Посредством это как: ПОСРЕДСТВОМ — это… Что такое ПОСРЕДСТВОМ?

Создан 10 сен.

57711 золотой знак33 серебряных знака88 бронзовых знаков

Ваша конфиденциальность

Нажимая «Принять все файлы cookie», вы соглашаетесь, что Stack Exchange может хранить файлы cookie на вашем устройстве и раскрывать информацию в соответствии с нашей Политикой в ​​отношении файлов cookie.

Принимать все файлы cookie Настроить параметры

больниц Южного Орегона охвачены крупнейшей вспышкой COVID за все время:

Команда регионального медицинского центра Asante Rogue на юге Орегона готовится к интубации пациента с COVID-19. Майкл Блюмхардт / Асанте скрыть подпись

Команда регионального медицинского центра Asante Rogue на юге Орегона готовится к интубации пациента с COVID-19.

Если вы живете в одном из сельских поселений, спрятанных на лесных склонах на границе между Орегоном и Калифорнией, и нуждаетесь в серьезной медицинской помощи, вы, вероятно, попадете в Региональный медицинский центр Asante Rogue. Он обслуживает около девяти округов по обе стороны границы.

Система Asante включает три больницы в Rogue Valley — в городах Ashland, Medford и Grants Pass.По словам персонала, все три отделения интенсивной терапии на 100% заполнены пациентами с COVID-19.

«Сегодня у нас было две смерти. Так что это очень мрачное и трудное время», — сказал доктор Майкл Блюмхардт, медицинский директор отделения интенсивной терапии, во вторник августа.

По словам Блюмхардта, в отличие от более ранних фаз пандемии, в больницах Асанте сейчас проходят лечение пациенты с COVID-19 в возрасте 20, 30, 40 и 50 лет.

«Мы видим, как группы принимают несколько семей. У нас были отец и взрослая дочь, помещенные в отделение интенсивной терапии, и он скончался, прямо перед тем, как мне пришлось перевести дочь на систему жизнеобеспечения», — сказал он.

В целом показатели вакцинации во многих штатах выглядят неплохо. Но увеличьте масштаб, и вы увидите эффект шахматной доски с огромными различиями от округа к округу. Орегон не исключение. В метро Портленда и его окрестностях две трети всех жителей полностью вакцинированы. Но сельские округа даже близко не к этому; у многих уровень вакцинации составляет менее 50% или даже 40%. В округе Джексон на юге Орегона проживает наибольшее количество непривитых людей в штате. Это доводит местные больницы до предела.

Asante винит в нынешнем всплеске высокий уровень трансмиссии дельта-варианта, а также широко распространенный отказ от вакцины против коронавируса в этой области.

«Это намного серьезнее для этого региона, чем предыдущие волны COVID», — сказал он. «Дельта-вирус распространяется по региону, как пила».

В отделении интенсивной терапии Asante в Медфорде Челси Орр, дипломированная медсестра, внимательно наблюдает за пациентами.

«Мы лечим здесь очень многих пациентов, находящихся на ИВЛ, которые очень больны», — сказал Орр.

По ее словам, на этой стадии пандемии по-другому ощущается невероятная гибель людей.

«Это было действительно тяжело. Мы работаем усерднее, чем когда-либо раньше, и все еще проигрываем», — сказал Орр.

Другая медсестра интенсивной терапии, Джастин Маккой, соглашается.

«Я работаю медсестрой интенсивной терапии 10 лет. Я никогда не видел ничего подобного», — сказал Маккой. «Это действительно ужасно видеть этих пациентов, которые не могут дышать. Это очень сложная вещь для наблюдения. Это действительно ужасно для них, и нам действительно трудно видеть их изо дня в день.

Блюмхардт сказал, что подавляющее большинство пациентов в Асанте не вакцинированы.

«Мы принимаем девять невакцинированных на каждого вакцинированного человека, — сказал он. — Таким образом, очевидно, что вакцина защищает от госпитализации».

округе Джексон зафиксировано рекордное количество коронавирусных инфекций. В течение нескольких недель состояние многих из этих людей может ухудшиться, и им потребуется стационарное лечение. К сожалению, новый прогноз Орегонского университета здоровья и науки предсказывает, что ко Дню труда штат столкнется с нехваткой от 400 до 500 больничных коек.

Блюмхардт сказал, что небольшие больницы в Орегоне пытались перевести своих самых больных пациентов в Асанте, но до сих пор им приходилось отказывать около 200 человек, потому что у них нет кроватей или персонала.

Несмотря на то, что Asante уже отложила некоторые операции, персонал просто измотан, сказала врач отделения неотложной помощи Кортни Уилсон.

«Я думаю, что люди разочарованы», — сказал Уилсон. «Меня обескураживает то, что у нас в этом сообществе уже давно есть вакцина, а уровень вакцинации здесь действительно низкий.»

В этом месяце губернатор Орегона Кейт Браун направила войска Национальной гвардии в подавленные округа для оказания помощи с неклиническими задачами, такими как уборка больничных палат, транспортировка медикаментов и регулирование дорожного движения. Около 150 солдат были отправлены в южный Орегон. Руководители медиков в Асанте и Providence, другая больничная система в Rogue Valley, объединились, чтобы попросить штат создать полевой госпиталь на 300 коек. Штат также завершил контракт на развертывание сотен медицинских «кризисных бригад», состоящих из медсестер, респираторных терапевтов и фельдшеров от медицинских кадровых компаний до переполненных больниц.

«Я не знаю, как мы собираемся позаботиться обо всех. Это чистая прибыль», — сказал Блюмхардт. «Мы все работаем на каждом уровне организации».

Жители округа Джексон начинают реагировать на кризис. Количество новых прививок здесь выросло ( ) и сейчас примерно вдвое больше, чем в районе Портленда. Но тысячам людей по-прежнему необходима вакцинация, чтобы наверстать упущенное.

Этот рассказ был подготовлен в рамках партнерства NPR в области репортажей с Jefferson Public Radio и Kaiser Health News.

сквозных, бросковых и сквозных | Grammar Girl

Для этого шоу к нам обратились Сумерки из шоу «Сумерки и Фивы» с вопросом об омофонах:

Меня путают слова с по , [как в] «Я просмотрел эту стопку бумаг». Не может быть, что бросил , потому что я не выбрасываю бумаги. Так это с по ? Но потом, когда я набираю от до , это по какой-то причине выглядит грамматически неверно. Если бы вы могли просветить меня, я был бы очень признателен.

Омофоны

Купить сейчас

Будучи партнером Amazon и партнером Bookshop.org, QDT зарабатывает на соответствующих покупках.

Twilight, спасибо за вопрос. Вы получаете то, что, как мне кажется, сложно для многих людей, особенно для людей, которые только изучают английский: омофоны. Эти слова звучат одинаково, но означают разные вещи. Омофоны можно писать по-разному — например, бросил, (бросил) и с по (до конца) — или они могут писать одинаково, но означать разные вещи, например, ярмарка (ярмарка), которая может быть существительным. как в «Мы пошли на ярмарку штата» или прилагательное как в «Он получил справедливое судебное разбирательство.»

Прежде всего, вы правы, полагая, что бросил (т-ч-р-е-ш) — неправильное слово, потому что это прошедшее время глагола бросить , например, «Давайте выбросим бездельников».

Это становится немного более рискованным, когда вы пытаетесь выбрать между – и –. На самом деле я не думал, что от до было словом, когда я впервые услышал ваш вопрос, но я поискал его на всякий случай и был очень удивлен, обнаружив его в словаре, где оно указано как неформальное, упрощенное написание слова слово через.

Вау. Так что в некоторых неофициальных случаях кажется, что можно использовать от до ; но я думаю, что было бы упущением, если бы я действительно сказал вам использовать его. У меня сложилось впечатление, что использование написания t-h-r-u в некотором роде эквивалентно расставанию точек над i маленькими сердечками: люди поймут, что вы имеете в виду, но они подумают, что вы не очень серьезный человек. Я бы определенно придерживался более формального и общепринятого написания: t-h-r-o-u-g-h.

Многие люди удивляются, узнав, что нахождение слова в словаре не означает автоматически, что это слово широко принято в обществе.Вы найдете слова с по , независимо от того, и — это не во многих словарях, но это не значит, что вы должны использовать их в сопроводительных письмах. Это просто означает, что они настолько широко используются, что создатели словарей считают, что слова должны быть признаны и определены.

Я могу придумать лишь несколько примеров, когда было бы приемлемо использовать от до (t-h-r-u). Один — в текстовом сообщении другу, потому что, нравится вам это или нет, ожидания относительно грамматики и правописания в текстовых сообщениях между друзьями ниже, чем в других формах письма.Кроме того, люди, вероятно, с большей вероятностью примут неформальное написание в местах, где места очень мало, например, на дорожных знаках, рекламе или, опять же, в текстовых сообщениях.

Общество упрощенного правописания

Вы, американцы, которые съеживаете, должны помнить, что одна из причин, по которой у нас есть американские варианты написания таких слов, как Theater , honor, и catalog , заключается в том, что такие светила, как Ной Вебстер, Марк Твен, Бенджамин Франклин, Эндрю Карнеги , и Теодор Рузвельт выступал за упрощенное написание, и многие из них также поддерживали упрощенное написание слов, таких как – (–), – (–) и ночь ( ночь ), что конечно же, не облачился в маскировку широкой приемлемости.Рузвельт даже пытался потребовать, чтобы в правительственных документах использовалось простое написание во время своего президентства. Его предложение опередило свое время и отклонено Конгрессом, но некоторые из предложенных им упрощений стали текущими стандартными написаниями (1, 2, 3, 4). Британское общество упрощенного правописания, основанное в 1908 году — через два года после неудачной попытки Рузвельта изменить правописание в Америке — все еще существует, и оно часто попадает в новости, когда протестует против Национальной орфографической пчелы Скриппса (5).

Список литературы

Интересные ссылки

мутаций PIK3CA и CCM питают каверномы через механизм, подобный раку.

Ариана Гранде — подсластитель Тексты песен | Genius Тексты

[Перед припевом: Ariana Grande и Pharrell ]
Когда жизнь раздает нам карты ( Ayy, ayy, ayy, ayy )
Сделайте все на вкус соленым ( Ayy, ooh, ayy, ayy, ayy )
Затем вы проходите, как подсластитель, который вы есть ( Ayy, ayy, ayy, ayy )
Чтобы прекратить горький вкус ( Ayy, ayy, ayy, ayy, ayy, )

[Припев: Ariana Grande & Pharrell ]
И тогда вы получите это, получите, получите, получите ( Ayy )
Ударь, ударил, ударил, ударил ( Ayy )
Переверните, переверните, переверните его
Вы заставляете меня говорить о ( Sheesh! ), oh ( Sheesh! )
Скрутите, скрутите, скрутите, скрутите
Смешайте и перемешайте, перемешайте и перемешайте
Поцелуй это, поцелуй его, поцелуй его
Ты заставляешь меня сказать о ( Sheesh! ), oh ( Sheesh! )

[Куплет 1: Ariana Grande & Pharrell ]
Мне нравится, как ты облизываешь миску ( You лизать чаша, шиш )
Каким-то образом ваш метод задевает ( Шиш! ) моя душа ( Шиш, трогает мою душу, да, )
Это поднимает меня на неизведанные высоты ( Эй, подсластитель, подсластитель, подсластитель, подсластитель, подсластитель )
Итак, когда они спрашивают: «Как жизнь?» ( Sheesh! ) Я иду ( Sheesh! )

[Pre-Chorus: Ariana Grande & Pharrell ]
Когда жизнь раздает нам карты ( Ayy, ayy, ayy, ayy )
Сделайте все на вкус как это соль. ауу, ауу, ауу, ауу )

[Припев: Ариана Гранде и Фаррелл ]
И тогда вы получите это, получите, получите, получите ( Ayy )
Ударь, ударил, ударил , ударь ( Ayy )
Переверни, переверни, переверни
Ты заставляешь меня сказать о ( Sheesh! ), о ( Sheesh! )
Крути, крути, крути, крути
Смешайте и перемешайте, перемешайте и перемешайте
Поцелуй, поцелуй, поцелуй
Ты заставил меня сказать о ( Sheesh! ), oh ( Sheesh! )

[Стих 2: Ariana Grande & Фаррелл 9024 7]
Твоя мама прислала нам гороскопы (американские гороскопы, sheesh )
Было так весело наблюдать, как они разворачиваются ( Sheesh , наблюдая, как они разворачиваются, да, )
Ты сказал, что я ей нравлюсь, я улыбаюсь ( Ayy ), Я знаю ( Подсластитель, подсластитель, подсластитель, подсластитель, подсластитель )
Итак, когда они спрашивают: «Как жизнь?» ( Sheesh! ) Я иду ( Sheesh! )

[Pre-Chorus: Ariana Grande & Pharrell ]
Когда жизнь раздает нам карты ( Ayy, ayy, ayy, ayy )
Сделайте все на вкус как это соль. ауу, ауу, ауу, ауу )

[Припев: Ариана Гранде и Фаррелл ]
И тогда вы получите это, получите, получите, получите ( Ayy )
Ударь, ударил, ударил , ударь ( Ayy )
Переверни, переверни, переверни
Ты заставляешь меня сказать о ( Sheesh! ), о ( Sheesh! )
Крути, крути, крути, крути
Смешайте и перемешайте, перемешайте и перемешайте
Поцелуй, поцелуй, поцелуй
Ты заставил меня сказать о ( Sheesh! ), oh ( Sheesh! )

[Переход: Ariana Grande & Pharrell ]
А затем мы кладем его обратно и разговариваем остаток ночи.
То, что мы можем зажечь, заставляет меня говорить о ( Блин! ), о ( Sheesh! )
Говоря о том, что ты хочешь сделать, правильно это или неправильно
Я слежу за тобой, потому что ты заставляешь меня говорить о ( Sheesh! ), oh ( Sheesh! )
( Привет, ) Сказал, что не знаю, что бы я делал без тебя в своей жизни ( ауу ), это было бы так кисло ( Подсластитель, ауу )
Я надеюсь, что каждый сможет испытайте то, что у нас есть ( Sweetener, sweetener, ayy, ayy, ayy, sweetener, ayy, ayy, ayy )

[Pre-Chorus: Ariana Grande & Pharrell ]
Когда жизнь раздает нам карты ( Ayy) , ауу, ауу, ауу )
Сделайте все на вкус как соль ( Sheesh, sheesh! )
Тогда вы пройдете, как подсластитель ( Ayy, ayy, ayy, ayy, ayy ) вы
Чтобы принести горький вкус прекратился ( Sheesh, sheesh! )

[Припев: Ariana Grande & Pharrell ]
И тогда вы понимаете, понимаете, получаете, получаете ( Ayy )
Ударь, ударил, ударил, ударил ( Ayy )
Переверни, переверни, переверни
Ты заставляешь меня сказать о ( Sheesh! ), о ( Sheesh! )
Скрутите, скрутите, скрутите, скрутите
Перемешайте и перемешайте, перемешайте и перемешайте
Поцелуй, поцелуй, поцелуй ( Подсластитель, подсластитель, подсластитель , сладкий )
Ты заставляешь меня говорить о ( Sheesh! ), oh ( Sheesh! )
Ты заставляешь меня говорить о, детка!
Эй, да, да…

Каково пройти сквозной тест на COVID-19

Широко распространенные варианты тестирования на коронавирусную болезнь 2019 (COVID-19) все еще испытывают некоторые трудности с ростом, но все больше и больше появляется сайтов для тестирования.Теперь люди могут пройти тест на COVID-19 из машины так же, как если бы вы заказывали фаст-фуд. Но является ли этот метод тестирования более быстрым и безопасным и, что более важно, работает ли он?

Ниже приводится анализ того, каково пройти сквозной тест на COVID-19, а также различные доступные варианты тестирования.

Являясь частью новой нормы с начала 2020 года, пандемия COVID-19 все еще бушует по всей стране. По данным Центров по контролю и профилактике заболеваний (CDC), десятки тысяч американцев по-прежнему ежедневно заражаются новым коронавирусом.К симптомам, связанным с COVID-19, таким как лихорадка, затрудненное дыхание, потеря вкуса и запаха, нельзя относиться легкомысленно. Людям следует проконсультироваться с врачом, чтобы сразу же получить рекомендации по управлению своим состоянием.

Фармацевты — одни из наиболее доступных практикующих врачей, к которым вы можете обратиться для первичной консультации и раннего выявления заболевания. Люди могут обсудить свои симптомы с лицензированным фармацевтом по телефону, чтобы помочь различить COVID-19, простуду, аллергию и сезонный грипп.

Если фармацевт подозревает, что кто-то заразился коронавирусом, он посоветует как можно скорее пройти тестирование и принять меры, предотвращающие распространение COVID-19.

Тестирование на COVID-19

Тестирование на COVID-19 необходимо для предотвращения дальнейшего неконтролируемого распространения высокозаразной болезни. Тесты на COVID-19 могут помочь людям определить, были ли они инфицированы этим вирусом, чтобы они могли самоизолироваться, чтобы предотвратить дальнейшее распространение пандемии.FDA одобрило 2 различных типа тестов на коронавирус: диагностику COVID-19 и тест на антитела.

Хотя оба теста помогают определить наличие COVID-19, они используются для разных целей. Тест на антитела используется, чтобы определить, подвергался ли человек когда-либо воздействию COVID-19, путем поиска антител к коронавирусу в крови. С другой стороны, диагностический тест может помочь определить, инфицирован ли человек в настоящее время коронавирусом. Если кто-то плохо себя чувствует, его лечащий врач попросит его пройти диагностический тест на COVID-19.

Диагностический тест COVID-19

Диагностический тест COVID-19 может помочь определить, есть ли у кого-то активная коронавирусная инфекция, путем поиска генетического материала или определенных белков на поверхности вируса. Согласно Journal of Clinical Microbiology , большинство диагностических тестов COVID-19 используют метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) для выявления активной инфекции.

ПЦР-тест — золотой стандарт тестирования на коронавирус. Во время ПЦР-теста врач будет использовать ватный тампон для сбора образца слизи из носа или горла пациента.Затем образец отправляется в лабораторию для анализа. Лаборанты будут искать следы генетического материала вируса в образце, чтобы диагностировать активную инфекцию COVID-19.

ПЦР-тестирование

ПЦР-тестирование — это быстрый и точный метод диагностики активной инфекции COVID-19. Люди могут пройти ПЦР-тест в больнице, клинике, дома или в собственном автомобиле. Многие поставщики медицинских услуг рекомендуют пройти тест на COVID-19, чтобы защитить медицинских работников и предотвратить дальнейшее распространение заразной болезни.Точность 99% тестов ПЦР на COVID-19 нисколько не теряется в проезжей части.

Проходной тест на COVID-19

Проходной тест на COVID-19 — самый эффективный метод диагностики активной коронавирусной инфекции, сводящий к минимуму дальнейшее распространение заразной болезни. Исследования показали, что риск передачи коронавируса значительно ниже на открытом воздухе и в хорошо вентилируемых помещениях, поэтому проездные тесты позволяют обеспечить более высокие стандарты безопасности, чем посещения офиса.

Исследование, проведенное Университетом Джорджии и опубликованное в JAMA Internal Medicine , показало, что скорость передачи коронавируса выше в помещении, чем на открытом воздухе. Исследователи обнаружили, что человек, инфицированный COVID-19, смог передать болезнь десяткам других людей в невентилируемом автобусе, заразив при этом очень мало людей во время большого религиозного мероприятия на открытом воздухе.

Преимущества сквозного теста на COVID-19

Результаты исследования Университета Джорджии показывают, что вы с большей вероятностью заразите других или заразитесь COVID-19 в помещении, например в больнице или клинике, в то время как ждать несколько часов, чтобы пройти тестирование.При прохождении теста на COVID-19 люди помещаются в карантин в своей машине, изолированы от других, а процедура тестирования проводится в хорошо вентилируемой среде.

Сочетание изоляции потенциально больных пациентов в их машине и проведения теста в условиях вентиляции сводит к минимуму передачу COVID-19 остальному населению, помогая сдерживать и смягчать распространение смертельной болезни.

Чего следует ожидать во время сквозного теста на COVID-19

Если поставщик медицинских услуг попросил вас пройти тест на коронавирус для диагностики активной инфекции, вам следует поискать авторитетное сквозное тестирование на COVID-19 сайты, чтобы пройти тестирование как можно скорее.Быстрый поиск в Интернете может помочь вам найти места, предлагающие сквозное тестирование.

Изучите сайт тестирования, чтобы узнать, нанимают ли они лицензированных клиницистов, сертифицированных врачей, а также имеют ли или работают с Поправками по улучшению клинических лабораторий и сертифицированными FDA лабораториями для проведения очень сложных медицинских исследований. Найдя идеальное место для прохождения тестирования, свяжитесь с центром тестирования, чтобы записаться на прием. Вы также должны спросить на месте тестирования, что вам следует взять с собой и что вам нужно сделать, чтобы подготовиться к сквозному тесту.

Процедура прохождения теста на COVID-19

В день приема вы поедете на место тестирования, держа окна закрытыми на протяжении всей поездки. Добравшись до места, следуйте инструкциям, чтобы выехать на соответствующую полосу движения. Вас усадят в машину, когда к вам подойдет медицинский работник, чтобы записать вашу личную информацию.

После того, как ваша личная информация будет записана, вас направят в другое место для тестирования.Пока вы сидите в машине, медицинский работник в защитном снаряжении попросит вас откинуть голову назад, чтобы собрать образец слизи для отправки на анализ. Медицинский работник вставит длинную и тонкую ватную палочку глубоко в нос или заднюю часть горла, чтобы собрать жидкость из дыхательной системы.

Тампон проводят по задней поверхности горла или носовой полости и могут оставаться там в течение нескольких секунд для максимального сбора слизи. Эта процедура может быть неудобной для некоторых людей.После того, как образец будет собран, ваш сквозной тест на COVID-19 завершится, и вы можете отправиться домой. Вся процедура тестирования занимает менее 10 минут.

Центр тестирования отправит образец в лабораторию для анализа. Ожидайте, что вы получите результаты в течение 48–72 часов после тестирования. Многие сайты тестирования предлагают результаты на следующий день за дополнительную плату.

Что делать после теста на COVID-19

После того, как вы пройдете тестирование и получите свои результаты, вам следует проконсультироваться с врачом, чтобы интерпретировать результаты вашего теста.Многие клиники предлагают услуги телемедицины, позволяющие проконсультироваться с врачом практически, не выходя из дома, с использованием технологий, аналогичных Skype или FaceTime.

Во время удаленной консультации ваш врач может посоветовать вам, какие шаги нужно предпринять для улучшения вашего здоровья, и назначит лекарства для лечения ваших симптомов. Виртуальные визиты к врачу также помогают сдерживать распространение COVID-19, поскольку помогают избежать поездок в больницы и клиники, переполненные потенциально больными людьми.

Безопасное, быстрое и конфиденциальное тестирование на COVID-19

Проходные тесты на COVID-19 обеспечивают точное и безопасное тестирование в комфорте и конфиденциальности вашего собственного автомобиля.Они помогают уменьшить количество людей, которые посещают больницы и клиники, чтобы пройти тестирование на коронавирус, уменьшая бремя пандемии для медицинских работников и сводя к минимуму дальнейшее распространение болезни.

Если вы испытываете симптомы COVID-19, проконсультируйтесь со своим врачом и запланируйте проездной тест на COVID-19, чтобы диагностировать ваше состояние и управлять симптомами.

Ссылки

• Центры по контролю и профилактике заболеваний. Число случаев COVID-19 и случаев смерти в США по штатам . Департамент здравоохранения и социальных служб США; 2020. По состоянию на 8 октября 2020 г. https://covid.cdc.gov/covid-data-tracker.
• Основы тестирования на коронавирус. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США; 2020. По состоянию на 8 октября 2020 г. https://www.fda.gov/consumers/consumer-updates/coronavirus-testing-basics.
• Тан Ю.В., Шмитц Дж. Э., Персинг Д.Х. и др. Лабораторная диагностика COVID-19: актуальные проблемы и вызовы. J Clin Microbiol. 2020. DOI: 10.1128 / JCM.00512-20.
• Шен И, Чангвэй Л., Донг Х. Расследование эпидемии SARS-CoV-2 среди пассажиров автобусов в Восточном Китае. JAMA Intern Med. 2020. doi: 10.1001 / jamainternmed.2020.5225.

Об авторе

Аарон Смит — контент-стратег из Лос-Анджелеса и консультант по поддержке STEM-фирм и медицинских практик. Он рассказывает о новых отраслевых разработках и помогает компаниям общаться с клиентами.В свободное время Аарон любит плавать, танцевать свинг и писать научно-фантастические романы.

Доставка мРНК-вакцины с липидоподобным материалом усиливает противоопухолевую эффективность за счет передачи сигналов Toll-подобного рецептора 4

Значение

Наше исследование выявило минималистскую нановакцину с липидной наночастицей C1 (LNP), которая эффективно способствует доставке мРНК и презентации антигена с функцией самоадъюванта за счет активации передачи сигналов TLR4. Нановакцина с мРНК C1 LNP продемонстрировала значительную эффективность in vivo как в профилактике опухолей, так и в терапевтических вакцинах.Таким образом, наша работа представляет платформу мРНК нановакцины для разработки иммунотерапии рака для широкого спектра типов опухолей.

Abstract

Внутриклеточная доставка противоопухолевой вакцины на основе матричной РНК (мРНК) продемонстрировала большой потенциал для индукции противоопухолевого иммунитета. Для достижения устойчивой противоопухолевой эффективности мРНК, кодирующая опухолевые антигены, должна быть эффективно доставлена ​​и транслирована в дендритные клетки с одновременной стимуляцией врожденного иммунитета для стимулирования презентации антигена. Здесь, путем скрининга группы катионных липидоподобных материалов, мы разработали минималистичную нановакцину с липидной наночастицей C1 (LNP), которая может эффективно доставлять мРНК в антигенпредставляющие клетки с одновременной активацией Toll-подобного рецептора 4 (TLR4) и индуцировать устойчивые Т-клетки. активация.Нановакцина C1 проникала в клетки посредством фагоцитоза и показывала эффективную экспрессию и презентацию антигена, кодируемого мРНК. Кроме того, липидная наночастица C1 индуцировала экспрессию воспалительных цитокинов, таких как IL-12, посредством стимуляции сигнального пути TLR4 в дендритных клетках. Важно отметить, что нановакцина с мРНК C1 продемонстрировала значительную противоопухолевую эффективность как в профилактике опухолей, так и в терапевтических вакцинах. В целом, наша работа представляет противораковую нановакцину на основе мРНК C1 LNP с эффективной экспрессией антигена, а также с самоадъювантным свойством, которая может обеспечить платформу для разработки иммунотерапии рака для широкого спектра типов опухолей.

За последние десятилетия в иммунотерапии рака произошел крупный прорыв, который значительно продвинул наше понимание биологии рака и улучшил терапевтические результаты для больных раком (1). Хотя терапевтическая противораковая вакцина против метастатического рака предстательной железы была одобрена Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) в 2010 году, клиническая эффективность была ограничена, вероятно, из-за использованного единственного ракового антигена, слабой антигенпредставляющей способности дендритных клеток, полученных in vitro (DCs). ) и иммуносупрессивное микроокружение опухоли (2, 3).Как вызвать мощный противоопухолевый иммунный ответ in vivo, все еще остается серьезной проблемой в области разработки терапевтических противораковых вакцин.

Принцип противораковой вакцины состоит в том, чтобы вызвать сильные противоопухолевые реакции путем вакцинации пациентов противоопухолевым (ыми) антигеном (ами) и иммуностимулирующим адъювантом либо в растворимой форме, либо в форме частиц (3, 4). Затем онкоспецифический антиген обрабатывается и презентируется Т-клеткам антигенпрезентирующими клетками (APC), в основном DC, in vivo. Недавние открытия предполагают, что специфические для пациента неоантигены могут вызывать более специфические и устойчивые противоопухолевые реакции по сравнению с антигеном, ассоциированным с раком, но точное предсказание неоантигена все еще находится в зачаточном состоянии.Таким образом, множественные предсказанные неоантигены часто используются для обеспечения широкой иммуногенности (5). Традиционно раковые антигены часто доставляются в форме цельного белка, антигенных пептидов или ДНК-плазмид, кодирующих специфические раковые антигены (2, 3, 6). Однако ДНК-плазмиды могут создавать потенциальный риск интеграции хромосом, а пептидный синтез нескольких антигенов может быть дорогостоящим и требовать много времени. В последнее время вакцина на основе матричной РНК (мРНК) стала все более популярным средством доставки вакцины для лечения инфекционных заболеваний или рака (7, 8).Примечательно, что мРНК может обеспечивать быструю экспрессию белков множества антигенов в неделящихся и трудно трансфицируемых клетках, таких как DC, без необходимости ядерной транслокации и транскрипции. Другие преимущества мРНК-вакцины включают высокую эффективность, высокий потенциал для быстрой разработки, дешевизну производства и безопасное введение (7).

Эффективная доставка и трансляция мРНК in vivo имеет решающее значение для достижения терапевтической эффективности лечения рака. Из-за особых характеристик мРНК, таких как большой размер, сильно отрицательный заряд и подверженность деградации, доставка вакцины с мРНК представляет собой несколько потенциальных проблем (7, 9).Инъекция голой мРНК вызывала только слабую и временную экспрессию белка in vivo (10). Первым подходом к введению мРНК in vivo был состав протамин-мРНК, который позже был использован в вакцине против рака простаты и в настоящее время проходит клинические испытания (11). За последние несколько лет вакцины с доставкой наночастиц (нановакцины) начали демонстрировать заметные успехи в иммунотерапии рака (12–16). Поскольку для эффективной презентации антигена антиген и адъювант необходимо совместить с антигенпрезентирующими клетками, биомиметические наночастицы с большой несущей способностью хорошо подходят для составления вакцины (17, 18).Важно отметить, что наночастицы могут быть нацелены на DC in vivo посредством пассивного депонирования или доставки, облегченной активным нацеливающим фрагментом (19). Множественные факторы, включая размер, заряд и форму, могут влиять на нацеливание на ДК и иммуноактивационную эффективность нановакцин (20). Изменяя поверхностный заряд с положительного на слегка положительный или нейтральный, Kranz et al. недавно сообщили о мРНК-вакцине на основе липоплекса, которая эффективно воздействует на дендритные клетки in vivo и индуцирует специфические иммунные ответы путем систематических инъекций (21).Тем не менее нейтральный или отрицательный заряд может представлять проблему для эффективной загрузки мРНК в состав LNP.

Из-за легкости синтеза и низкой токсичности катионные липидоподобные материалы использовались для доставки адъюванта siRNA и иммуностимулирующей РНК в последние несколько лет, но их использование в вакцине мРНК изучено не так хорошо (22–25). Предыдущая работа с использованием такой липидной наночастицы для доставки мРНК-вакцины позволила достичь впечатляющей эффективности иммунизации in vitro и in vivo (26).Однако такая вакцина все еще содержала липополисахарид, полученный из клеточной стенки бактерий (ЛПС), в качестве адъюванта, и, таким образом, увеличила бы сложность производства и потенциальную токсичность. Чтобы поддерживать врожденный иммуностимулирующий эффект, избегая при этом системной токсичности, в недавних подходах к «минималистской вакцине» в качестве носителя мРНК вакцины использовались гетероциклические липиды, а также в качестве «собственного адъюванта» путем стимуляции опосредованного СТИНГом ответа на интерферон I типа врожденного иммунитета (16, 27). ). Не было проверено, влияют ли другие сигнальные реакции врожденного иммунитета на мРНК нановакцины с LNP.Чтобы исследовать более универсальный самоадъювантный наноноситель для доставки мРНК вакцины, мы разработали библиотеку катионных липидоподобных соединений за счет эффективного раскрытия цикла эпоксидов с помощью поколения 0 дендримеров поли (амидоамина) (PAMAM) и проверили их на основе антигена in vitro. презентационный тест. В этой библиотеке D2 был известен как G0-C14 и ранее использовался для доставки генов (23–25). В анализе презентации антигена лучшим кандидатом, который мы идентифицировали, был C1 LNP с 12-углеродным хвостом, который эффективно доставлял антиген-кодирующую мРНК в DC, производил эффективную трансляцию мРНК в антиген и индуцировал устойчивый Т-клеточный ответ.Важно отметить, что сам C1 может стимулировать экспрессию воспалительных цитокинов, таких как IL-12, в DC посредством активации передачи сигналов TLR4. При тестировании нановакцины C1, содержащей специфические мРНК, кодирующие раковый антиген, на различных моделях опухолей мы наблюдали устойчивые иммунные ответы и противоопухолевую эффективность как в профилактике опухолей, так и в терапевтических условиях без очевидной токсичности. Таким образом, такая мРНК-вакцина, содержащая C1-LNP, может обеспечить реальный подход к иммунотерапии рака с хорошим профилем безопасности.

Результаты

Дизайн и скрининг наночастиц на основе липидоподобных материалов.

Чтобы облегчить инкапсуляцию мРНК, катионные липидоподобные материалы были синтезированы через раскрытие цикла 1,2-эпокситетрадекана путем генерации 0 дендримеров PAMAM с разной длиной углеродных хвостов (рис. 1 A ). Полиэтиленгликоль, содержащий липид, 1,2-дистеароил- sn -глицеро-3-фосфоэтаноламин- N — [малеимид (полиэтиленгликоль) -2000] (DSPE-PEG 2000), был составлен с катионным липидоподобным материалом. (A1-A3, B1-B3, C1-C3, D1-D3 и E1-E3) в структуру LNP ( SI Приложение , рис.S1 A ). Липидоподобное материальное соединение было синтезировано с катионными головными группами, которые могли эффективно конденсировать мРНК посредством электростатических взаимодействий. Затем липидоподобный материал с мРНК мог самособираться с DSPE-PEG 2000 с образованием стабильных НЧ.

Т-клеток липидоподобных материалов, доставляющих мРНК. ( A ) Синтез 15 катионных липидоподобных соединений посредством эффективных эпоксидов с открытым кольцом путем генерации 0 дендримеров PAMAM для доставки мРНК.«A» представляет собой G0 ПАМАМ, «b» представляет собой эпоксид. R = -CH ₂ CH (OH) C _n-2 H _2n-3 . ( B ) Схематическая иллюстрация, показывающая анализ презентации антигена in vitro. Кодирующая антиген мРНК, составленная с липидными наночастицами, была взята и экспрессирована в антиген дендритными клетками, а затем представлена ​​Т-клеткам, которые секретировали IL-2 при стимуляции антигеном. ( C ) Уровни IL-2, секретируемого Т-клетками, измеренные с помощью ELISA, после индукции DC, обработанными мРНК OVA в составе различных материалов.( D ) Спектры H-ЯМР липидоподобного материала C1. ( E ) Уровни IL-2, секретируемые Т-клетками, индуцированные DC, обработанными мРНК OVA, приготовленной с C1 или липофектамином 2000 (Lip2000). Пептид OVA служил положительным контролем. Контроль: только средний. Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов. *** P <0,001.

Затем мы применили LNP в качестве нановакцины для доставки антигена, кодирующего мРНК. На фиг. 1 B схематическая иллюстрация показывает экспериментальный процесс скрининга, включая презентацию антигена и анализ активации Т-клеток in vitro.МРНК, кодирующая антиген, в составе LNP захватывалась DC, транслировалась, процессировалась и представлялась Т-клеткам, которые секретируют интерлейкин-2 (IL-2) при активации в результате связывания антиген-TCR. Мы использовали мРНК, кодирующую эпитоп CD8 (кодирующий OVA _257–264 ) модельного антигена овальбумина (OVA), чтобы проверить влияние различных составов на активацию Т-клеток. МРНК OVA была инкапсулирована в LNP с использованием 15 видов липидоподобных материалов для образования мРНК нановакцины. Дендритные клетки мыши DC2.4 обрабатывали мРНК нановакциной, затем совмещали с клетками B3Z (OVA-специфическая гибридома CD8 Т-клеток мыши), которые секретируют цитокин IL-2 при стимуляции антигеном OVA.Результаты ELISA показали, что мРНК-вакцина, содержащая липидоподобный материал C1, индуцировала самый высокий уровень секреции IL-2 (фиг. 1 C ). Результаты показали, что C1 может доставлять мРНК в DC с эффективной трансляцией и презентацией антигена в T-клетки. На фиг.1 D показан результат H-ЯМР (H-ЯМР-спектроскопия) для C1. Нагруженный мРНК OVA C1 (C1-OVA) давал примерно в три раза более высокий уровень IL-2, чем уровень мРНК, приготовленной с липофектамином 2000 (Lip2000), коммерческим липосомным реагентом, часто используемым для трансфекции нуклеиновых кислот (рис.1 E ). Чтобы дополнительно подтвердить такие результаты на первичных иммунных клетках мыши, мы совместили дендритные клетки, полученные из костного мозга мыши (BMDC), с мРНК C1-OVA, а затем сокультивировали их с первичными клетками OT-1 мыши (T-клетки CD8 мыши специфически распознают эпитоп антигена OVA). . Уровень секреции IL-2 и IFN-γ Т-клетками в группе C1-мРНК был намного выше, чем у группы Lip2000 ( SI Приложение , рис. S1 B ). Важно отметить, что мРНК C1-OVA также индуцировала гораздо более высокий уровень экспрессии комплекса MHC-I-OVA (измеряемый с помощью антитела, распознающего комплекс h3Kb-OVA _257–264 ) на DC, чем у группы Lip2000 ( SI Приложение , стр. Инжир.S1 C ). Эти результаты показали, что нановакцина с C1-мРНК эффективно доставляла антиген-кодирующую мРНК к DC и способствовала эффективной трансляции мРНК и презентации антигена для активации Т-клеток.

Характеристика и структура C1-мРНК нановакцины.

Затем мы оптимизировали соотношение C1 / мРНК для максимальной индукции IL-2, и было выбрано соотношение 160: 1 для получения нановакцины C1-мРНК в оставшейся части исследования ( SI Приложение , рис. S1 D ).Затем мы охарактеризовали физические и химические свойства вакцины C1-мРНК. Результаты показали, что комплекс C1-мРНК представляет собой наночастицы со средним диаметром около 150 нм (фиг. 2 A ). Индекс полидисперсности (PDI) частиц C1-мРНК оставался на уровне около 0,23 в течение 7 дней, а диаметр оставался стабильным (фиг. 2 B ). Средний поверхностный потенциал частиц C1-мРНК был около +16 мВ (рис. 2 C ). Такие особенности могут способствовать эффективности переноса мРНК C1 в клетки.Изображения просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) показали частицы C1-мРНК в виде наночастиц округлой формы (фиг. 2 D ).

Физико-химическая характеристика и эффективность экспрессии мРНК наночастиц C1-мРНК. ( A ) Средний размер наночастиц C1-мРНК. ( B ) Размер и PDI наночастиц C1-мРНК, измеренные в течение 7 дней. ( C ) Дзета-потенциал наночастиц C1-мРНК. ( D ) ПЭМ-изображение, показывающее форму комплекса C1-мРНК.( E ) Экспрессия мРНК GFP в клетках DC2.4 путем доставки голой мРНК, Lip2000 или C1. Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение от трех независимых экспериментов.

Клеточный путь захвата и внутриклеточная локализация C1-мРНК нановакцины.

Наночастицы размером более 100 нм часто проникают в клетки путем макропиноцитоза или фагоцитоза (20). Предварительная обработка клеток DC 2.4 цитохалазином D (ингибитор фагоцитоза), но не амилоридом (ингибитор макропиноцитоза), значительно снизила клеточный захват нановакцины C1-мРНК-кумарин6 ( SI Приложение , рис.S2 A и B ), предполагая, что фагоцитоз является основным путем клеточного поглощения нановакцины C1-мРНК.

Затем мы исследовали захват и внутриклеточную локализацию C1-мРНК нановакцины DC. Чтобы облегчить отслеживание внутриклеточной локализации C1-мРНК, мРНК была помечена флуоресцентным красителем флуоресцеином 12 (F12) путем замены UTP на F12-UTP во время синтеза мРНК. Клетки DC2.4 инкубировали только с мРНК F12, мРНК Lip2000-F12 и нановакциной C1-F12-мРНК.Конфокальная микроскопия показала, что интенсивность флуоресценции группы мРНК C1-F12 была значительно выше, чем групп мРНК только F12 и Lip2000-F12-мРНК ( SI Приложение , рис. S2 C и D ), что указывает на эффективная внутриклеточная доставка мРНК с помощью C1 LNP. Чтобы гарантировать, что мРНК может быть эффективно транслирована в белок / пептид, мы приготовили мРНК C1-GFP, кодирующую зеленый флуоресцентный белок (GFP). Конфокальная микроскопия показала, что около 50% клеток, трансфицированных мРНК Lip2000-GFP, показали сигнал GFP через 24 часа после трансфекции, но почти 100% клеток экспрессировали белок GFP с высокой интенсивностью флуоресценции в группе, трансфицированной мРНК C1-GFP (рис.2 E и SI Приложение , рис. S2 E ). Эти результаты показали, что мРНК GFP, доставленная C1-LNP, эффективно транслировалась в белок. Мы также сравнили уровни экспрессии белка мРНК GFP, приготовленной с различными липидоподобными материалами, с помощью проточной цитометрии и обнаружили, что группы мРНК C1-GFP показали заметно более высокие уровни экспрессии белка GFP, чем другие группы ( SI Приложение , рис. S1 E ).

C1-мРНК нановакцина индуцировала иммунную активацию BMDC.

Затем мы исследовали, как нановакцина с C1-мРНК может влиять на статус активации DC. C1 и C1-мРНК заметно повышали поверхностную экспрессию костимулирующих молекул, таких как CD80, CD86 и CD40, на DC (фиг. 3 A ), что указывает на созревание и активацию DC. Поскольку передача сигналов врожденного иммунитета часто способствует экспрессии гена воспалительных цитокинов для активации DC, мы затем исследовали экспрессию генов цитокинов в первичных BMDC мыши. Результаты показали, что обработка C1 и C1-мРНК значительно индуцировала экспрессию провоспалительных генов цитокинов IL-1β, IL-6, IL-12a и IL-12p40 в BMDC (рис.3 B ), и гены интерферона I типа, включая IFN-α1, IFN-α4 и IFN-β1, в более умеренной степени ( SI Приложение , Рис. S3 A ). Результаты ELISA подтвердили повышающую регуляцию уровней белка цитокинов IL-1β, IL-6 и IL-12p70 в супернатанте культуры из клеток, обработанных C1 и C1-мРНК (фиг. 3 C ). Таким образом, мы пришли к выводу, что C1 LNP индуцирует продукцию провоспалительных цитокинов BMDC.

Врожденная иммунная активация BMDC с помощью C1-мРНК нановакцины.( A ) Нановакцина с C1-мРНК способствовала созреванию BMDC. Экспрессия CD40, CD80 и CD86 повышалась при обработке С1-мРНК. BMDC были заблокированы для клеток CD11c ⁺ для анализа популяции DC. Контроль: только средний. Использованная концентрация: мРНК: 120 нг / мл, C1: 19,2 мкг / мл; время обработки: 24 ч. MFI, средняя интенсивность флуоресценции. ( B ) Уровни мРНК цитокинов, включая il-1β , il-6 , il-12a и il-12p40 в BMDC при различных обработках, таких как A , измеренные с помощью кПЦР.Время лечения: 12 ч. ( C ) Уровни белка IL-1β, IL-6 и IL-12p70 в культуральной среде BMDC при различных обработках, как в A , измеренные с помощью ELISA. Время лечения: 24 часа. Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов. *** P <0,001; **** П <0,0001.

Недавние исследования выявили критическую роль STING-опосредованной передачи сигналов инферферона I типа в эффективности мРНК-вакцины, опосредованной циклическими липидными наночастицами (16, 27). Чтобы выяснить, является ли эффект иммунной активации C1 STING-зависимым, мы протестировали иммуностимулирующий эффект C1 в BMDC дикого типа (WT) и BMDC с дефицитом STING, полученных из линии мышей с нокаутом Sting , специфичной для дендритных клеток (обозначенной как Sting cKO здесь).Результат показал, что индуцированные C1 уровни активации Т-клеток, экспрессии костимулирующих молекул и генов интерферона I типа были сопоставимы между WT и STING-дефицитными клетками ( SI Приложение , рис. S3 B — D ). Таким образом, мы заключаем, что активация иммунной системы, индуцированная C1 LNP, в значительной степени не зависит от STING.

Затем мы проверили, влияет ли длина боковой цепи R-групп и химические структуры на стимулирующие эффекты LNP. Из 15 протестированных липидов только C1 и C2 активировали продукцию цитокинов в BMDC ( SI Приложение , рис.S3 F ). Интересно, что C3 не стимулировал выработку цитокинов, что указывает на то, что незначительные структурные изменения / различия могут вызывать различную биологическую функцию (химические структуры C1, C2 и C3 показаны в приложении SI , рис. S3 G ). Эти результаты предполагают, что длина из 12 атомов углерода является оптимальной для активации BMDC, и в то же время исключают возможность загрязнения эндотоксином (LPS) во время синтеза наночастиц.

КМК, активируемые нановакциной C1-мРНК, посредством передачи сигналов TLR4.

Продукция воспалительных цитокинов в BMDC в основном регулируется сигналом NF-κB, индуцированным активацией рецепторов врожденного иммунитета (28). Чтобы определить, зависит ли активация BMDC нановакциной C1-мРНК от какого-либо известного пути передачи сигналов Toll-подобного рецептора (TLR), мы предварительно обработали BMDC низкомолекулярными ингибиторами TLR3, TLR4, TLR7 / 8 и TLR9, а затем проанализировали экспрессия генов цитокинов в BMDC, обработанных C1- или C1-мРНК. Наши результаты показали, что TAK-242, ингибитор TLR4, блокирует способность индуцируемой C1 или C1-мРНК продукции цитокинов в BMDC (рис.4 А ). Напротив, предварительная обработка ингибитором TLR3 (CU CPT4a), ингибитором TLR7 / 8 (контроль ODN2088) или ингибитором TLR9 (ODN2088) только частично подавляла продукцию цитокинов ( SI Приложение , рис. S3 H ). В соответствии с эффектом ингибитора TLR4 активация цитокинов, индуцированная C1 и C1-мРНК в BMDC WT, практически полностью отсутствовала в TLR4-дефицитных BMDC, полученных от Tlr4 ^{— / —} мышей (рис. 4 B ) . На молекулярном уровне обработка C1 или C1-мРНК заметно индуцировала уровень фосфорилирования протеинкиназ, таких как IKKα / β, и митоген-активированных протеинкиназ (MAPK), включая ERK, JNK и p38 в BMDC дикого типа, но такое фосфорилирование в основном было упразднены в Tlr4 ^{— / —} BMDC (рис.4 C и D ). C1 LNP, но не C3, также индуцировал активацию репортера NF-κB в клетках DC2.4, и такая активация также ингибировалась TAK-242 ( SI Приложение , рис. S3 E ). Таким образом, мы пришли к выводу, что C1 LNP может сильно индуцировать фосфорилирование MAPKs и активировать путь NF-κB в дендритных клетках TLR4-зависимым образом. Вместе эти данные показывают, что фагоцитоз C1-мРНК нановакцины BMDC активировал TLR4-зависимый сигнальный путь NF-κB, тем самым способствуя цитокиновой реакции и активации DC для эффективной презентации антигена.

C1-мРНК индуцировала экспрессию цитокинов в BMDC через передачу сигналов TLR4. ( A ) Уровни экспрессии il-1β , il-6 , il-12a и il-12p40 в BMDC после инкубации с контролем, мРНК, C1-мРНК и C1-мРНК с TAK-242 (5 мкМ, предварительная обработка в течение 1 ч), измерено с помощью КПЦР. Контроль: только средний. Использованная концентрация: мРНК: 120 нг / мл, C1: 19,2 мкг / мл; время обработки: 12 ч. ( B ) Уровни экспрессии il-1β , il-6 , il-12a и il-12p40 в WT или Tlr4 ^{— / —} BMDC после инкубации с контролем, мРНК , и C1-мРНК, измеренная с помощью кПЦР.Контроль: только средний. Время лечения: 12 ч. ( C и D ) Уровни фосфорилированного и общего белка сигнальных молекул врожденного иммунитета (IKKα / β, p65, ERK, JNK и p38) в BMDC после инкубации с C1 ( C ) или C1-мРНК ( D ). Число под каждой полосой представляет собой количественное значение плотности относительно β — актина. Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов в A и B . *** P <0,001; **** П <0.0001.

Биораспределение in vivo и противоопухолевая эффективность C1-мРНК нановакцины.

Чтобы изучить биораспределение C1-мРНК in vivo, мы вводили меченную DiR (флуоресцентным красителем) C1-мРНК (C1-мРНК-DiR) подкожно в правую паховую область мышей B6. Через 24 часа после инъекции мы наблюдали сильный сигнал флуоресценции в тканях печени и легких. Важно отметить, что нановакцина C1-мРНК-DiR также демонстрировала сильное накопление в дренирующих лимфатических узлах и контралатеральных лимфатических узлах (рис.5 А ). Этот результат побудил нас продолжить изучение иммунного эффекта С1-мРНК нановакцины in vivo. При вакцинации мРНК C1-OVA у мышей был обнаружен самый высокий уровень OVA-специфических CD8 ⁺ Т-клеток, отраженных окрашиванием OVA-тетрамером ( SI Приложение , рис. S4 A и B ) и лимфатической Узловые Т-клетки продуцировали гораздо более высокие уровни IFN-γ, чем у мышей, вакцинированных белком OVA, приготовленным с использованием обычной соли алюминия с адъювантом вакцины (группа OVA + Alum) ( SI Приложение , рис.S4 C ). Эти результаты продемонстрировали, что нановакцина с C1-мРНК индуцировала устойчивый антиген-специфический Т-клеточный ответ in vivo.

Противоопухолевый эффект С1-мРНК нановакцины в качестве профилактической или терапевтической вакцины. ( A ) Биораспределение C1-мРНК нановакцины in vivo (, верхний, ). Флуоресценция измерялась через 1 или 24 часа после подкожной инъекции C1-мРНК-DiR ( Lower ). Доза C1-мРНК-DiR на мышь: мРНК, 10 мкг; С1 1,6 мг; DiR: 16 мкг; n = 3 мыши на группу.( B и C ) Противоопухолевая эффективность нановакцины с C1-мРНК в качестве профилактической противораковой вакцины. Верхний : График вакцинации; Нижний : профилактический эффект нановакцины мРНК C1-OVA в модели опухоли MC38-OVA ( B ) и модели опухоли B16-OVA ( C ). Квасцы служили контрольным адъювантом. Контроль: группа инъекции PBS. Доза мРНК C1-OVA на мышь: мРНК, кодирующая OVA _257–264 , 10 мкг; С1 1,6 мг; OVA + квасцы на мышь: 200 мкг пептида на мышь; n = 5 мышей на группу.( D и E ) Противоопухолевая эффективность нановакцины с C1-мРНК в качестве терапевтической противораковой вакцины. ( D ) Верхний : График вакцинации; Нижний : терапевтический эффект мРНК C1-OVA нановакцины на модели опухоли B16-OVA. ( E ) Терапевтический эффект нановакцины с мРНК C1-Trp2 на модели опухоли B16. Контроль: группа инъекции PBS; Доза мРНК C1-OVA на мышь: мРНК, кодирующая OVA _257–264 , 10 мкг; C1 1,6 мг.Доза мРНК C1-TRP2 на мышь: мРНК, кодирующая TRP2, 10 мкг; С1 1,6 мг; n = 5 мышей на группу. Данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего. **** П <0,0001.

Затем мы исследовали противоопухолевую эффективность нановакцины C1-мРНК как в профилактике рака, так и в терапевтических целях. Сначала мы сконструировали OVA-экспрессирующие клеточную линию колоректального рака MC38-OVA и клеточную линию меланомы B16-OVA для опухолевого эксперимента ( SI Приложение , фиг. S4 D ). Мышей B6 случайным образом разделили на три разные группы: контрольную группу (с инъекцией фосфатно-солевого буфера [PBS]), группу OVA + Alum и группу нановакцины с мРНК C1-OVA.Все вакцины вводили подкожно в паховую область мышей, а опухолевые клетки MC38-OVA инокулировали подкожно через 7 дней (фиг. 5 B ). Группа нановакцины с мРНК C1-OVA показала лучшее ингибирование роста опухоли по сравнению с группой вакцины OVA + Alum и контрольной группой (фиг. 5 B и SI, приложение , фиг. S5 A ). Аналогичный эффект ингибирования опухоли наблюдался в модели опухоли B16-OVA (фиг.5 C и SI Приложение , фиг.S5 B ). Эти результаты показали, что нановакцина с мРНК C1-OVA может служить в качестве эффективной вакцины для предотвращения развития опухоли в результате инокуляции опухолевых клеток, экспрессирующих OVA. Когда C1-мРНК нановакцина использовалась в качестве терапевтической вакцины после инокуляции опухоли, она также эффективно подавляла рост опухолей B16-OVA (фиг. 5 D и SI Приложение , фиг. S5 C ).

В предыдущих экспериментах мРНК, кодирующая экзогенный антиген OVA _257–264 , была сконструирована в C1-мРНК нановакцине в качестве суррогатного опухолевого антигена.Однако многие опухолевые антигены являются аутоантигенами, и хозяин более толерантен к таким антигенам. Чтобы дополнительно определить, может ли вакцина C1-мРНК нарушать самотолерантность и индуцировать противоопухолевый иммунитет против собственного опухолевого антигена, мы синтезировали новую нановакцину C1 с мРНК, кодирующей TRP2, аутоантиген от меланомы мыши, для лечения модели меланомы мыши B16. . Кривые роста опухоли показали, что нановакцина с мРНК C1-TRP2 также эффективно ингибирует рост опухоли B16 в качестве терапевтической вакцины (рис.S5 D ), предполагая, что эффективность вакцины мРНК C1 с аутоантигеном была такой же хорошей, как и у модельного антигена.

C1-мРНК Эффективность нановакцины зависит от передачи сигналов TLR4.

Затем мы протестировали in vivo роль TLR4 в противоопухолевом эффекте C1-мРНК нановакцины с использованием мышей WT и Tlr4 ^{— / —} мышей. Мы проанализировали уровни 26 различных цитокинов / хемокинов в образцах сыворотки мышей после обработки C1-мРНК нановакциной (фиг. 6 A ).Результаты многофакторного иммуноанализа показали, что уровни шести цитокинов (IL-6, IL-β, IL-12P70, TNF-α, GM-CSF и MCP-1) значительно различались между WT и Tlr4 ^{— / —} мышей после двух иммунизаций нановакцинами (фиг. 6 B ). Мы предположили, что такие уровни высвобождения цитокинов могут способствовать активации иммунной системы и противоопухолевому иммунитету, не вызывая при этом системного воспаления. Затем мы проверили, как дефицит TLR4 влияет на противоопухолевую активность C1-мРНК нановакцины.В соответствии с предыдущими результатами, мРНК C1-OVA, но не мРНК C1 с мРНК, кодирующей нерелевантный пептид, эффективно ингибировала рост опухоли B16-OVA у мышей WT, подтверждая, что такой эффект был специфичным к опухолевому антигену (фиг. 6 B и SI Приложение , рис. S6 A ). Что еще более важно, эффект ингибирования опухолей мРНК вакцины C1-OVA был почти полностью устранен у мышей Tlr4 ^{— / —} , что подтверждает важную роль TLR4 в индуцированном вакциной C1-мРНК противоопухолевом эффекте (рис.6 C и SI Приложение , Рис. S6 B ). Кроме того, вакцина мРНК OVA, созданная с помощью неиммунных стимулирующих LNP C3 и D1, не подавляла рост опухоли B16-OVA ( SI Приложение , фиг. S6 C — E ). Все эти данные убедительно свидетельствуют о том, что противоопухолевая эффективность вакцинации C1-мРНК требует как эффективной экспрессии антигена, так и активации передачи сигнала TLR4.

Нановакцина с C1-мРНК индуцировала TLR4-зависимый иммунный ответ in vivo.( A ) Профили цитокинов и хемокинов в образцах сыворотки мышей WT и Tlr4 ^{— / —} после вакцинации C1-мРНК. Верхний : График вакцинации и сбора периферической крови. Lower : Мультиплексный иммуноанализ, измеряющий 26 цитокинов / хемокинов из образцов сыворотки. Контроль: группа инъекции PBS. Доза мРНК C1-OVA на мышь: мРНК, кодирующая OVA _257–264 , 10 мкг; С1 1,6 мг; n = 5 мышей на группу. ( B и C ) Противоопухолевая эффективность нановакцины C1-мРНК на мышах WT и Tlr4 ^{— / —} .Нерелевантная мРНК, не кодирующая антиген, служит отрицательным контролем. Контроль: группа инъекции PBS. Доза мРНК нановакцины на мышь: мРНК, 10 мкг; С1 1,6 мг; n = 5 мышей на группу. Данные представляют собой среднее значение ± SEM **** P <0,001; нс, не имеет значения.

Профиль безопасности C1-мРНК нановакцины in vivo.

Для оценки профиля безопасности C1-мРНК нановакцины in vivo основные органы и сыворотку крови мышей собирали на 20 день после иммунизации.Иммуногистохимическое окрашивание не выявило серьезных гистологических аномалий в тканях сердца, печени, селезенки, легких и почек у мышей с C1-мРНК нановакциной ( SI Приложение , рис. S7 A ). Гематологический анализ также показал нормальную функцию печени (оцениваемую по активности аспартатаминотрансферазы [AST] и аланинаминотрансферазы [ALT]), функцию почек (оцениваемую по уровням мочевой кислоты [UA], креатинина [CR] и азота мочевины крови [BUN]). и сердечная функция (оцениваемая по активности креатинкиназы [CK] и лактатдегидрогеназы [LDH]) мышей, получавших нановакцину, что позволяет предположить, что нановакцина с C1-мРНК не вызвала заметной токсичности in vivo ( SI Приложение , рис.S7 B ).

Обсуждение

Со времени первого сообщения о липидоподобных материалах, синтезе и скрининге доставки миРНК, такие материалы широко использовались для миРНК, химиотерапевтических препаратов, иммуностимулирующих РНК и доставки мРНК (22–25). Интересно, что структуры наиболее эффективных липидоподобных материалов, проверенных на доставку siRNA и мРНК, сильно различаются. Это может отражать различный химический состав и сродство связывания двухцепочечной короткой миРНК по сравнению с одноцепочечной мРНК.

Предыдущее исследование презентации антигена показало, что антиген и врожденный иммуностимулирующий адъювант должны кодироваться в единичные антигенпрезентирующие клетки, чтобы способствовать презентации антигена (18). Поскольку наночастицы могут служить векторами доставки, а также самоадъювантами, они особенно подходят для создания вакцин (15, 29). Ранняя работа показала, что сами молекулы РНК могут быть иммуностимулирующими посредством задействования передачи сигналов TLR3 / 7/8 при доставке со специфическими липидными наночастицами, а недавнее исследование также показало, что такая передача сигналов способствовала эффективности разработанной авторами мРНК нановакцины (21, 24).Недавно Луо и др. сообщили о полимерной наночастице с циклической боковой цепью, которая может активировать STING-зависимую передачу сигналов интерферона I типа и повышать противоопухолевый иммунитет, тем самым действуя как эффективная минималистская нановакцина (16). Совсем недавно скрининг ионизируемых липидоподобных материалов идентифицировал тип гетероциклического липида с эффективной доставкой мРНК и внутренним свойством активации STING для состава мРНК вакцины (27). Для сравнения, идентифицированный нами липидоподобный материал C1 имел этиленовую группу PAMAM с липидным хвостом из 12 атомов углерода и активировал TLR4-опосредованную провоспалительную передачу сигналов в DC для усиления противоопухолевого иммунитета.Иммунный эффект C1-мРНК в значительной степени не зависит от STING, поскольку мы наблюдали сопоставимые уровни стимуляции DC и активации Т-клеток с помощью C1-мРНК в BMDC дикого типа и с дефицитом STING. Напротив, TLR4 необходим для индуцированной C1-мРНК иммунной активации и противоопухолевой эффективности in vivo. Возможно, что C1-мРНК могла активировать другие рецепторы врожденного иммунитета, помимо TLR4, поскольку ингибиторы TLR3 / 7/8 частично подавляли индуцированную C1-мРНК экспрессию воспалительного гена, а индуцированное C1-мРНК изменение уровней цитокинов в сыворотке не было полностью устранено в Tlr4 ^{— / —} мышей.Однако полное отсутствие противоопухолевой эффективности C1-мРНК на Tlr4 ^{— / —} мышей убедительно доказывает ключевую роль передачи сигнала TLR4 в индуцированном вакциной C1-мРНК противоопухолевом иммунитете. Активация TLR4 индуцирует как передачу сигналов NF-κB, так и передачу сигналов интерферона типа I, которые имеют решающее значение для функции презентации антигена ДК (28). Поскольку С1 индуцирует экспрессию как генов воспалительных цитокинов, так и генов интерферона I типа, необходимы дальнейшие исследования для определения того, какая нижестоящая передача сигналов TLR4 вносит вклад в эффективность вакцины С1-мРНК.

Хорошо задокументировано, что либо избыточный ответ интерферона типа I, либо провоспалительный цитокин, вызванный активацией TLR4, могут быть системно токсичными (4), в то время как вышеупомянутые циклические липиды или активация врожденного иммунитета, индуцированная С1-нановакциной, не проявляют очевидной токсичности. Точная причина в настоящее время неизвестна. Возможно, что циклические липиды или липид C1 являются мягкими агонистами этих рецепторов врожденного иммунитета и, таким образом, вызывают ответ, достаточный для активации дендритных клеток, не вызывая при этом системного воспаления.Монофосфорил липид А, адъювант вакцины, который в настоящее время проходит несколько клинических испытаний, представляет собой детоксифицированный компонент, экстрагируемый из ЛПС, и действует как более мягкий агонист TLR4 по сравнению с ЛПС (30). Мы действительно наблюдали более низкую величину индукции цитокинов с помощью C1-мРНК, чем у LPS, но необходима дальнейшая характеристика для определения основных механизмов.

Примечательно, что C1-мРНК демонстрирует самый высокий уровень экспрессии антигена по сравнению с уровнем экспрессии мРНК в комплексе с другими протестированными липидоподобными материалами, а эффективная экспрессия антигена, кодируемого мРНК, часто является предпосылкой для успешной вакцины против мРНК.Поскольку C1-мРНК также индуцировала активацию врожденного иммунитета, чтобы способствовать презентации антигена и активации Т-клеток, мы не смогли убедительно различить вклад эффективной трансляции мРНК и активации врожденного иммунитета в терапевтическую эффективность вакцины C1-мРНК. Основываясь на доступных данных, наиболее вероятно, что эффективная трансляция мРНК и активация врожденного иммунитета могут вносить вклад в терапевтическую эффективность C1-мРНК. Таким образом, относительный вклад этих двух факторов заслуживает дальнейшего изучения.

Таким образом, мы идентифицировали минималистичную мРНК-нановакцину на основе липидоподобного материала с собственной адъювантной активностью посредством передачи сигналов TLR4. Нановакцина C1 проявляла мощный противоопухолевый иммунитет при загрузке мРНК, кодирующей опухолевый антиген, без очевидной токсичности. Учитывая, что неоантигены от онкологических больных высоко персонализированы, нановакцина с C1-мРНК может стать универсальной платформой для подготовки персонализированной и эффективной вакцины для лечения рака. Дальнейшая оптимизация крупномасштабного производства наночастиц и мРНК, кодирующая предсказанные неоантигены от больных раком человека, должна быть протестирована для продвижения будущего клинического применения нановакцины C1-мРНК в иммунотерапии рака.

Материалы и методы

Подлинность данных этой статьи была подтверждена путем загрузки основных исходных данных на платформу Research Data Deposit (https://www.researchdata.org.cn/default.aspx) и проверена / одобрена. Комитетом по доступу к данным / этике онкологического центра Университета Сунь Ятсена с номером одобрения RDDB2021001065.

Культура клеток.

B16 и клетки HEK293 были получены из АТСС. Клеточная линия аденокарциномы толстой кишки мыши MC38 была любезно предоставлена ​​Xuanming Yang, Шанхайский университет Цзяотун, Шанхай, Китай.Сюаньминь Ян, Шанхайский университет Цзяотун, Шанхай, Китай. Клетки B16-OVA и MC38-OVA были сконструированы путем стабильной экспрессии кДНК овальбумина. DC2.4 представляет собой линию дендритных клеток мышей, любезно предоставленную Кеннетом Роком из Медицинской школы Массачусетского университета, Вустер, Массачусетс. Клетки гибридомы B3Z были любезно подарены Нилабом Шастри из Калифорнийского университета, Беркли, Калифорния. Клетки поддерживали в среде DMEM или RPMI 1640 (Thermo Fisher Scientific) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) (Gibco) и 1% антибиотика пенициллин-стрептомицин (Gibco).Культивирование клеток и все биологические эксперименты проводили при 37 ° C в условиях 5% CO ₂ в инкубаторе для культур клеток. Все клеточные линии были протестированы на отсутствие микоплазм.

Самок мышей в возрасте от шести до восьми недель (мышей C57BL / 6J, Tlr4 ^{— / —} или мышей STING cKO) использовали для выделения BMDC. Вкратце, бедренную и большеберцовую кости задних ног мышей собирали и клетки костного мозга промывали 1% -ным FBS-содержащим PBS с использованием шприца. Клетки ненадолго обрабатывали буфером для лизиса ACK для удаления эритроцитов, а затем ресуспендировали в среде RPMI1640 с 10% FBS, антибиотиками и β-меркаптоэтанолом (55 мкМ, Gibco).Клетки выращивали с добавкой рекомбинантного мышиного гранулоцитарного макрофаг-колониестимулирующего фактора (GM-CSF) (20 нг / мл, Peprotech) и IL-4 (20 нг / мл, Peprotech). Среду для культивирования клеток обновляли через день. Полусвязанные клетки собирали как незрелые BMDC на 6 день.

Материалы.

Катионный этилендиаминовый дендример PAMAM поколения 0 (G0), DSPE-PEG 2000 и кумарин6 были приобретены у Sigma-Aldrich. DiR-йодид [1,1′-диоктадецил-3,3,3 ‘, 3’-тетраметилиндотрикарбоцианин йодид] также был от Sigma-Aldrich.Липофектамин 2000 был приобретен у Invitrogen. LPS, ODN2088 (ингибитор TLR9) и контроль ODN2088 (ингибитор TLR7 / 8) были приобретены у Invivogen, Inc. Меченный флуоресцеином-12 UTP (F12-UTP), амилорид (ингибитор макропиноцитоза), цитохалазин D (ингибитор фагоцитоза), CU CPT 4a. (Ингибитор TLR3) и TAK-242 (ингибитор TLR4) были приобретены у Apexbio, Inc.

Мышей.

Самки мышей C57BL / 6J в возрасте от шести до восьми недель были приобретены в лаборатории Vital River (Пекин). Мыши OT-I и Tlr4 ^{— / —} мышей были из лаборатории Джексона. Sting ^{flox / flox} CD11c-CRE (обозначенные в тексте как STING cKO) мыши были от Shanghai Model Organisms, Inc. Все мыши содержались в определенных условиях, свободных от патогенов, и использовались в соответствии с руководящими принципами проведения экспериментов на животных. Вся работа с животными была одобрена Комитетом по уходу и использованию животных Университета Сунь Ятсена.

Синтез катионных липидоподобных материалов.

Катионные липидоподобные материалы были синтезированы из дендримера PAMAM G0 с использованием реакции раскрытия кольца путем взаимодействия с 1,2-эпокситетрадеканом в соответствии со следующими описанными процедурами.Сначала дендример PAMAM G0 был смешан с 1,2-алкиленоксидом разной длины сегмента (включая 1,2-эпоксигексан, 1,2-эпоксиоктан, 1,2-эпоксидодекан, 1,2-эпокситетрадекан и 1,2-эпоксигексадекан1. ) при различных молярных соотношениях 1: 5, 1: 7 и 1: 9. Затем в смесь в круглодонной колбе добавляли 10 мл метанола. Реакцию раскрытия кольца устанавливали при 90 ° C на масляной бане в течение 48 часов. Наконец, неочищенные смеси разделяли пропариванием, чтобы после реакции получить маслянистую смесь. Было получено пятнадцать различных типов липидоподобных материалов, которые сгруппированы как A1-A3, B1-B3, C1-C3, D1-D3 и E1-E3.

Получение модифицированной мРНК. Были сконструированы

плазмидных векторов, включая pcDNA3.1-SIINFEKL (OVA _257–264 ) и pcDNA3.1-VYDFFVWL (Trp2 _180–188 ). Мы также модифицировали различные сайты мРНК, включая модификацию 5′-конца и 3′-конец поли (A) хвоста в соответствии с предыдущими сообщениями (31, 32). Вкратце, для усиления транскрипции in vitro добавляли различные линкерные последовательности и сигнальные пептиды для связывания эпитопов. Модификация 3′-конца включает поли (А) хвост длиной 100 п.о. и два последовательных фрагмента (2 × β-глобиновый UTR) перед поли (А) хвостом.3′-β-глобиновый UTR был амплифицирован из 3′-β-глобинового UTR смысла, 5′-tta ctc gag agc tcg ctt tct tgc tgt cca att tct-3 ‘, 3′ β-глобин UTR антисмысловой, 5’-tta gtc gac gca gca atg aaa ata aat gtt ttt tat tag gca-3 ‘. Фрагменты синтетической ДНК, соединенные неиммуногенными линкерами глицина / серина (стартовый линкер: GGSGGGGSGG и концевой линкер: GGSLGGGGSG), клонировали в исходный вектор, содержащий MITD-домены (MITD, IVGIVAGLAVLAVVVIGAVVATVMCRRKSSGGKGDSA для путей класса II и II).Кроме того, был амплифицирован сигнальный пептид длиной 78 п.н., полученный из молекулы MHC класса I (Sec) (праймеры: Sec sense, 5’-aag ctt agc ggc cgc acc atg cgg gtc acg gcg ccc cga acc-3 ‘; Sec антисмысловой, 5′-ctg cag gga gcc ggc cca ggt ctc ggt cag-3’) и вставлен перед последовательностью антигенного пептида.

In vitro транскрипцию мРНК (IVT) выполняли с помощью набора мРНК HiScribe T7 ARCA (с хвостовой частью) (NEB). Плазмидный вектор линеаризовали ферментом BsmBI и очищали, а транскрипцию мРНК in vitro проводили в соответствии с инструкциями производителя.F12-мРНК синтезировали добавлением 20% F12-UTP в смесь 2 × ARCA / NTP при проведении реакций IVT.

Получение и характеристика нановакцины на основе липидоподобного материала.

Метод самосборки был использован для получения инкапсулированных в мРНК полимер-липидоподобных наночастиц материала. Вкратце, липидоподобные материалы и DSPE-PEG 2000 растворяли отдельно в диметилсульфоксиде при концентрациях 1 мг / мл и 2 мг / мл соответственно. Сначала липидоподобный материал и синтезированная мРНК, кодирующая эпитоп, в водном растворе смешивали в небольшом стеклянном флаконе в весовом соотношении 160: 1 с образованием комплексов катионный липидоподобный материал-мРНК.Затем добавляли DSPE-PEG 2000 с последующим перемешиванием на вортексе. Весовое отношение липидоподобного материала к DSPE-PEG 2000 составляло 5: 1. Затем смесь медленно закапывали в соответствующий объем стерильной воды при вихревом перемешивании. При нанопреципитации наночастицы образовывались мгновенно в течение 10 мин, стоя при комнатной температуре. Затем наночастицы промывали стерильной водой с использованием ультрацентробежных фильтров Amicon (отсечка по молекулярной массе, 100 кДа; Millipore) для удаления органического растворителя и свободных соединений и, наконец, концентрировали в подходящем объеме воды.Наночастицы были свежеприготовленными для экспериментов in vitro и in vivo. Наночастицы, полученные из липидоподобного материала С1, антиген-кодирующей мРНК и DSPE-PEG 2000, были названы С1-мРНК нановакциной. В некоторых экспериментах кумарин6 использовался для мечения C1-мРНК нановакцины. Весовое отношение кумарина6 к С1 составляло 1: 100, и продукт был назван С1-мРНК-кумарин6.

Размер частиц и дзета-потенциал комплекса C1-мРНК нановакцины были охарактеризованы динамическим светорассеянием (DLS) с использованием Zetasizer NanoZS90 (Malvern Instruments) при комнатной температуре.Морфологию и форму комплекса C1-мРНК нановакцины наблюдали с помощью ТЕМ JEM-14000PLUS (JEOL Ltd, Япония). Фосфорновольфрамовая кислота (1%) использовалась для отрицательного окрашивания комплекса нановакцины для усиления электронного контраста.

Анализ презентации антигена in vitro.

Анализ презентации антигена in vitro проводили в соответствии со следующим протоколом. Клетки DC2.4 или зрелые BMDC от мышей WT, Tlr4 ^{— / —} мышей или Sting ^{flox / flox} CD11c-CRE (обозначенных в тексте как STING cKO) мышей высевали в 24-луночные мыши. плоскодонные культуральные планшеты с плотностью 2 × 10 ⁵ клеток / лунку и культивировали в течение 12 ч при 37 ° C.Каждую лунку промывали один раз PBS, а затем клетки обрабатывали растворимым пептидом OVA _257–264 (SIINFEKL), мРНК липфектамина 2000, кодирующей OVA _257–264 , мРНК липидоподобного материала, кодирующей OVA _257–264. в указанное время. Концентрация мРНК и липидов составляла 120 нг / мл и 19,2 мкг / мл соответственно. Затем клетки сокультивировали с 1 × 10 ⁶ клеток B3Z или клеток OT-I, выделенных от мышей OT-I, в течение 16 ч при 37 ° C. Активацию стимулированных клеток B3Z или OT-I детектировали путем определения концентрации IL-2 в культуральном супернатанте с использованием набора ELISA для мышиного IL-2 (eBioscience).

Для измерения активности lacZ Т-клетки B3Z в планшете для культивирования клеток лизировали 50 мкл буфера для лизиса LacZ и размораживали при замораживании с последующим добавлением 50 мкл PBS, содержащего 0,5% бычьего сывороточного альбумина и 100 мкл раствора субстрата (1 мг / мл. хлорфенолового красного β-D-галактопиранозида), растворенного в буфере для β-галактозидазы. Планшет инкубировали при 37 ° C в течение 5-10 ч, пока цвет не достигал надлежащего уровня, после чего считывали интенсивность цвета при 590 нм с помощью считывающего устройства для микротитровальных планшетов.

Трансфекция дендритных клеток in vitro с помощью C1-мРНК.

высевали в чашки (чашки со стеклянным дном 35 мм и микролунками 10 мм, Corning) при плотности 5 × 10 ⁴ клеток / лунку и культивировали в течение ночи. Клетки трансфицировали F12-мРНК различными векторами доставки. Экспериментальные группы включали группу мРНК F12 (только мРНК F12), группу мРНК Lip2000-F12 (мРНК Lipfectamine 2000-F12) и группу мРНК C1-F12. Lip2000 использовали в качестве стандартного реагента для трансфекции (согласно протоколу производителя). Затем клетки инкубировали в течение 6 ч с последующей промывкой PBS и фиксировали 4% параформальдегидом в течение 30 мин при комнатной температуре.Затем клетки дважды промывали PBS и повышали проницаемость путем инкубации в 0,2% Triton X-100 в PBS в течение 10 мин. Наконец, клетки дважды промывали PBS, контрастировали с помощью 500 нм DAPI (Cell Signaling Technology) и анализировали с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (LSM880, Zeiss).

ПЦР в реальном времени.

Общую клеточную РНК выделяли с использованием TRIzol (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя. РНК подвергали обратной транскрипции с использованием набора реагентов Primer Script RT Reagent Kit с геномным стиранием ДНК (Takara).ПЦР в реальном времени выполняли с использованием набора SYBR Premix (Genstar) и анализировали с помощью системы обнаружения Bio-Rad. Экспрессию отдельных генов рассчитывали с использованием метода ΔΔCT и нормализовали по экспрессии актина. Последовательности праймеров для генов мыши показаны в приложении SI , таблица S1.

ELISA.

Цитокины (IL-1β, IL-2, IL-6, IL-12P70 и IFN-γ), высвобождаемые из клеток B3Z, клеток DC2.4, BMDC или клеток OT-I в супернатантах клеток, определялись индивидуальным цитокином. Наборы для ИФА в соответствии с инструкциями производителя (eBioscience).

Биораспределение мРНК нановакцины у мышей.

Нановакцина с C1-мРНК, включая DiR (флуоресцентная лампа в ближнем инфракрасном диапазоне) (C1-мРНК-DiR), была использована для анализа биораспределения. Весовое отношение DiR к липидоподобному материалу С1 составляло 1: 100. Мышам вводили однократную инъекцию C1-мРНК-DiR подкожно в правую паховую область в дозе 10 мкг мРНК на мышь. Через 24 часа их органы собирали и отображали с помощью системы визуализации IVIS Lumina III (Perkin-Elmer) для анализа биораспределения.Длина волны возбуждения и длина волны излучения DiR составляли 750 и 780 нм соответственно.

Иммунизация in vivo и анализ проточной цитометрии.

Селезенки и дренирующие лимфатические узлы вакцинированных мышей собирали на 7 день после двух вакцинаций из контрольной группы инъекцией PBS, пептидом OVA плюс квасцы (Sigma, OVA _257–264 , SIINFEKL, # 7951, 200 мкг / мышь; Imject Alum Adjuvant, # 77162), и группу мРНК C1-OVA нановакцины. Для приготовления адъюванта квасцов к раствору пептида OVA по каплям при постоянном перемешивании добавляли квасцы, так что конечное объемное отношение квасцов к раствору пептида OVA составляло 1: 2.После вакцинации селезенки и лимфатические узлы были изолированы и приготовлены в виде одноклеточной суспензии, и клетки стимулировали пептидом OVA (SIINFEKL, 1 мкг / мл) в течение 24 часов. Клетки инкубировали с PE-конъюгатами тетрамера MHC, специфичного для CD8 T-клеток, распознающих OVA-эпитоп SIINFEKL (MBL International, клон: TS-5001-1C, разведенный 1: 100 в буфере для сортировки активирующих флуоресценцию клеток [FACS]) в течение 30 мин при комнатная температура. Затем клетки инкубировали с CD3e-eFlour450 (eBioscience, клон: 145-2C11, разведенный 1: 100 в буфере FACS) и изотиоцианатом CD8a-флуоресцеина (eBioscience, клон: 53-6.7, разбавленный 1: 100 в буфере FACS) в течение 20 мин при комнатной температуре. Клетки промывали буфером FACS и данные собирали на BD LSR Fortessa X-20 с последующим анализом с использованием программного обеспечения FlowJo версии 7.6.

Статистический анализ.

Статистическую значимость определяли с использованием независимого двустороннего критерия Стьюдента t или двустороннего дисперсионного анализа ANOVA, и P <0,05 считали статистически значимым. Данные анализировали с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 7.

Доступность данных.

Все данные исследования включены в статью SI и / или Приложение .

Благодарности

Мы благодарим доктора Сируттун Шарвеш Радж за редактирование языка. Эта работа была поддержана грантами Национальной программы ключевых исследований и разработок Китая (2017YFC0
0 / 2017YFC0
3), Национального фонда естественных наук Китая (гранты 81773051, 81803005 и 51973243), Программы исследовательской группы по инновациям и предпринимательству провинции Гуандун (2016ZT06S638) и Национальный крупный проект науки и технологий Министерства науки и технологий Китая (2018ZX10301402).

Сноски

• Авторский вклад: J.