R, Logan I, Yao Y G. Leber Hereditary Optic Neuropathy: A Mitochondrial Disease Unique in Many Ways. Handb Exp Pharmacol. 2017; 240: 309–336. https://doi.org/10.1007/164_2016_1

50. Battogtokh G, Choi YS, Kang DS, Park SJ, Shim MS, Huh KM, et al. Mitochondria-targeting drug conjugates for cytotoxic, anti-oxidizing and sensing purposes: current strategies and future perspectives. Acta Pharm Sin B. 2018 Oct; 8(6): 862–880. https://doi.org/10.1016/j.apsb.2018.05.006

51. D’Aquila P, Bellizzi D, Passarino G. Mitochondria in health, 1aging and diseases: the epigenetic perspective, Biogerontology. 2015; 16(5): 569–585. https://doi.org/10.1007/s10522–015–9562–3

52. Palmfeldt J, Bross P. Proteomics of human mitochondria, Mitochondrion. 2017; 33: 2–14. https://doi.org/10.1016/j.mito.2016.07.006

53. Tyanova S, Albrechtsen R, Kronqvist P, Cox J, Mann M, Geiger T. Proteomic maps of breast cancer subtypes. Nat Commun. 2016 Jan 4; 7: 10259. https://doi.org/10.1038/ncomms10259

54. Monteith GR, Prevarskaya N, Roberts-Thomson SJ. The calcium–cancer signallingnexus.Nat Rev Cancer. 2017; 17(6): 367–380. https://doi.org/10.1038/nrc.2017.18

55. Leanza L, Romio M, Becker KA, Azzolini M, Trentin L, Managò A, et al. Direct Pharmacological Targeting of a Mitochondrial Ion Channel Selectively Kills Tumor Cells In Vivo. Cancer Cell. 2017 10; 31(4): 516–531.e10. https://doi.org/10.1016/j.ccell.2017.03.003

56. Birsoy K, Wang T, Chen WW, Freinkman E, et al. An Essential Role of the Mitochondrial Electron Transport Chain in Cell Proliferation Is to Enable Aspartate Synthesis. Cell. 2015; 162(3): 540–551. https://doi.org/10.1016/j.cell.2015.07.016

57. Wang Z, Guo W, Kuang X, Hou S, Liu H. Nanopreparations for mitochondria targeting drug delivery system: current strategies and future prospective. Asian J Pharm Sci. 2017; 12: 498–508. https://doi.org/10.1016/j.ajps.2017.05.006

58. Kim KY, Jin H, Park J, Jung SH, Lee JH, Park H, et al. Mitochondria-targeting self-assembled nanoparticles derived from triphenylphosphonium-conjugated cyanostilbene enable site-specific imaging and anticancer drug delivery. Nano Res. 2018 Feb 1; 11(2): 1082–1098. https://doi.org/10.1007/s12274–017–1728–7

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Критические шаги в рамках Протокола

Фотообесцвечивания: Предотвращение чрезмерного фотообесцвечивания флуоресцентных образцов является абсолютно необходимым для выполнения эффективной конфокальной микроскопии. Таким образом, время, используемое для обнаружения образцов через окуляр или установить параметры захвата изображений через режиме реального времени сканирования должна быть сведена к минимуму, чтобы минимизировать фотообесцвечивания.

Повреждение тканей: Так как митохондрии считаются датчики клеточного здоровья, крайне важно , чтобы гарантировать , что данные , полученные с помощью описанных методов являются физиологически актуальны и не отражают неоправданный ущерб , вызванный процедурного рассечения яичников дрозофилы. Рассечение должна быть выполнена как можно быстрее, но и с крайней меры предосторожности, чтобы свести к минимуму повреждение тканей. Среднее время для рассечения и дразня 5 Drosophila яичников составляет от 5 до 7 минут (в нашей рукес). Усилия должны быть приняты, чтобы идентифицировать яичные камеры, показывающие поврежденные ткани, которые будут исключены из анализа. Повреждение тканей из — за рассечения может включать в себя неоправданные пробелы (* на рисунке 9А, как это определено в связи с отсутствием сигнала), вмятин / слезы (* на рисунке 9Б, как это определено в связи с отсутствием сигнала), или деформации яйцевых камер (* на рисунке 9С). Тем не менее, любой значимой камеры деформации, возникающие из экспериментальной манипуляции должны быть тщательно оценены. Хотя нет покровное не используется на верхней части живой ткани в протоколе , описанном, уплощение овариол может возникнуть с чрезмерного давления , приложенного к ткани в то время как дразнят или монтажа (* на рисунке 9D). Уплощение овариол не наблюдалось с фиксированными образцами, так как протокол, описанный предполагает фиксацию тканей сразу после диссекции, с дразнящая происходит после этого. Любая изолированная яйцевой камеры без каких-либо подписей aforementioned ущерб может считаться нормальным. Механические повреждения могут возникнуть в результате диссекции может также привести к потере GFP, давая ложные GFP-отрицательных клонов ^16, а также может привести к включению расширенного красителя. Учитывая , что зародышевую клетки находящиеся внутри яйца камер не являются обычно проницаемы для живых митохондриальных красителей (6 и 7), повышенное митохондриальной окрашивание зародышевых клеток дрозофилы может возникнуть в результате увеличения проницаемости поврежденных / омертвевшей ткани; такие артефактом происходит с красителем мито-РОС (** на рисунке 9в и весь яйцевая трубка на рисунке 9d), а также с другими живыми митохондриальных пятен (не показан). Потеря UbiGFP на рисунке 9D (*) может также быть результатом повреждения, вызванного уплощение яйцевых камер. Хотя другие яичные камеры в поврежденном яйцевая трубка может оставаться подлинным и артефакт бесплатно (# на рисунке 9C сильный>), то лучше, чтобы исключить весь яйцевая трубка из анализа. Подобное повреждение может также позволить дополненной доступ антигенов с антителами, во время процедуры иммуноокрашивания, что приводит к значительному увеличению в иммунным окрашиванием поврежденных зон. Поэтому, яичные камеры с расширенной живой или иммунное окрашивание по сравнению с остальной частью населения, должны быть исключены из анализа.

Чувствительность Время: В случае живого экс естественных условиях микроскопии, данные должны быть получены в течение 15 мин монтажа ткани; в противном случае, экспериментальные результаты могут быть затронуты изменениями физиологии в связи с наступившей смертью ткани. Иногда, в зависимости от мощности лазера и других параметров сканирования, в 10 мкл монтажной среды может испаряться раньше, чем через 15 мин. Обнаружение митохондриального пула циклин Е путем совместного иммунным окрашиванием требует минимизации времени рассечение (вероятно из-за переходного характера mitochondриал циклин E бассейн , который поддерживается за счет активного митохондриального дыхания ^12). Заметное митохондриальная циклин Е пул также не наблюдается с временами пермеабилизирующего менее чем за 30 минут.

FLIP: Движение любого яйцевой камеры под экспертизой во время хода FLIP может привести к артефактом анализа и , следовательно , должны быть исключены. Использование любых живых митохондриальных красителей или TMRE не рекомендуется использовать в FLIP эксперименте, так как введение иностранного красителя может изменить митохондриальную непрерывность и тем самым привести к артефактом результатам.

Стратегия перехода Drosophila: Крест обратная той , которая описана здесь (где используются самцы , несущие мутантный аллель drp1) не дает много потомства, вероятно из — за неустановленного воздействия drp1 репрессий в гетерозиготном мужских родителей.

Интерпретация клонального данных: Любые GF-отрицательных клонов , обнаруженные в яичниках контрольныхизолированы от родительского дрозофилы выражения UbiGFP указывало бы артефактом ложноотрицательные клоны, вероятно , генерируемые из — за потери GFP , вызванного повреждением во время вскрытия ^16. Тем не менее, количество GFP-отрицательных клонов в тепловому шоку потомстве креста должна быть значительно выше, чем любые ложноотрицательных клонов видели в контрольной группе. Клоны , генерируемые в слое фолликула клетки Drosophila по описанной митотической стратегии рекомбинации на основе могут возникать из митотических фолликул стволовых клеток (стволовых клеточных клонов) или из митотических нестволовой фолликулярных клеток (переходные клоны). Для получения стволовых клеток клонов, экспериментальные анализы следует проводить только через 10 дней после теплового шока, когда яйцеклетка камеры с переходными клонов уже заложены. Для переходных клонов, анализы следует проводить в течение 6 дней после теплового шока, с фолликула клеточных клонов овариол без какого-либо клона фолликул клеток в гермарии.

Модификации и устранение неисправностей

При оценке потенциала митохондрий на единицу массы с помощью описанного метода, необходимо знать о потенциальных артефактов, возникающих из оптики микроскопа или митохондриальных комбинаций красителей. Любой регион , показывающий ослабленный сигнал от общего митохондриальной пятна и сравнительно повышенной TMRE сигнал (рис 5A, *) может возникнуть из — за флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) между красителями ⁸ или из — за различных оптических свойств красного (TMRE) и зеленый (в целом митохондриальная краситель) флуоресцентные лампы, учитывая фиксированный размер обскура в настройках приобретения. Лада, связанные с артефактом, можно было бы избежать за счет снижения концентраций красителя, если это возможно, в то время как количественный анализ может быть выполнен на проекции 2 — 3 последовательных оптических срезов, чтобы избежать оптических артефакт. Кроме того, если флуоресцентный сигнал обнаружен в перекрестных помех и перекрестного возбужденияканалы, параметры лазера и детектора необходимо отрегулировать, чтобы свести к минимуму сигнала в этих каналах, которые, как ожидается, чтобы уменьшить флуоресцентного сигнала в оптимальных каналов, а также.

Лазер-индуцированное поврежденная от повторяющийся фотообесцвечиванию может привести к митохондриальной фрагментации и, таким образом, вызвать митохондриальную разрыв, предотвращая успешную FLIP. Подозревается фрагментации митохондрий во время выполнения протокола FLIP могут быть идентифицированы путем получения изображений более высокого разрешения с уменьшенным точечным (и повышение коэффициента усиления детектора). Если фрагментация митохондрий заметно заметили во время выполнения протокола FLIP, мощность отбеливающего лазера должна быть уменьшена и / или интервал между последовательными отбеливателей должна быть увеличена. Если есть общее отбеливание во время хода Обратной эксперимента (сигнал от желтого ROI на фигуре 3В и С), лазерное сканирование должно быть повторно доводили до уровнячто позволяет минимальным или какого-либо общего фотообесцвечивание.

Для того, чтобы избежать потенциальной артефакт из-за потери повреждения индуцированного GFP, GFP-положительных клонов может быть введена с использованием стратегии MARCM, следуя описанной теплового шока протокола. Здесь уместно дрозофилы , которые будут использоваться для креста девственница drpKG03815 FRT40A / CYO X мужской Gal80 FRT 40A / CYO; ванна-Gal4, UAS-CD8GFP / ТМ6 ^9. Прямым крылом потомством следует использовать для генерации клонов с использованием теплового шока (как это описано на шаге 6).

Ограничения техники

А) В то время как фолликула клетки , находящиеся на поверхности живых яйцевых камер Drosophila включают митохондриальных окрашивания красители, зародышевой клетки внутри яйцевой камеры не в состоянии сделать это; зародышевую младших стадий испачкать слабо (рисунки 5 и 6). Б) в прямом эфире экс естественных Tissuэлектронной микроскопии должна быть выполнена в течение 15 мин завершения окрашивания на яичниках , выделенных из индивидуального дрозофилы, по одному за раз. Поскольку экспериментальные группы должны быть обработаны и отображены в тот же день, общее время , необходимое для получения статистически значимых данных из живого экс виво микроскопии ткани из различных экспериментальных групп является достаточно больше , чем полученные из фиксированных тканей. C) Мы отметили , что пятно мито-РОС не была очень стабильной в естественных условиях экс Drosophila ткани, вероятно , из — за переходного характера ROS аналита он обнаруживает ^17,15, что может лежать в основе отсутствия обнаружения сигнала от всех drp1 нулевые клоны. Тем не менее, любая биологическая значимость изменчивости в Мито-РОС окрашивания в нулевых клетках drp1 / клоны не могут быть исключены и должны быть предметом дальнейшего расследования. Следует отметить, что положительный сигнал от пятна мито-РОС не может просто отражать повышенную супероксид, но и повышенную митохондриальную или cellulА.Р. окислительный среда ^15.D) в целом митохондриальной пятно не может быть использован для GFP-отрицательных или GFP-положительных клональных экспериментов, так как спектр флуоресценции этого митохондриальной пятна и GFP неразличимы. E) FLIP эксперимент предназначен для анализа непрерывности митохондриях потребует получения изображения с открытым отверстием , которая охватывает разрешение митохондриальных структур.

Значимость техники в отношении существующих / альтернативных методов

Изучение структурно-функциональных отношений митохондриальную имеет решающее значение для полного понимания механизмов регуляции митохондриальной функциональных возможностей. Поскольку митохондриальные дефекты вносят значительный вклад в различных заболеваний, включая диабет, рак, болезнь Паркинсона, детальное понимание митохондриальной образа действий держит обещание facilitatiнг развитие митохондрии направленного терапевтических стратегий. Live-клеточная микроскопия является незаменимым инструментом для изучения структурно-функциональных отношений митохондриальную. Тем не менее, большинство из этих исследований были ограничены изолированных клеток. Изучение митохондриальной структуры и функции были расширены , чтобы жить дрозофилы ткани в установке ⁹ех естественных условиях. Описанный протокол этого и связанных с ними исследований приведет к пониманию митохондриальной структуры и функции в живых яичниках Drosophila, ех естественных условиях, позволяя понимание митохондрий в физиологическом контексте. Этот подход ех естественных условиях имеет значительные преимущества по сравнению с исследованиями в пробирке, так как регулирование метаболических и энергетических свойств митохондрий в данной клетке во многом зависит от наличия питательных веществ и соответствующей сигнализацией в физиологическом контексте клетки.

Генетические манипуляции миtochondrial структура, подавляя митохондриальную белка деления drp1 deregulates клеточного цикла модулятор циклин E и влияет на развитие клеточного слоя фолликула Drosophila ^9,12. Здесь протокол включает в себя описание того , как ввести функционально нулевые клоны drp1 в яичниках дрозофилы для изучения структурно-функциональных отношений митохондриальную. Роман пул митохондриальной циклин Е на клетках млекопитающих, а также у Drosophila фолликул клеточный слой ^12, был успешно обнаружен, что , вероятно , лежит в основе сообщенного регуляцию циклин Е митохондриями ^18. Здесь, рукопись демонстрирует метод обнаружения нового митохондриальную циклин Е пул путем совместного иммуноокрашивания фиксированной Drosophila яичников для dCyclinE и митохондриального маркера (ATP-B).

Будущие приложения или направления после освоения этой техники

Учитывая, тшляпа дрозофилы это мощная генетическая модель системы, наши описанные способы , как ожидается, в значительной мере способствовать пониманию генетической основы структурно-функционального отношения митохондриального в здоровье и болезни. Drosophila широко используется чесать генетических взаимодействий , приводящих к онкогенеза ^19. Возможность генерации клонов в слое эпителиальных фолликул клеток дрозофилы позволяет исследовать взаимодействия митохондрий и онкогенов или супрессоров опухолей в отдельных онкогенных клонов в естественных условиях и бывших естественных условиях установки. Описанные методы могут быть использованы для изучения регуляции митохондриального структурно-функциональных взаимоотношений на яичниках , выделенных из соответствующих мутанта дрозофилы. Описанные методы могут быть дополнительно расширены для изучения прямого воздействия различных питательных веществ и фактора роста сигнализации на митохондриальной структуры и функции через exogтиазом добавление соответствующих питательных веществ и / или факторов роста в естественных условиях среды экс визуализации. Описанные методы могут быть соответствующим образом изменены и использованы в других изолированных тканях Drosophila, как и личиночных имагинальных дисков, которые широко используются для изучения путей сигнальной трансдукции в таких заболеваний , как рак ^20,21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

«Мать всех людей», «митохондриальная Ева» жила около 200 тысяч лет назад

Детальное статистическое исследование показало, что «мать всех людей» жила около 200 тысяч лет назад. Но речь идет не о Еве из Библии, а о «митохондриальной Еве» — так молекулярные биологи называют гипотетическую абстрактную женщину, которая могла бы быть ближайшим предком всех людей вида Homo sapiens.

Ученые Университета Райса (Хьюстон, США) провели наиболее статистически надежное исследование генетических связей с целью определения возраста «митохондриальной Евы». Моделирование дало результат 200 тысяч лет, что в целом совпадает с предыдущими оценками — 140 тысяч лет.

«Митохондриальная» Ева представляет собой научную абстракцию, и ни в коем случае не нужно путать ее с библейской Евой и считать, что все люди на Земле являются потомками одной женщины, которая жила 200 тысяч лет назад. «Митохондриальная Ева» — это модель, позволяющая биологам вычислить эпоху, когда не было никаких генетических мутаций, проследить за тем, как появлялись эти мутации, несущие в том числе и разные заболевания, и, может быть, на основе этих данных найти способ борьбы с такими заболеваниями.

Работа ученых университета Райса основана на параллельном сравнении десяти генетических моделей человека, основанных на представлениях о том, как люди мигрировали и расселялись по Земле. Результаты этого исследования опубликованы в Theoretical Population Biology.

«Наши выводы подчеркивают важность учета случайного характера демографических процессов, — говорит один из авторов работы, профессор статистики Марек Киммел. — Классические детерминированные модели, в том числе и те, которые ранее применялись для определения возраста «митохондриальной Евы», не в полной мере учитывали эти процессы.

А исследование генетической изменчивости в целом очень интересует нас, так как оно имеет большое значение для медицины».

Попытки ученых определить возраст «митохондриальной Евы», основываются на современных генетических методах. Они, в частности, заключаются в сравнении генетических профилей случайных доноров крови, когда на основе сходства и различия отдельных генов ученые количественно могут описать степень связи двух доноров друг с другом. Весь человеческий геном содержит более 20 тысяч генов, и сравнивать различия между генами дальних родственников проблематично даже в наше время, когда существуют мощные суперкомпьютеры. Использование митохондриальных геномов для оценки родства может позволить генетикам облегчить задачу поиска общих предков, которые жили давно.

Митохондрия — это крошечная органелла, имеющаяся во многих эукариотических (ядерных) клетках. Ее функция заключается в синтезе АТФ (аденозинтрифосфата), используемого в клетке в качестве основного источника химической энергии. Митохондрии часто называют «энергетическими заводами» каждой клетки эукариотных организмов, в том числе и у человека. В отличие от ядерной ДНК, которая содержит подавляющее большинство генов и в процессе полового размножения подвергается рекомбинации, так что потомки получают половину генов от отца, а вторую половину от матери, митохондрии и их ДНК ребенок получает только из материнской яйцеклетки. Митохондриальная ДНК не подвергается рекомбинации, изменения в ней могут происходить исключительно посредством редких случайных мутаций. Путём сравнения последовательности митохондриальной ДНК и возникших в ней со временем мутаций можно не только определить степень родства ныне живущих людей, но и приблизительно вычислить время, необходимое для накопления мутаций в той или иной популяции людей.

То есть, проще говоря, для определения возраста «митохондриальной Евы» ученые должны преобразовать степень родства между случайными донорами крови в меру времени.

«Нужно перевести различия между последовательностями генов в то, как они развивались по времени, — заявил один из авторов работы, заместитель директора Института информатики Силезского технического университета в Гливице (Польша). — Как они развивались во времени зависит от модели эволюции, которую вы используете. Например, что такое скорость генетической мутации и что такое равномерная во времени скорость изменения? Учитывается ли процесс генетического дрифта?

Ответы на эти и другие вопросы можно записать в виде коэффициентов, числовых констант, которые фиксируются в уравнении, решение которого и дает ответ — возраст «митохондриальной Евы».

У каждой модели эволюции есть свои собственные предположения, которые имеют количественные последствия, записываемые в математическом виде. Ситуацию усложняет то, что некоторые из таких предположений не подходят для описания человеческой популяции. В частности, некоторые модели предполагают, что численность населения никогда не меняется. Это неверно для популяции людей, в которой прошло несколько тысяч поколений. Другие же модели предполагают равномерное, идеальное «перемешивание» генов, что означало бы возможность двум людям из разных точек мира производить генетически одинаковое потомство.

Кшиштоф Сиран признал, что в последнее время генетические модели человека стали более сложными, так как теоретики пытались скорректировать их недействительными или очень сложными предположениями. Например, добавление процессов, учитывающих динамику прироста населения в начале миграции человека.

«Мы хотели посмотреть, насколько чувствительна модель «митохондриальной Евы» к разным оценкам, и обнаружили, что все модели дали сходную оценку, — говорит профессор Киммел. — И это очень отрадно».

NAD+

Никотинамид-Аденин-Динуклеотид или сокращенно NAD+ — кофермент витамина B3, жизненно важный для каждой клетки человеческого организма.

Эта чудодейственная молекула необходима для синтеза энергии, клеточной регенерации, предотвращения старения, восстановления повреждений ДНК.

NAD+ считается ключевым фактором здорового старения и долголетия.

Области применения NAD+

• болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера
• повышение артериального давления
• сахарный диабет
• сердечно-сосудистые заболевания
• заболевания печени
• иммунные заболевания
• алкогольная и наркотические зависимости
• депрессия и беспокойство
• хронический стресс
• хроническая усталость
• антивозрастные программы
• лишний вес и ожирение
• нарушения сна
• нарушения концентрации, памяти
• снижение энергии и общего тонуса

Как это работает

NAD+ имеет решающее значение для жизни, поскольку непосредственно участвует в функционировании митохондрий и продукции энергии АТФ (митохондрии – мини электростанции нашей клетки, образующей энергию, благодаря которой организм живет).

В клетках NAD существует в двух состояниях NAD+ и NADH — окисленная и восстановленная формы. Оба эти соединения являются звеньями одного процесса выработки энергии, посредством различных реакций переходя из одного в другое. Для жизни важен баланс NAD+ и NADH.

К сожалению, уровень NAD+ снижаются с возрастом и ученые считают, что это снижение может быть напрямую связано со старением.

Уровень NAD+ снижается у всех с возрастом, независимо от вашего личного здоровья, диеты или физической подготовки. NAD+ снижается на 50% в возрасте 40 лет, а к 60 годам до 80%.

NAD+ антивозрастная молекула

Последние научные исследования говорят о том, что NAD+ участвует не только в выработке необходимой для жизни человека энергии, но играет важную роль практически во всех известных на данное время механизмах старения человека.

Так, к примеру, NAD+ является важным прямым кофактором ключевых ферментов, ответственных за долголетие, называемых сиртуинами. Сиртуины, SIRT1—7, тесно связаны с долголетием благодаря контролю за экспрессией генов и требуют NAD+ для своей активности. Активируя сиртуины, мы можем получить контроль над «старением».

SIRT «выключают» гены, способствующие старению, например, участвующие в процессах воспаления, синтезе и хранении жира, а также в регулировании уровня сахара в крови. SIRT восстанавливают и удлиняют теломеры (защитные колпачки на концах ДНК), принимаю участие в регуляции окислительного стресса и т.д.

Простыми словами сиртуины – продлевают жизнь за счет снижения частоты возрастзависимых заболеваний (сахарного диабета, общего воспаления, накоплении жира, регуляции иммунитета), а NAD+ активирует сиртуины.

Есть исследования, которые подтверждают, что NAD+ играет роль и в других механизмах старения: участвует в восстановлении повреждений ДНК, эпигенетической передаче сигналов, синтезе митохондрий, поддержании целостности хромосом и многое другое.

Роль NAD+ в предотвращении хронических нейродегенеративных заболеваний

Существует прямая связь между производством энергии и хроническими заболеваниями. Низкий NAD+ приводит к низким уровням АТФ. Низкий уровень АТФ быстро истощает запасы энергии вашей клетки, что ускоряет гибель клеток.

Как это проявляется в вашем организме, зависит от того, в каких клетках это происходит:

• если затронуты нервные клетки, недостаток энергии может проявляться в виде депрессии, беспокойства, усталости и недостатка концентрации
• длительное воздействие на нервные клетки может приводить к появлению таких симптомов, как тремор, судороги, покалывание, онемение и помутнение зрения. Существует предположение, что тяжелые энергетические нарушения в клетке могут быть причиной нейродегенеративных заболеваний — болезни Паркинсона и рассеянного склероза
• если поражены клетки сердца, это может привести к сердечно-сосудистым заболеваниям. 
• если затронуты легочные клетки, могут проявиться легочные расстройства. 

В целом известно, когда клеткам в ваших органах и тканях не хватает энергии, возникает болезнь.

Роль NAD+ в физических нагрузках, спорте и выносливости

Уровень АТФ истощаются в мышцах во время тренировок это понятный процесс. Однако до недавнего времени мы не знали, как NAD+ вовлечен в этот процесс.

Интенсивные физические упражнения уменьшают NAD+, а добавление веществ стимулирующих образование NAD+ усиливает выносливость, укорачивает восстановительный период, повышает работоспособность.

Роль NAD+ в зависимости

НАД+ c 1967 года используется в лечении наркотической и алкогольной зависимости. Несмотря на до конца не полное понимание механизмов терапии, результаты являются впечатляющими: пациенты сообщают о снижении симптомов отмены, общем избавлении от зависимости в течение 7-14 дней терапии.

Возможно один из механизмов формирования зависимости заключается в роли NAD+ в метаболизме алкоголя.

В США, Великобритании и других странах лечением зависимости с помощью NAD+ занимается ряд успешных клиник, среди них Springfield Wellness Clinic в США, NAD+ Clinic в ЮАР, Великобритании и США, Koniver Wellness США и многие другие.

МНЕНИЕ СПЕЦИАЛИСТОВ

Чистюхин Игорь

Семейный врач «TCA-clinic»

Можно сказать, что чем меньше NAD+ в нашем организме, тем больше мы поддаемся болезням, усталости, старению, расстройствам головного мозга, недостатку энергии, потере жизненных сил. Реальность такова, что энергия=производительность, поэтому NAD+ необходим, если Вы хотите преуспеть в работе, жизни, спорте.

Для кого

Положительные действия NAD+

• повышает способность организма восстанавливаться после стресса и напряжения
• повышает работоспособность во время физических упражнений, усиливает выносливость
• помогает противостоять последствиям неправильного питания и малоподвижного образа жизни
• замедляет повреждение ДНК, защищает теломеры
• повышает энергию
• улучшает когнитивные функции (память, мышление, понимание, обучение)
• поддерживает здоровье сердечно-сосудистой системы, печени и других внутренних органов
• убирает эпизоды депрессии
• улучшает состояние кожи

СТОИМОСТЬ NAD+

Зависит от выбранной программы NAD+ терапии: IV или внутривенные капельницы c NAD, NAD-бустеры или биологически активная добавка NAD+

Узнать о том, какая программа NAD+ терапии подходит именно вам, ее особенности и стоимость, можно на консультации врача «TCA-clinic».

Запишитесь на консультацию, получите ответы, как оставаться здоровыми, привлекательными и полными сил независимо от возраста.

Митохондрии в клетках организма: раб или большой начальник?

В Главном здании МГУ имени М.В. Ломоносова состоялась лекция доктора биологических наук, профессора Дмитрия Борисовича Зорова «Митохондрии и болезни».

Митохондрия – это органоиды в клетках, являющиеся источником энергии для этих клеток. Они считаются частью клетки и отвечают за превращение органических веществ из пищи в энергию для тела.

«Самое важное значение этой органеллы состоит в том, что она вырабатывает аденозинтрифосфат (АТФ). Проще говоря, является «электростанцией» в нашем организме, без нее клетки не могут полноценно функционировать – постепенно «старятся» и погибают», – комментирует лектор.

В 1926 году Айвен Уоллин предположил, что митохондрии когда-то были самостоятельно живущими бактериями, а в процессе эволюции стали частью нашего организма. Даже находясь внутри человеческой клетки, митохондрия продолжает оставаться самостоятельной: у нее есть своя «кухня» по синтезу белка, включая и собственные молекулы ДНК и РНК.

Сегодня снова перед научным миром встает вопрос, что представляет собой митохондрия?

«Известно, что у митохондрии 1 500 собственных белков, и каждый из них имеет определенную функцию. Так, только часть белков отвечает за энергообразование, у другой же части белков – иные задачи. Революция произошла в 1996 году, когда митохондрии приписали новую роль – участие в клеточной гибели», – объясняет Зоров.

Существует 14 разных видов гибели клеток. В этот момент митохондрия «выпускает» из себя разные сигнальные вещества, которые можно рассматривать, как инициаторов окончательного процесса гибели клеток. Казалось бы, эта «убийственная» функция нежелательна, не нужна организму, однако, это не так. Ведь клетки в организме человека – разные, некоторых из них делятся. Если отменить деление клеток – организму будет «плохо», если же запретить уничтожение клеток – в организме могут начать развиваться фатальные процессы. Например, возникновение раковой опухоли.

При нарушении работы этих незаметных нам «энергоблоков» начинаются проблемы с энергообменом в клетке. При легких формах нарушения человек не выдерживает простых физических нагрузок, которые он способен переносить, исходя из своего возраста. Более серьезные нарушения провоцируют необратимые изменения в энергообмене, и как следствие, сильные нарушения в работе клеток.

«Для митохондрий не присуще рекомбинирование генов, но при этом скорость мутации значительно выше. Во время деления митохондрии распределение генов между новыми клетками имеет совершенно случайный характер. Вероятность возникновения мутации от 1 до 99%. Причем спрогнозировать ее нет никакой возможности.  И чем больше больных генов, тем больше вероятность нарушения», – говорит Дмитрий Борисович.

Может ли человек сам влиять на работу митохондрий для предотвращения «коллапсов»?

«На самом деле, мы можем достаточно легко увеличить количество митохондрий в нашем организме и даже улучшить качество их работы. К слову, сделать это помогают фитнес-тренировки. Митохондрии не могут эффективно работать без кислорода. Именно физические нагрузки способствуют увеличению количества митохондрий и изменению их формы», – поясняет Зоров.

А что происходит в старости?

Когда основная масса митохондрий будет повреждена свободными радикалами или их количество резко сократится, то они не смогут производить достаточное количество энергии для поддержания жизни – наступает старение мышечных волокон человека. Это отражается на внутренних органах, которые начинают чахнуть.

«Однако если митохондриям дать возможность эффективно генерировать энергию, занимаясь физическими нагрузками аэробного характера, поддерживая низкокалорийную диету, то старение организма происходит не так стремительно», – подытоживает ученый.

Пируват и лактат.Маркеры дисфункции митохондрий

Дисфункция митохондрий может вызывать нейродегенеративные и нейрометаболической заболевания у людей. При митохондриальной болезни распространенный лактатный ацидоз, который происходит вследствие нарушения обмена кислорода с повышенным потреблением пирувата в цикле Кребса.
Митохондриальная дисфункция может быть выявлена ​​путем определения пирувата и лактата в NaF плазме и моче, а также путем определения соотношения лактат / пируват.
Пируват
Пируват, соль пировиноградной кислоты, является основным продуктом гликолиза, а также может образовываться в результате расщепления аминокислот глицина, аланина, серина и цистеина.
Пируват действует как важный переключатель в обмене веществ:
■ С помощью пируватдегидрогеназы пируват окисляется до ацетил-КоА, который в дальнейшем метаболизируется в цикле Кребса (цикл лимонной кислоты) для получения энергии. Этот процесс зависит от доступности кофакторов витамина В1, В2, В3, В5 и альфа-липоевая кислота. Этот процесс необратим, то есть ацетил-КоА не может быть преобразован обратно в пируват и глюкозу.
■ Если не хватает углеводов, организм производит глюкозу с помощью глюконеогенеза. Пируват превращается в оксалоацетат через пируватдекарбоксилазы, исходную точку для глюконеогенеза.
■ Ацетил-КоА, образованный из пирувата, играет центральную роль в жировом обмене: с одной стороны, он является продуктом распада жирных кислот, а с другой стороны- снова доступен как исходное вещество для синтеза жирных кислот и стероидов.
■ Также существует связь с метаболизмом аминокислот: пируват превращается путем трансаминирования в аланин.
Пониженное содержание пирувата в крови основном связан с нарушениями углеводного обмена. Повышенное содержание пирувата обусловлен прежде всего функциональным ограничением пируватдегидрогеназы в результате недостатка витаминов группы В и альфа-липоевая кислота. Дефицит ниацина (витамина В3) также имеет далеко идущие последствия для всего метаболизма, поскольку он имеет центральное значение как важный компонент коэнзима NAD.
При сильных физических нагрузках гликолиз для дополнительного выработки энергии увеличивается в разы. Это приводит к усиленному синтезу пирувата, который, однако, не может быть полностью переработан в цикле лимонной кислоты. Избыток пирувата превращается в лактат.
Повышенный уровень также может быть вызван приемом пирувата.

Терапия избытка пирувата

Замещение витаминов B1, B2, B3, B5 и альфа-липоевой кислоты

Лактат
Лактат — это название соли молочной кислоты. Он образуется за счет восстановления пирувата. Лактат является конечным продуктом анаэробного метаболизма. Накопление лактата является результатом сильного мышечного нагрузки или болезней, связанных с уменьшением поступления кислорода. В основном это инфекции, нарушения кровообращения, нарушения обмена веществ (особенно сахарный диабет) и стрессовые ситуации (оксидативный стресс и нитро-стресс). Если источники энергии исчерпаны, мобилизуются энергетические запасы углеводов. Повышенный распад глюкозы приводит к усиленному образованию пирувата. Избыток пирувата, также в результате пониженного давления кислорода в основном восстанавливается до лактата.
Наряду с лактатом производятся ионы Н +. Это приводит к смещению рН в кислотный диапазон, что приводит к значительным нарушениям обмена веществ, в частности ограничения активности ферментов.
Полученный в результате лактатный ацидоз приводит в действие замкнутый круг: нарушена пируватдегидрогеназа блокирует образование ацетил-КоА из пирувата, который обычно метаболизируется в цикле лимонной кислоты. Это создает эквиваленты восстановления NADH и FADh3, которые используются в дыхательной цепи для выработки АТФ.
Однако, если ацетил-КоА больше не доступен в достаточном количестве, в качестве отправной точки для цикла лимонной кислоты, это приводит к уменьшению поступления окислительно-восстановительных веществ NADH и FADh3. Следствием этого является резкое сокращение производства энергии и нарушение функции митохондрий.Сниженный запас энергии в основном влияет на клетки с высокой энергетической потребности, такие как нервные клетки, мышцы, сердечные мышцы и клетки иммунной системы.
Недостаток энергии характеризуется, в частности, пониженной концентрацией карнитина и кофермента Q10, важного электронного носителя в митохондриальной дыхательной цепи.
Повышенный уровень лактата также может быть вызван такими медикаментами, как статины, метформин или изониазид.

Терапия избытка лактата

Замещение кофермента Q10, карнитина, альфа-липоевая кислота, биотина и витаминов B1, B2, B3, B5

Лабораторная диагностика
Соотношение концентраций лактата и пирувата в плазме NaF является общим параметром измерения аэробных или анаэробных метаболических процессов.
■ При физиологических условиях возникает соотношение лактат / пируват 10: 1.
■ Повышение соотношения лактат / пируват является показателем недостаточного энергоснабжения клеток. Это показывает доминирование анаэробных обменных процессов.
Определение соотношения лактат / пируват особенно показано при следующих симптомах и функциональных расстройствах:

• хроническая усталость, истощение, сильное падение работоспособности
• трудности с концентрацией внимания
• головная боль, мигрень
• депрессия
• неврологические расстройства
• мышечная атрофия
• дыхательная недостаточность
• сердечно-сосудистые заболевания
• нарушение кровообращения
• нарушения обмена веществ
• хронические инфекции

Наряду с обычными методами исследования лактата и пирувата с NaF-плазмы, также возможно исследовать оба субстраты в моче с помощью высокочувствительного и селективного метода LC-MS / MS. Определение лактата и пирувата в моче имеет несколько преимуществ:
■ Поскольку лактат и пируват в NaF плазме подвергаются постоянным, быстрых изменений через физическое перенапряжение, стресс и текущее потребление пищи, это определение показывает фактическое состояние на момент взятия крови.
■ Измерения в моче, наоборот, дает представление о метаболической ситуацию даже за несколько часов до отбора пробы. Таким образом, результаты позволяют делать выводы относительно общего состояния пациента.
■ Преобразование пирувата в лактат также происходит в отобранной NaF крови. Итак, следует строго соблюдать преаналитикы, иначе можно ожидать неправильно низких значений пирувата. С другой стороны, определение лактата и пирувата в моче характеризуется высокой стабильностью проб.

Объемная доля митохондрий и продолжительность трансляции влияют на локализацию митохондриальной мРНК и синтез белка

Редакции для этого документа:

Ниже приведены основные комментарии, которые, вероятно, потребуют дополнительных экспериментальных данных для удовлетворительного рассмотрения:

1) Необходимы новые эксперименты для измерения уровней комплекса TOM или других соответствующих комплексов (OM14 или SAM-Mdm10), чтобы увидеть, повышаются ли они при соотв. условия роста, которые, если так, могут быть важным фактором помимо мито.объем как таковой в увеличении локализации мито. мРНК.

Во-первых, мы хотим подчеркнуть, что объемная доля митохондрий, а не объем митохондрий важна для локализации мРНК с точки зрения пространственного ограничения / клеточных ограничений, как показано для локализации мРНК TOM22 и результатов моделирования (Рисунок 2B, 2D, Рисунок 2 — рисунок приложение 2). Из нашего моделирования мы можем резюмировать общие тенденции в наших экспериментальных данных, используя мРНК с постоянным сродством в разных условиях и просто регулируя пространственные ограничения от увеличения доли объема митохондрий.Хотя наше моделирование не полностью воспроизводит наши экспериментальные данные, и это можно частично объяснить изменениями в соответствующих рецепторах, мы думаем, что полностью охарактеризовать все аспекты локализации мРНК в этой единственной рукописи выходит за рамки данной статьи. Чтобы затронуть эту проблему, мы исследовали, как предполагалось, экспрессию комплекса TOM и других соответствующих комплексов (OM14 или SAM-Mdm10) в ферментативных условиях по сравнению с респираторными, используя данные Morgenstern et al., 2017. Этот набор данных показывает 3,5-кратное увеличение ATP3 и отсутствие изменений для TIM50 , когда они сравнивают уровни экспрессии белка в глюкозе и глицерине, которые очень похожи на наши результаты (рис. 1D, E). В своих экспериментах они показали, что экспрессия белка изменяется следующим образом.

Экспрессия белка TOM и большинства других комплексов существенно не изменилась в глюкозе и глицерине, за исключением OM14 и OM45. Поскольку у нас есть возмущения, которые изменяют объемную долю митохондрий и локализацию ATP3 и независимо от питательных веществ, мы стремились изучить, изменяются ли OM14 и OM45 при этих возмущениях.Мы смогли резюмировать большие изменения уровней РНК OM14 и OM45 с помощью RT-qPCR в респираторных условиях, но мы видим небольшое снижение OM14 и отсутствие значительных изменений в OM45 у штаммов sch9 ∆ и reg1 ∆, где мы наблюдают значительное увеличение объемной доли митохондрий и локализацию мРНК ATP3 . Это не означает, что OM14 и OM45 не играют никакой роли в локализации при респираторных заболеваниях, но что объемная доля митохондрий является ключевым фактором, влияющим на локализацию мРНК.Мы полагаем, что дальнейшее изучение этой взаимосвязи выходит за рамки данной рукописи.

Мы добавили следующее в раздел результатов:

«Альтернативная возможность состоит в том, что экспрессия механизма импорта или рецептора NAC коррелирует с объемной долей митохондрий и что это то, что важно для изменений в локализации мРНК ATP3 . […] Хотя мы можем резюмировать значительное увеличение экспрессии OM14 и OM45 в респираторных условиях, мы не обнаружили значительного увеличения экспрессии этих РНК в мутантах reg1∆ и sch9∆ . штаммов (рисунок 2 — приложение 5 к рисунку).”

И к разделу «Обсуждение»: «Хотя мы считаем, что геометрические ограничения клетки важны для локализации мРНК, мы не можем полностью исключить возможность того, что существуют вторичные факторы, такие как концентрации рецепторов, которые также вносят вклад в локализацию мРНК, но как мы это делаем не обнаружив, что они коррелируют с локализацией мРНК во всех наших разнообразных пертурбациях, мы не считаем, что концентрации рецепторов являются основными факторами наблюдаемых нами изменений локализации мРНК.”

2) Представьте дополнительные данные визуализации (видео), чтобы убедить нас в том, что одни и те же мРНК исследуются в разных z-стеках.

Мы включили видеоролики для мРНК TIM50 , ATP3 и TOM22 в ферментативных условиях в качестве видео 2. Мы также добавили видеоролики для мРНК TIM50 и TOM22 с добавлением циклогексимида и 1,10-фенантролина для рисунка 1 —Рисунок в приложении 2 как на видео 1.

3) Предоставить доказательства увеличения инициации трансляции, помимо демонстрации увеличения локализации мРНК, в ответ на манипуляции, которые увеличивают объемную долю митохондрий.

Мы показываем, что мРНК, которые чувствительны к скорости удлинения при их локализации в митохондриях, имеют небольшое (~ 15%), но значительное увеличение эффективности трансляции при переключении на респираторные условия, когда обнаруживается, что эти мРНК локализуются в митохондриях (рис. — приложение к рисунку 2А). Для конкретных мРНК ( ATP2 и ATP3 ), которые, как мы прямо показали, имеют повышенную локализацию мРНК в респираторных условиях по сравнению с ферментативными, мы видим увеличение эффективности трансляции на 32% и 42% соответственно во время респираторных состояний (исходные данные 1).

В целом мы изменили формулировку об увеличении инициации трансляции и вместо этого сосредоточились на увеличении синтеза белка, который сопровождает локализацию мРНК в митохондриях, поскольку мы чувствуем, что как стабильность мРНК, так и изменения эффективности трансляции важны для точной настройки экспрессия гена, обусловленная локализацией мРНК.

4) Покажите, что удаление MTS вместо замены его последовательностью, нацеленной на ER, нарушает мито. локализация.

Из-за Covid у нас не было доступа к оригинальным микроскопам, поэтому вместо этого мы использовали другой микроскоп и визуализировали мРНК с 4-секундным интервалом. Клетки получали изображение при 23 ℃ с помощью вращающегося диска Eclipse Ti2-E, конфокального с Yokogawa CSU-X1 (Yokogawa) с отверстиями 50 мкм, расположенного в Центре визуализации Nikon UCSD. Визуализацию выполняли с использованием масляного объектива SR HP APO TIRF 100x 1.49 NA с корректирующей манжетой, устанавливаемой вручную для каждого эксперимента (размер пикселя 0,074 мкм). Z-стеки (шаги 300 нм) были получены камерой Prime 95B sCMOS (Photometrics).Визуализацию контролировали с помощью программного обеспечения NIS-Elements. Мы добавили это как рисунок 3 — дополнение к рисунку 1.

5) Добавьте анализ контрольных конструкций, чтобы подтвердить, что последовательность, кодирующая полипролин, увеличивает мито. локализация благодаря удлинению трансляции через кодоны полипролина, а не ингибирующему эффекту последовательностей РНК как таковых, включая замены синономных кодонов, кодирующих PolyPro, или вставку одной пары оснований, чтобы вывести polyPro тракт за пределы рамки.

Наши данные по лактимидомицину (рис. 3A) показывают, что инициация трансляции является ключевой для локализации мРНК TIM50 в митохондриях, и что после лечения лактимидомицином TIM50 и ATP3 имеют неотличимые фенотипы локализации, даже если мРНК TIM50 содержат мРНК

. 7 последовательных полипролинов и ATP3 нет, аргументируя это тем, что роль последовательности РНК, непосредственно играющей роль в дифференциальной локализации между TIM50 и ATP3 , отсутствует.

6) Обеспечить более полный анализ локализации / трансляции мРНК как в ферментативном, так и в соотв. условия.

Мы добавили недавно проанализированные данные о доле ассоциации для химерных репортеров и репортерных генов TIM50 -P7∆ в респираторных условиях. Эти данные представлены в виде рисунка 3, дополнения к рисунку 2 и рисунка 4D.

Кроме того, документ должен быть отредактирован, возможно, включая заголовок, чтобы признать, что настоящие доказательства неадекватны, чтобы сделать вывод о том, что объем митохондрий является основным фактором локализации митобелка, и отметить, что другие внутренние особенности транслированных ORF (e .грамм. MTS, использование кодонов, длина ORF), изменения в трансляции и уровне составляющих, участвующих в привязке в респираторных условиях, а также изменения в клеточной архитектуре (например, размер органелл) могут быть не менее или более важными. Документ также следует отредактировать, чтобы учесть как можно больше других важных комментариев, не затронутых выше

.

Мы изменили название, чтобы отразить более инклюзивный язык продолжительности перевода, поскольку мы согласны с тем, что другие факторы, влияющие на продолжительность перевода, могут повлиять на локализацию.Мы добавили следующий абзац в Обсуждение «Хотя мы показываем, что один из способов увеличения продолжительности трансляции — это остановка удлинения трансляции, вызванная последовательностями полипролина, другие механизмы, которые увеличивают продолжительность трансляции, включая увеличение длины ORF, редких кодонов и структур мРНК (Schuller and Green, 2018) обладают аналогичным потенциалом влияния на локализацию мРНК ».

Рецензент № 1:

[…]

Был также ряд случаев, когда они не изучали эффекты манипулирования TIM50 или ATP3 в условиях респ в дополнение к условиям фермента (или, по крайней мере, я не мог сказать, были ли исследованы оба условия), из-за чего неясно, была ли пауза в элонгации необходим для эффективной локализации только при росте ферментов, когда объем мито-клеток относительно невелик,

— Коэффициент ассоциации — плохой идентификатор измерений, например, на рисунке 1B, как отношение того, что не определено.Если он связан с митохондриями и общей мРНК, лучше использовать термин «пропорция». Кроме того, язык условных обозначений к рисункам иногда может быть неверно истолкован, чтобы указать на соотношение связи между ферментативным и респираторным ростом; и поэтому требуется большая точность во всех рисунках, где используется этот термин.

Спасибо за пояснение. Мы изменили ось Y на рисунках 1-5 и рисунках дополнений на «долю ассоциированной РНК». Мы также редактировали их рисунки-легенды.

— Как отмечалось выше, авт. Не удалось показать, что MTS TIM50 действительно необходим для локализации мито, только то, что его замена на ER-направленный сигнал снижает ассоциацию мито. Им нужно исключить МТС вместо замены, чтобы убедительно доказать свою точку зрения.

Как обсуждалось в большом дополнительном эксперименте 4 выше.

— Рис. 3D: В легенде утверждается, что были исследованы как условия ферма, так и условия респ, но из текста видно, что эти данные представлены только в условиях фермента, если только «соотношение» ассоциации не означает нечто иное, чем указано выше.В любом случае данные для обоих условий должны быть предоставлены.

Как обсуждалось в большом дополнительном эксперименте 6 выше.

— Рис. 4C-E: здесь существует та же сложность, что и для Рис. 3D, из-за нечетких обозначений и расплывчатых описаний в легендах. Необходимы результаты как для ферментативных, так и для респираторных условий, чтобы определить, ограничиваются ли эффекты полипролина на локализацию только ферми-условиями при низком объеме мито.

Как обсуждалось в большом дополнительном эксперименте 6 выше.

— Эксперименты с удлинением полипролина нуждаются в контроле изменений синонимичных кодонов по сравнению с удалением для TIM50; и вставка кодонов Pro вне рамки для ATP3, чтобы отличить эффекты последовательности мРНК от задержки элонгации на локализацию.

Как обсуждалось в большом дополнительном эксперименте 5 выше.

— В экспериментах по привязке на фиг. 6 хотелось бы знать, меньше ли влияние на привязку ATP3 в соотв. По сравнению с фермическими условиями; и неясно, какое именно состояние было проанализировано.Им также необходимо добавить контроль измерения экспрессии нативного ATP3 и TIM50 в штамме с Tom70-MCP, поскольку их экспрессия не должна изменяться.

Как написано в легенде, мы показали уровень экспрессии белка в респираторных условиях, чтобы увидеть, приводит ли измененная экспрессия белка к медленному росту в респираторных условиях. Для TIM50 и ATP3 мы наблюдали сходные различия в экспрессии белка в ферментативных / вегетативных условиях, в то время как для ATP2 эффект был меньше в ферментативных условиях.Поскольку мы были сосредоточены на респираторных условиях, при которых мы видим эффект медленного роста, мы включили только влияние привязки на производство белка в этих условиях.

Привязка к плазматической мембране снижает выработку белка в вегетативных и ферментативных условиях.

— Непонятно, почему связывание PM снижает трансляцию мРНК, которые обычно являются мито-локализованными, но не нелокализованными мРНК, поскольку результаты с мРНК TOM22 и GFP со вставками MS2 ясно показывают, что рядом с PM имеется большое количество рибосом для трансляции эти мРНК и все мРНК, нацеленные на мито, демонстрируют повышенную трансляцию.Предположительно, есть и другие неизвестные факторы, позволяющие лучше транслировать TIM50 и ATP3, когда они привязаны к митохондриям, по сравнению с PM, но авторы не рассматривают эту проблему и должны ее прокомментировать.

Мы считаем, что это не специфическая проблема TIM50 или ATP3 , и что любая мРНК, локализованная на митохондриальной поверхности, имеет повышенный синтез белка, как это видно для цитозольного белка Flag-GFP на рисунке 6B, C. дело не в том, что плазматическая мембрана специфически ограничивает синтез белка мито-мРНК, локализованных там, но в том, что мРНК, оторванные от митохондрий, не получают положительных эффектов локализации в митохондриях и связанного с этим повышенного синтеза белка.Точно так же, когда мы уменьшаем локализацию мРНК в митохондриях, удаляя пролины в TIM50 , мы видим снижение синтеза белка не потому, что он локализован на плазматической мембране, а потому, что он не локализован на поверхности митохондрий.

Мы вставили следующее утверждение в Обсуждение.

«Каким образом локализованные в митохондриях мРНК могут увеличивать синтез белка, все еще остается открытым вопросом. […] Определение того, как локализация мРНК увеличивает синтез белка, расширит наше понимание того, как митохондрии могут контролировать свой состав в зависимости от метаболических потребностей клетки.”

«Наконец, они должны показать, что тракт PolyPro не будет работать, если он расположен слишком близко к MTS, поскольку пауза удлинения должна быть задействована только после того, как вся MTS выйдет из выходного туннеля рибосомы».

Мы согласны с этим предположением, что MTS необходимо экспонировать из рибосомы для связывания с митохондриями. Мы вставили полипролиновый тракт в 100 а.о. от MTS и по-прежнему наблюдали повышенную локализацию мРНК. Размер туннеля рибосомы, как правило, считается длиной 30 атм. но не всегда точно определяется.

Рецензент № 2:

События контроля экспрессии генов, выделенные в этой работе, интересны и говорят о тонко настроенной природе клетки, чтобы реагировать на клеточные изменения и изменения окружающей среды. Данные высокого качества и хорошо представлены. Я также считаю, что эти данные заставляют задуматься, но я не уверен, что локализация мРНК напрямую связана с объемной долей митохондрий по сравнению с взаимодействиями связывания, обусловленными зарождающейся цепью, и различиями в трансляции между метаболическими программами.В целом, я поддерживаю публикацию, если вопросы, поднятые ниже, могут быть адекватно рассмотрены.

1) Как изменяется состав митохондрий при росте органелл? Не рассматривается, как комплекс TOM или другие соответствующие комплексы (OM14 или SAM-Mdm10) изменяются в зависимости от объема митохондрий или дыхательной активности. Например, если плотность этих комплексов сохраняется по мере роста мембраны или даже увеличивается с дыханием, это будет означать увеличение общего количества сайтов связывания на поверхности митохондрий.Поскольку импорт белков MTS и встраивание Tom22 включает в себя один или несколько из этих комплексов, это могут быть изменения в количестве рецепторов, которые управляют ассоциацией мРНК через растущую полипептидную цепь, а не в объеме как таковом.

Это справедливый момент, и мы оценили изменение рецепторов. См. Основной дополнительный эксперимент 1 выше.

2) Является ли длина ORF драйвером локализации митохондрий? Из изученных мРНК кодируемые белки имеют длину 476 (TIM50), 311 (ATP3) и 152 (TOM22) остатков.Тем не менее, авторы не обращают внимания на корреляцию длины с процентом локализованной мРНК. Этот вопрос усугубляется наблюдением, что среди субъединиц комплекса АТФ самая короткая ORF (ATP16, 160 остатков) — это та, на которую не влияет CHX. Williams et al. 2014 отметил, что существует корреляция между длиной ORF и локализацией, при этом большинство возникающих цепей, наблюдаемых в митохондриях, имеют длину> 180 остатков. Потенциально информативный эксперимент для решения этой проблемы будет включать анализ локализации мРНК и уровней экспрессии белка в репортерах TIM50 / ATP3 / TOM22-GPF в ответ на ферментативный vs.респираторные условия роста.

Мы согласны с мнением авторов обзора, что длина мРНК также потенциально будет влиять на локализацию на митохондриальной поверхности, и мы изменили название на «продолжительность трансляции», чтобы лучше охватить этот момент. Тем не менее, мы также обнаружили, что длина — не единственный фактор, поскольку мы можем удалить 7 полипролинов из TIM50 (уменьшение длины <2%) и увидеть большое снижение локализации, в то время как вставка этих коротких остатков в ATP3 увеличивает локализацию. .Мы также считаем, что использование флуоресцентной микроскопии для исследования влияния длины искажает результаты.

Мы протестировали TIM50-iRFP , ATP3-iRFP , вставив iRFP в С-конец этих генов. См. Основной дополнительный эксперимент 6 выше. Мы видим различия в соотношении митохондриальных ассоциаций с / без iRFP . Мы наблюдали соотношение ассоциации как 0,52 в ферментативных и 0,7 в респираторных условиях для мРНК TIM50 и отношение ассоциации как 0.15 в ферментативном и 0,5 в респираторном состоянии для мРНК ATP3 . Когда мы вставляем iRFP , мы наблюдали увеличение отношения ассоциации для ATP3-iRFP (0,27 в ферментативном и 0,6 в респираторном состоянии), но мы видим небольшое уменьшение отношения ассоциации для TIM50-iRFP (0,37 в ферментативном и 0,64 в респираторном состоянии) по сравнению с более коротким TIM50 . Дополнительная длина iRFP 948nt, которая может составлять не менее 10-20 нм in vivo (Adivarahan et al., 2018) может повлиять на нашу количественную оценку локализации из-за порога, который мы установили для локализованной мРНК.

3) Авторы выполняют визуализацию мРНК во временном ряду и определяют мРНК как локализованную, если она находится в пределах определенного расстояния от митохондрий в двух последовательных кадрах визуализации с интервалом ~ 3 секунды. Митохондрии могут перемещаться, мРНК может высвобождаться и повторно связываться между z-стеками, или разные мРНК могут связывать сайты, физически близкие друг к другу в разное время. Таким образом, откуда авторы знают, что они подсчитывают одну и ту же мРНК в последовательных z-стеках? Это следует обсудить и предоставить примеры изображений / видео, чтобы подробно описать, как решается эта проблема.Предполагая, что между временными точками не так много изменений, авторы должны быть в состоянии предоставить продолжительность связывания для каждой мРНК. Я ожидал бы, что такая информация о времени пребывания будет ценной с точки зрения данных моделирования на рисунке 2 и может быть использована для поддержки или, возможно, исключения моделей, объясняющих, как / почему различные мРНК локализуются на поверхности митохондрий (например, ко-трансляционный импорт, взаимодействие с рибосомы, ассоциированные с митохондриями, или временные взаимодействия с трансляционными / РНК-связывающими белками, необходимыми для трансляции).

Одновременная визуализация мРНК одной молекулы и митохондрий в 3D была технически сложной задачей. Сигналы MS2-GFP от мРНК быстро обесцвечиваются, и мы можем визуализировать их в течение 30 секунд, что не позволяет нам анализировать продолжительность связывания. Как описано в разделе «Материалы и методы», мы отслеживали мРНК вручную и проверяли, соответствуют ли эти треки поиску ближайшего соседа. Мы не можем исключить возможность того, что мы ошибочно отслеживаем одну и ту же одиночную молекулу мРНК в последовательные моменты времени.Как мы добавили в большом дополнительном эксперименте 2 выше, вы можете легко отслеживать единственную мРНК, которая связана с митохондриями, глазами, но для свободно распространяющихся мРНК мы полагаемся на обоснование поиском ближайшего соседа. Мы сосредоточились на анализе соотношения митохондриально-связанной мРНК, которая связывается с митохондриями в течение двух последовательных временных точек, что, по нашему мнению, гораздо более уверенно, если это одни и те же мРНК.

Рецензент № 3:

В этой рукописи Tsuboi et al. исследовали локализацию мРНК ядерно-кодируемых митохондриальных белков в дрожжах в условиях ферментативного и респираторного роста.Они использовали визуализацию одиночной мРНК с системой MS2 в живых клетках с флуоресцентно мечеными митохондриями. Авторы заметили три типа поведения: конститутивно (TIM50), частично (ATP3) и не локализованное (TOM22). Они обнаружили, что локализация АТФ3 в митохондриях увеличивается, когда дрожжи меняют ферментативное состояние на респираторное, в то время как TIM50 и TOM22 имеют меньше изменений. Локализация мРНК коррелировала с объемной долей митохондрий. Локализация зависит от нижестоящей кодирующей последовательности MTS, и авторы утверждают, что локализация увеличивает инициацию трансляции.Путем подавления мутаций и трансляции авторы обнаружили, что уменьшение удлинения трансляции локализует мРНК в митохондриях. Наконец, сравнивая неправильно локализованные РНК, авторы обнаружили снижение продукции белка и некоторые дефекты роста. Авторы предложили модель, согласно которой локализация митохондриальной РНК увеличивает трансляцию белка.

Здесь авторы использовали подход одиночных молекул для прямого измерения расстояния между мРНК и митохондриями, что технически впечатляет и приятно.В целом рецензент считает, что данные в основном согласуются с предыдущими данными о локализации РНК по всему транскриптому и предложенной там моделью: трансляция определяет локализацию РНК в митохондриях, степень локализации и чувствительность CHX зависят от относительного положения MTS и нижестоящие последовательности в мРНК. Однако я думаю, что данные и предложенная модель имеют некоторые пробелы, что требует уточнения претензии или дальнейшего экспериментального подтверждения.

1) Авторы сконцентрировались на локализации митохондриальной мРНК, управляемой MTS.Как предлагалось ранее, это в основном зависит от расположения MTS в ORF и нижестоящей последовательности (длина и вероятная задерживающая последовательность). Авторы заметили, что ассоциация с митохондриями определенных мРНК (ATP3) увеличивается, когда дрожжи переходят из ферментативного состояния в респираторное. Авторы утверждают, что объемная доля митохондрий «регулирует» долю ассоциации. Я думаю, это вопрос о курице и яйце. Эффективность трансляции мРНК также может объяснить эти наблюдения.МРНК ATP3 не транслируются активно в условиях ферментации. Эффективность трансляции резко возрастает (регуляция трансляции), когда условия роста меняются на дыхание, что, в свою очередь, определяет локализацию мРНК в митохондриях. Имеет смысл, что когда доля митохондрий увеличивается, у MTS больше шансов встретиться с рецептором на нем, что приводит к более высокой колокализации. Авторы использовали способы манипулирования фракцией митохондрий и действительно наблюдали большее взаимодействие.Но в этом эксперименте нет прямых доказательств того, что повышенная локализация приводит к большей инициации трансляции.

Мы согласны с предложением рецензента о курице и яйце, чтобы отделить определенные эффекты трансляции от эффектов локализации мРНК, мы протестировали влияние привязки репортерных мРНК к митохондриям в условиях ферментации. Для всех протестированных мРНК мы измерили увеличение синтеза белка. Мы полагаем, что это частично связано с повышенной стабильностью мРНК, но это не объясняет в полной мере увеличение производства белка.Таким образом, чтобы непосредственно проверить, увеличивает ли локализация загрузку рибосом, мы выполнили профилирование полисом и обнаружили, что существует повышенная доля мРНК, связанная с рибосомами, когда мРНК локализована в митохондриях, это предполагает, что частично митохондриальная локализация увеличивает синтез белка за счет увеличения инициации трансляции ( Рисунок 6A-E).

2) Математическое моделирование: авторы утверждают, что мРНК ATP3 и TIM50 имеют определенное сродство к митохондриям. Авторы утверждают, что сродство является «силой специфической ассоциации мРНК».Но если локализация в основном обусловлена ​​трансляцией и связыванием MTS с рецептором, что означает это сродство связывания? Должно ли это быть просто функцией эффективности трансляции мРНК? Должен ли перевод мРНК объяснять всю локализацию? Если бы модель могла различать, увеличивает ли локализация мРНК эффективность трансляции, она была бы более убедительной и захватывающей.

Поскольку большая часть фактического процесса локализации и импорта все еще является активной областью исследований со многими неизвестными, мы стремились использовать как можно более упрощенную модель, чтобы выяснить, может ли доля объема пространства / митохондрий с постоянной «аффинностью» объяснить специфические для состояния фенотипы локализации. видеть.Из дальнейших исследований в нашей статье мы согласны с тем, что для ATP3 и TIM50 время, в течение которого мРНК является компетентной (экспонирование MTS), вероятно, является основным фактором, влияющим на «силу мРНК-специфической ассоциации». Эта компетентность будет зависеть от множества факторов, включая скорость инициации трансляции (эффективность трансляции), но также длину мРНК и, как мы показываем, скорость элонгации.

3) Авторы заявили, что повышенная инициация трансляции основана на западной флуоресценции GFP.Эти конечные белковые продукты также могут зависеть от стабильности белка. Например, если TIM50 или ATP3 не синтезируются на поверхности митохондрий, возникающие белки могут иметь более низкую стабильность и деградировать, поскольку им может потребоваться котрансальционная транслокация. Уменьшение количества белка также может привести к фенотипу роста.

Эта уникальная идея о том, что неправильная транслокационная транслокация приводит к деградации белка, является очень интересным вопросом, и нас также интересовало, как может измениться стабильность белка.Мы наблюдали, что период полужизни (период полужизни белка анализировали с помощью вестерн-блоттинга. Образцы собирали через 0, 30 и 60 минут после добавления CHX (конечные 100 мкг / мл). шкалы) белка ATP3-GFP, который транслируется на плазматической мембране, и контрольный период полувыведения был более 2 часов и существенно не отличался друг от друга. Это интуитивно понятно, что 2-часовой период полураспада белка не сильно влияет на содержание белка в дрожжевых клетках, в которых клеточный цикл равен 1.5 часов, но экспрессия гена (клеточный цикл) контролирует обилие белка. Baum et al., 2019 математически показали, что клеточный цикл более важен, чем период полураспада белка для изобилия белка, когда период полураспада белка больше, чем клеточный цикл. Они заявили, что «становится очевидным, что влияние клеточного деления увеличивается с увеличением периода полужизни либо мРНК (рис. 3А, верхний ряд), либо мРНК и белка».

4) Авторы использовали комбинацию эндогенного мечения и репортеров.Иногда возникает путаница, какие штаммы использовались, потому что это не было четко указано. Например, MCP-GFP и ATP3-flag-GFP не могут быть в одном штамме, верно? Во-первых, его нельзя использовать для изображения РНК. Во-вторых, измерение уровня мРНК методом qPCR с использованием праймера GFP включает как MCP-GFP, так и ATP3-flag-GFP (рис. 6). Так используются ли MCP-RFP для визуализации РНК?

Для визуализации движений мРНК на рис. 3 и 4 мы использовали iRFP в качестве репортерных генов. Для рисунка 6 мы использовали MCP-GFP в качестве контроля по сравнению с мито- и ER-связыванием и протестировали уровни белка с использованием GFP-антитела и провели количественную ПЦР с использованием флаговой последовательности как части ампликона.GFP-антитело связывается как с MCP-GFP, так и с репортерным геном flagGFP, однако мы можем различить разницу по размеру.

https://doi.org/10.7554/eLife.57814.sa2

Многофункциональный нанозонд для нацеливания на опухоли и митохондрии с генерацией синглетного кислорода и мониторинга изменений pH митохондрий в раковых клетках с помощью ратиометрической флуоресцентной визуализации

Митохондрии являются основными участками клеточного метаболизма. Даже незначительные изменения pH могут привести к дисфункции митохондрий и способствовать апоптозу клеток.Фотосенсибилизаторы, нацеленные на митохондрии, могут продуцировать синглетный кислород в митохондриях. При фотодинамической терапии опухолей (ФДТ) опухолевые клетки уничтожаются за счет генерации синглетного кислорода фотосенсибилизаторами, и оптимально процесс апоптоза клеток можно отслеживать в режиме реального времени, отслеживая изменения значения pH митохондрий. С этой целью в данной работе был разработан многофункциональный нанозонд, который не только способен производить синглетный кислород в митохондриях, но также может обнаруживать изменения значения pH митохондрий.Зонд представляет собой квантовую точку биомассы с однократным возбуждением и двойной эмиссией (BQD-FA), полученную из листьев Osmanthus с фолиевой кислотой (FA) и полиоксиэтилендиамином в качестве модификаторов. BQD-FA могут нацеливаться на опухолевые клетки и митохондрии и продуцировать синглетный кислород в митохондриях под воздействием лазерного излучения в ближней инфракрасной области ( λ _em = 660 нм). С другой стороны, в диапазоне pH 3–8 соотношение интенсивностей флуоресценции BQD-FA на длинах волн 490 нм и 650 нм показало хорошую линейную связь со значением pH митохондрий.Логометрическая флуоресцентная визуализация митохондрий с использованием приготовленных BQD-FA показала, что при химической стимуляции клеток хлорфенизоном pH митохондрий упал с 7,9 до 7,2 в течение 15 минут. Исходя из этих характеристик, мы предполагаем, что приготовленный многофункциональный нанозонд будет иметь большое значение в биомедицинских исследованиях митохондрий и ФДТ опухолей.

Эта статья в открытом доступе

Подождите, пока мы загрузим ваш контент… Что-то пошло не так. Попробуйте снова?

Характеристика респираторной активности митохондрий, выделенных из линии клеток насекомых CP-1268 Laspeyresia pomonella, на JSTOR

Абстрактный

Митохондрии были выделены из клеточной линии CP-1268 плодородной плодожорки Laspeyresia pomonella.Митохондриальную фракцию выделяли из объединенных 4-дневных культур с экспоненциальной фазой роста. Митохондрии были определены как неповрежденные на основании демонстрации респираторного контроля, эффектов 2,4-динитрофенола и олигомицина на дыхание, неспособности окислять НАДН и неспособности цитохрома с усиливать дыхание. Выделенные митохондрии были способны эффективно окислять сукцинат, пируват, малат, α-кетоглутарат и α-глицерофосфат. Из протестированных субстратов митохондрии CP-1268 наиболее эффективно окисляли сукцинат.Коэффициенты респираторного контроля варьировались от высокого 4,6 для пирувата до низкого 1,7 для α-глицерофосфата. Эти данные подтверждают, что митохондрии были тесно связаны. Данные также подтверждают наличие трех сайтов окислительного фосфорилирования, поскольку NAD-связанные субстраты имели отношение ADP-0, приближающееся к 3, а связанные с флавопротеинами субстраты имели значения, приближающиеся к 2.

Информация об издателе

Общество биологии in vitro (SIVB) было основано в 1946 году как Ассоциация культур тканей для содействия обмену знаниями о биологии in vitro клеток, тканей и органов растений и животных (включая человека).Основное внимание уделяется биологическим исследованиям, разработкам и приложениям, имеющим значение для науки и общества. Миссия осуществляется через публикации Общества; национальные и местные конференции, встречи и семинары; и через поддержку учебных инициатив в сотрудничестве с образовательными учреждениями. С годами SIVB расширился, чтобы создать среду для научного обмена и междисциплинарного взаимодействия с целью развития существующих и будущих систем для биологии in vitro.

Митохондрии бычьего сердца (ab110338) | Abcam

Спасибо за ответ.

Лаборатория тем временем сообщила мне, что они думают, что вы использовали слишком много митолизата бычьего сердца. Обычно загрузка митолизата сердца крупного рогатого скота должна составлять не менее одной десятой от клеточных лизатов. Полоса отображается при правильном значении MW, дополнительное размытие, указанное выше, может быть связано с перегрузкой скважины.

Кроме того, лаборатория согласна с тем, что вы получите лучший результат, если будете использовать SDS-загрузочный буфер вместо 8M мочевины для денатурирования.

Наш протокол WB содержит информацию о буфере загрузки SDS:

https://www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&rid=11379#A6

«Стандартный буфер загрузки называется 2X буфером Лэммли, впервые описан в Nature, 15 августа 1970 года; 227 (5259): 680-5. Он также может быть изготовлен с концентрацией 4X и 6X, чтобы минимизировать разбавление образцов. 2X следует смешивать с образцом в соотношении 1: 1.

Буфер Laemmli 2X

4% SDS
10% 2-меркаптоэтанол
20% глицерин
0.004% бромфеноловый синий
0,125 M Tris HCl

Проверьте pH и доведите его до pH 6,8.

Когда SDS используется с белками, все белки становятся отрицательно заряженными из-за их присоединения к анионам SDS. SDS денатурирует белки, «обертывая» полипептидный каркас. SDS связывается с белками довольно специфично в массовом соотношении 1,4: 1. При этом SDS наделяет полипептид отрицательным зарядом пропорционально его длине, то есть денатурированные полипептиды становятся «стержнями» облаков отрицательного заряда с равными зарядами или плотностями заряда на единицу длины.

Таким образом, при денатурирующих разделениях в SDS-PAGE миграция определяется не собственным электрическим зарядом полипептида, а молекулярной массой. Степень SDS имеет первостепенное значение: окрашенный белком фон вдоль отдельных участков геля с нечеткими или слегка различимыми полосами белка указывает на старый или некачественный SDS. Обычно необходимо уменьшить дисульфидные мостики в белках до того, как они примут конфигурацию случайной спирали, необходимую для разделения по размеру, с использованием ß-меркаптоэтанола или дитиотреитола (DTT).

Глицерин добавляется в буфер для загрузки, чтобы увеличить плотность загружаемого образца и, следовательно, удерживать образец на дне лунки, ограничивая переполнение и неравномерную загрузку геля ».

Бычий лизат не показывает полосы вокруг 85-90 кДа, что указывает на то, что набор и антитела работают должным образом. Возможно, способ приготовления ваших образцов отличается от способа приготовления лизата крупного рогатого скота, что приводит к различию в молекулярной массе полос Cox-1.

Надеюсь, эта информация будет вам полезна.Не стесняйтесь обращаться к нам, если вам понадобится дополнительная информация или совет.

Пользуетесь нашими продуктами? Отправить отзыв. Зарабатывать награды!
https://www.abcam.com/abreviews

Подробнее

Митохондрии в стартапах. Митохондрии… действуют как электростанции… | Сара Тавел

Митохондрии … действуют как электростанции клетки. — Nature.com

Я считаю, что все сотрудники стартапа находятся в спектре между двумя полюсами:

С одной стороны, есть сотрудники, которые думают компании нравится работа.Они приходят, они много работают и делают свое дело. Некоторые отлично справляются со своей работой. Но в конечном итоге это работа. Они хотят быть уверенными в том, что им справедливо оплачивают свою работу, и у них есть интересные проекты, над которыми можно поработать. Пока они верят, что эти вещи сбалансированы и арбитраж компенсации, который они могут получить, перейдя в другую компанию, находится в определенных пределах, они стабильны и остаются. Таким образом, они являются рациональными действующими лицами, и ценность, которую они добавляют компании, хотя и является ценным, линейно масштабируется.

Тогда есть другая сторона спектра. У этой группы другая ДНК — они действуют скорее как основатели, чем как сотрудники. Они вкладывают свою страсть в компанию, потому что верят в ее миссию и так работают. Они повышают ценность компании, выходя за рамки их должностных обязанностей и обязанностей. Они спрашивают и делают то, что лучше для компании. Они работают усердно и поздно, потому что для них компания — это не работа. Прежде всего, они лучше всего воплощают ценности компании, а потому их ценность нелинейна: они вдохновляют и поддерживают стартап-команды в хорошие и плохие времена.Я думаю об этом классе людей как о митохондриях в стартапах, стремящихся к быстрому росту.

Работа основателя состоит в том, чтобы привлекать и удерживать митохондрии на всех этапах роста компании. На ранних этапах эта редкая группа людей составляет ядро ​​компании. По мере роста вашего стартапа они становятся вашими лидерами. Их следует лелеять, нанимать и поощрять образ мышления других сотрудников. Это начинается с трех вещей:

Осведомленность — всегда первый шаг. Кто такие митохондрии в вашей компании? Составьте этот список.Инвестируйте в свои отношения с этими людьми и в самих людей. Будьте в курсе того, кто входит в эту группу и о чем они думают.

Ценности компании должны быть планом того, как добиться успеха в этой компании; канон того, как команда ведет себя и принимает решения. Как я упоминал ранее, митохондрии не просто хороши в своей работе — они лучше всего воплощают ценности компании. Отсюда следует, что для увеличения ваших шансов нанять митохондрии нельзя просто пройти собеседование на предмет компетентности.Вам нужно пройти собеседование по поводу ценностей.

Интервью по ценностям поможет вам определить, будет ли кандидат соответствовать основным ценностям компании. Эти интервью должны проводиться командой основателей или, в зависимости от вашего масштаба, митохондриями, которые уже работают в компании (нужно знать одного).

Чтобы быть ясным, собеседование на предмет ценностей не гарантирует, что вы будете нанимать митохондрии. Но если вы не проводите собеседование о ценностях и не говорите о важности своих ценностей во время собеседования, ваш процесс найма в лучшем случае неоптимален.Как и настоящие митохондрии, сотрудники митохондрий не будут напрямую масштабироваться до общего числа сотрудников, если вы не приложите усилий для их воспроизведения.

В какой-то момент компания формализует свою структуру вознаграждения — то, что она предлагает новым и существующим сотрудникам в зависимости от должности и уровня опыта.

Самая большая ошибка, которую я видел в стартапах, — это использование одной и той же шкалы для этих двух классов сотрудников. Уровни компромисса — это рациональная структура, которая накладывается на иррациональную приверженность и влияние.Компании, которые не разрывают связи, будут недооценивать энергетическое воздействие митохондриальных сотрудников, что в конечном итоге поставит под сомнение их способность мотивировать и удерживать их.

Я понимаю, что это предложение может вызвать опасения по поводу неравенства в команде. Для ясности: я говорю об очень небольшом проценте ваших сотрудников, и для них их чрезмерное влияние должно быть самоочевидным.

Тем не менее, это образ мышления, который вы хотите поощрять в всех сотрудниках.Один из способов сделать это — подчеркнуть ценности или влияние за пределами описания вашей должности в рамках процесса оценки эффективности. Например, в Pinterest у нас было 2×2, где одна ось была «Влияние», а другая — «Ценности». По словам моего партнера Джона Лилли, в Mozilla говорили о влиянии на проект и компанию. Я подозреваю, что любой способ работает — важность подчеркивает что-то большее, чем личность, особенно на самых критических этапах, когда компания масштабируется с нескольких десятков человек до нескольких сотен.По мере того, как стартапы масштабируются до компаний, становится все труднее и труднее сделать это частью корпоративной культуры.

—

Как инвестор, я начал делиться этой структурой команды с предпринимателями, которых встречаю. Буду приветствовать отзывы об этом. Я считаю, что компании, которые понимают, как привлекать и удерживать свои митохондрии, имеют гораздо больше шансов на успех в долгосрочной перспективе. Если вы этого не сделаете, это сделает кто-то другой.

Стационарный кинетический анализ митохондриальных респираторных ферментов митохондрий сердца крупного рогатого скота | Прикладная биологическая химия

Реагенты

Все реагенты приобретены у Sigma Aldrich (Миссури, США).

Анализ активности митохондриального комплекса I (НАДН: убихинон оксидоредуктаза)

Изолированные митохондрии бычьего сердца были приобретены у Cayman Chemical (MI, США). Активность комплекса I контролировали, используя спектральные свойства окисленного НАДН при 340 нм с коэффициентом экстинкции (ε) 6,2 ммоль ^-1 см ^-1 , как описано ранее [16]. Активность комплекса I измеряли с использованием ультрачистой дистиллированной воды, 50 мМ калий-фосфатного буфера (pH 7.5), 3 мг / мл бычьего сывороточного альбумина, 300 мкМ цианида калия (KCN) и различные концентрации NADH (2,5, 5, 10, 25, 50, 75 и 100 мкМ) с использованием 3 мкг митохондрий бычьего сердца. После 10 мин инкубации при 37 ° C добавляли 60 мкМ убихинона, и изменение поглощения при 340 нм измеряли в течение 600 с каждые 10 с с помощью спектрофотометра S-3100 (Scinco, Сеул, Республика Корея). Параллельный анализ проводили в тех же условиях с использованием фиксированной концентрации НАДН (100 мкМ) и различных концентраций убихинона 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 и 70 мкМ.

Анализ активности митохондриального комплекса II (сукцинатдегидрогеназа)

Активность комплекса II контролировали с использованием DCPIP (дихлорфенолиндофенола) в качестве реагента сочетания при 600 нм с коэффициентом экстинкции (ε) 19,1 ммоль ^-1 см ^{— 1} , как описано ранее [16]. Активность комплекса II измеряли в ультрачистой дистиллированной воде, 25 мМ калий-фосфатном буфере (pH 7,5), 1 мг / мл БСА, 300 мкМ KCN, 80 мкМ DCPIP и различных концентрациях сукцината (2.5, 5, 10, 20, 30, 40, 60 и 80 мМ) с использованием 3 мкг митохондрий бычьего сердца. После 10 мин инкубации при 37 ° C добавляли 50 мкМ децилубихинона и измеряли изменение поглощения при 600 нм в течение 600 с каждые 10 с с использованием спектрофотометра S-3100 (Scinco). Параллельный анализ проводили в тех же условиях с использованием фиксированной концентрации 80 мМ сукцината и различных концентраций 5, 10, 20, 30, 40, 50 и 60 мкМ децилубихинона.

Анализ активности митохондриального комплекса III (кофермент Q: цитохром с оксидоредуктаза)

Активность комплекса III измеряли с использованием спектрального свойства восстановленного цитохрома с при 550 нм с коэффициентом экстинкции (ε) 18.5 ммоль ^-1 см ^-1 , как описано ранее [16]. Активность комплекса III измеряли в ультрачистой дистиллированной воде, 25 мМ калий-фосфатном буфере (pH 7,5), 500 мкМ KCN, 0,025% (об. / Об.) Tween-20, 100 мкМ ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) и 75 мкМ окисленного цитохрома. c с использованием 3 мкг митохондрий бычьего сердца. После 10 мин инкубации при 37 ° C добавляли децилубихинол различных концентраций (2,5, 5, 7, 10, 12,5, 18,5 и 25 мкМ) и измеряли изменение поглощения при 550 нм в течение 600 с каждые 10 с, используя спектрофотометр S-3100 (Scinco).Параллельный анализ проводили в тех же условиях с использованием фиксированной концентрации 25 мкМ децилубихинола и различных концентраций 5, 10, 20, 30, 40, 50 и 60 мкМ окисленного цитохрома c .

Анализ активности митохондриального комплекса IV (цитохром с оксидаза)

Активность комплекса IV измеряли путем окисления восстановленного цитохрома с с использованием спектрального свойства восстановленного цитохрома с при 550 нм с коэффициентом экстинкции (ε) из 18.5 ммоль ^-1 см ^-1 , как описано ранее [16]. Активность комплекса IV измеряли в ультрачистой дистиллированной воде, 50 мМ калий-фосфатном буфере (pH 7,0) и различных концентрациях восстановленного цитохрома c (10, 30, 50, 70, 90 и 120 мкМ). После 10 мин инкубации при 37 ° C добавляли 3 мкг митохондрий бычьего сердца и измеряли изменение поглощения при 550 нм в течение 600 с каждые 10 с с использованием спектрофотометра S-3100 (Scinco).

Кинетический анализ митохондриальных комплексов

На основании результатов спектров поглощения, полученных с помощью анализа активности, начальная скорость была измерена по линейному участку кривой хода реакции и соответствовала стандартному уравнению Михаэлиса-Ментен (уравнение.1) для получения значений V _max и K _m . В уравнении. 1, V ₀ представляет начальную скорость, V _max представляет максимальную скорость реакции, достигаемую системой, а K _m представляет концентрацию субстрата, при которой скорость реакции составляет половину В _макс .

$$ {V} _ {0} = {V} _ {max} [S] / ({K} _ {m} + [S]) $$

(1)

Скорость непрямого оборота k _cat каждого фермента была определена на основе уравнения.2. В формуле. 2, V _max представляет максимальную скорость реакции, достигаемую системой, k _cat представляет число оборотов, а [ E _t ] представляет концентрацию фермента, применяемую в качестве соотношение каждого фермента ..

$$ {V} _ {max} = {k} _ {cat} [{E} _ {t}] $$

(2)

Анализ проводился с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 8.0.1.

Нет единого мнения о значении тестов митохондриальной ДНК на ВИЧ

Два исследования, опубликованные в этом месяце, дали противоречивые результаты о ценности тестирования уровней митохондриальной ДНК у пациентов, получающих лечение аналогами нуклеозидов, запутывая и без того мутные воды исследований взаимосвязи между НИОТ и спектр физических проблем, связанных с токсическим действием этого класса лекарств на митохондриальную ДНК.

Митохондрии производят энергию внутри клеток, но аналоги нуклеозидов подавляют их репликацию, подавляя действие полимеразы гамма.

Митохондриальная токсичность способствует развитию:

Глоссарий

липоатрофия

Потеря жира на определенных участках тела, особенно на лице, руках, ногах и ягодицах.

p-значение

Результат статистического теста, который говорит нам, могут ли результаты исследования быть случайными и не будут ли подтверждены, если исследование будет повторено.Все p-значения находятся в диапазоне от 0 до 1; в наиболее надежных исследованиях p-значения очень близки к 0. Значение p, равное 0,001, означает, что существует вероятность 1 из 1000, что результаты являются случайными и не отражают реальной разницы. Значение p 0,05 означает, что вероятность того, что результаты являются случайными, составляет 1 из 20. Когда значение p составляет 0,05 или ниже, результат считается «статистически значимым». Доверительные интервалы предоставляют информацию, аналогичную p-значениям, но их легче интерпретировать.

митохондриальная токсичность

Митохондрии — это структуры в клетках человека, ответственные за производство энергии.При повреждении препаратами против ВИЧ это может вызвать широкий спектр побочных эффектов, включая, возможно, потерю жира (липоатрофию).

• Периферическая невропатия
• Лактоацидоз
• Панкреатит
• Стеатоз печени
• Миопатия

Ее также обвиняют в развитии липаотрофии (истощение жира), хотя механизмы истощения и перераспределения жира по-прежнему вызывают большие споры.

Доктор Хулио Монтанер и его коллеги из Университета Британской Колумбии сообщили об использовании анализа митохондриальной ДНК (мтДНК) для оценки уровней мтДНК у 8 пациентов с гиперлактатемией, предположительно вызванной митохондриальной токсичностью.Все восемь получали d4T, и шестеро также получали ddI, и у всех были симптомы гиперлактатемии, такие как усталость, тошнота, дискомфорт в животе и потеря веса. Также были оценены две контрольные группы: 24 человека без ВИЧ и 47 человек с ВИЧ, не получавших лечения.

Анализ изучал уровни мтДНК в мононуклеарных клетках периферической крови и обнаружил, что отношение мтДНК к ядерной ДНК было почти на 70% ниже у пациентов с гиперлактатемией по сравнению с ВИЧ-отрицательными людьми и на 43% ниже по сравнению с с ВИЧ-инфицированными людьми, не получавшими лечения.

Уровни митохондриальной ДНК улучшились после прекращения лечения аналогами нуклеозидов и не ухудшились при возобновлении лечения НИОТ без d4T, что привело авторов к предположению, что d4T может оказывать особенно токсичное действие на митохондриальную ДНК.

Авторы предполагают, что, учитывая частоту гиперлактатемии у пациентов, получающих лечение НИОТ, этот тест можно использовать для мониторинга митохондриальной токсичности.

Однако исследования, проведенные в больнице Университета Кейс Вестерн Резерв в Кливленде, США, не показали какой-либо связи между лечением НИОТ и истощением митохондриальной ДНК.

Доктор Грейс МакКомси исследовала уровни мтДНК в лейкоцитах периферической крови десяти пациентов с липоатрофией. Ни в одном случае соотношение мтДНК и ядерной ДНК не уменьшилось по сравнению с четырьмя пациентами, не получавшими антиретровирусной терапии, и десятью людьми без ВИЧ. Действительно, уровни мтДНК были выше у пациентов, получавших НИОТ, по сравнению со здоровой контрольной группой, что привело авторов к предположению, что либо уровни митохондриальной ДНК не являются хорошим маркером митохондриальной дисфункции, либо повреждение митохондрий, вызванное НИОТ, является тканеспецифичным. и не будет обнаруживаться в анализах крови.

Недавнее исследование, проведенное в Германии, предполагает, что истощение митохондриальной ДНК обнаруживается в подкожно-жировой клетчатке у людей с липоатрофией.

Д-р Ульрих Уокер и его коллеги сравнили уровни митохондриальной ДНК в подкожном ягодичном жире 24 ВИЧ-положительных пациентов и 8 ВИЧ-отрицательных контролей. Уровни митохондриальной ДНК не различались между контрольной группой и пятью пациентами, не получавшими НИОТ, но были на 44% ниже у тех, кто получал НИОТ (p = 0,01). Пациенты также были стратифицированы по липоатрофии; у одиннадцати пациентов с липоатрофией уровни мтДНК были на 43% ниже, чем в группе без липоатрофии (p = 0.01).

Липоатрофия была связана с лечением d4T, продолжительностью лечения ставудином (p = 0,003) и большей продолжительностью ВААРТ, содержащей ингибитор протеазы (33 месяца против 19 месяцев, p = 0,01).

Чтобы определить, является ли снижение уровней мтДНК следствием повышенных уровней апоптоза, в клетках Jurkat был индуцирован апоптоз и наблюдалось увеличение отношения митохондриальной ДНК к ядерной ДНК, соответствующее раннему разрушению ядерной ДНК, что позволяет предположить, что истощение митохондрий не является следствием апоптоза.

Список литературы

Cote HCF et al. Изменения митохондриальной ДНК как маркер токсичности нуклеозидов у ВИЧ-инфицированных. N Engl J Med 346 (11): 811-820, 2002.

McComsey G et al. Анализ генома митохондриальной ДНК в лейкоцитах периферической крови ВИЧ-инфицированных пациентов с липоатрофией или без нее. AIDS 16: 513-518, 2002.

Walker U et al. Свидетельства наличия генетических и структурных дефектов митохондрий в жировой ткани у ВИЧ-инфицированных, связанных с ингибитором обратной транскриптазы нуклеозидным аналогом. JAIDS 29: 117-121, 2002.

.